Лекционный курс по частной вирусологии вирусы вызывающие болезни жвачных и однокопытных для студентов факультета ветеринарной медицины
|
|
Скачать 1.85 Mb.
|
ДИАГНОСТИКАДиагноз на лейкоз ставят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков, патанатомических изменений и результатов лабораторных исследований, которые включают гематологические и гистологические, а также серологические исследования. Все формы лейкоза характеризуются увеличением в различной степени лимфоузлов. При лимфолейкозе они увеличены равномерно, не сращены с окружающими тканями, капсула снимается легко, на разрезе узлы серо-белого цвета, сочные и саловидные. Лимфоузлы при лимфогранулематозе, лимфосаркоме и гистиоцитарной саркоме бугристые, капсула сращена с паренхимой, на разрезе часто обнаруживают кровоизлияния и некрозы, в органах брюшной, тазовой полостей, на серозных оболочках отмечают опухолевые разрастания узлов в виде конгломератов серо-белого, желто-серого цвета. Селезенка при лимфоидном, слабодифференцированном и миелоидном лейкозах увеличена. При первых 2-х формах она буро-красного цвета с четко выраженной красной и белой пульпой за счет гиперплазии фолликулов. В более поздней стадии болезни граница между белой и красной пульпой стерта. При миелоидном лейкозе селезенка красно-малинового цвета, фолликулы плохо заметны, а в отдельных участках отсутствуют, ткань рыхлой консистенции с кровоизлияниями. При лимфоретикулосаркоме селезенка не увеличена. При всех формах лейкоза отмечают очаговые или диффузные разрастания серо-белого или серо-розового цвета в печени, почках, толще сердечной мышцы, органах пищеварения, матке, скелетных мышцах, диафрагме и др органах. ^ . Для гематологического исследования кровь берут из яремной вены в пробирки с антикоагудянтом - 10 %-ном р-ром динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, трилон В) из расчета 0,02 мл р-ра на 1 мл крови. Не разрешается брать кровь от животных за 15 дней до отела и 15 дней после него. Для серологического исследования кровь берут от животных в возрасте 6 мес. и старше В лабораторию в термосе со льдом направляют 5-6 мл сыворотки Для гисто- исследования кусочки пораженных органов (селезенки, лимфоузлов, грудной кости, печени, почек, легких, сердца и правого ушка сердечной мышцы, стенки сычуга, матки и скелетных мышц) посылают в свежем виде в термосе со льдом или в 10%-ном р-ре формалина. ^ Для определения вируса в различных материалах используют методы, позволяющие выявлять инфекционный вирус или вирусные АГ. Являясь типичным ретровирусом, ВЛКРС находится у инфицированных животных в форме провирусной ДНК, которую можно выявить в лимфоцитах крови с помощью ПЦР или методами гибридизации нуклеиновых кислот При культивировании инфицированных клеток вирус можно выявить с помощью электронного микроскопа или по образованию синцития в соответствующих индикаторных культурах. ^ . Позволяет выявлять вирусные частицы в краткосрочных культурах лейкоцитов крови животных, инфицированных ВЛКРС, и в монослойных культурах клеток, сокультивированных с инфицированными лимфоцитами. По некоторым данным, лейкоцитарные культуры (лейкоциты крови больных коров) через 48-72 ч представлены разнообразными клетками, среди которых находили лимфоциты и лимфобласты, продуцирующие вирусные частицы типа С. Зрелые вирионы имели ультраструктуру, типичную для онковируса типа С. Вирусные частицы находили, в основном, в межклеточных пространствах и на внешней мембране лимфоидных клеток. Методом ЭМ у больных лейкозом животных обнаруживают в лимфоцитах ядерные "карманы" в виде неправильного кольца и петли. Как правило, они обладают связью с оболочкой ядра и содержат цитоплазматическое вещество клетки. Иногда центральная часть их заполнена электроннолотными гранулами диаметром 4 нм, расположенными группами и напоминающими гранулы гликогена. Ядерные "карманы" отсутствуют в дифференцированных гранулоцитах, моноцитах и плазматических клетках, в одном лимфоците их обнаруживают 1-5 и более. ^ . ТСО применяется для выявления инфекционного вируса в различных материалах и основан на способности ВЛКРС образовывать синцитии в некоторых нетрансформированных монослойных культурах клеток и в трансформированных перевиваемых культурах клеток СС81. Метод предложен для титрования ВЛКРС с использованием кошачьей линии клеток S+L Показано, что инокуляция клеток вирусом лейкемии КРС приводит к образованию крупных многоядерных синцитиев, которые выявляются при окрашивании монослоя. Метод можно использовать для титрования вируса, так как имеется прямо пропорциональная зависимость между уменьшением количества синцитиев и разведением вирусной суспензии. Метод является воспроизводимым, специфическим и чувствительным. Рекомендуют микромодификацию метода количественной титрации инфекционного ВЛКРС, основанную на определении количества синцитиев в культуре эмбриональных клеток теленка, культивированной с лимфоцитами, зараженньми вирусами лейкемии КРС, или в присутствии вируса. Отмечена линейная зависимость между числом инокулированных в культуре клеток зараженных вирусом лейкоцитов и количеством индуцированных синцитиев. При сравнении чувствительности макро- и микрометода титрации число синцитиев в микрокультуре статистически не отличалось от числа синцитиев, индуцированных в макрокультуре. Метод сокультивирования используется для выявления инфекционного ВЛКРС Суть его состоит в сокультивировании лимфоцитов крови и чувствительных клеток монослойной культуры с последующим выявлением АГ ВЛКРС с помощью ТСО, РИД или ИФА. РДП (РИД). Это чувствительный тест для выявления гликолротеина ВЛКРС Позволяет выявлять гликопротеин вируса в концентрации 0,4 мкг/мл. Биопроба. Инфицированных животных можно выявлять путем постановки биопробы на овцах. С этой целью овцам обычно внутрибрюшинно вводят цельную кровь испытуемого животного. При наличии в пробе крови вируса у овцы развивается инфекция, сопровождающаяся образованием вирусспецифических AT. AT у зараженных овец выявляют в РДП с гликопротеинным АГ через 3-6 нед. ^ . Хронический лимфоидный лейкоз КРС характеризуется слабой реакцией бласттрансформации (РБТЛ). Поэтому у животных, подозрительных по заболеванию лейкозом по показателям лейкоцитов крови, проводят РБТЛ в культуре лимфоцитов крови Показатель РБТЛ выражает процент трансформировавшихся лимфоцитов (переходные клетки, бласты, митозы) и определяется после подсчета не менее 1000 клеток культуры У клинически здоровых и с нормальной гемограммой коров, по данным большинства исследователей, он составляет в среднем 60% (40-90%), у больных лимфолейкозом РБТЛ значительно снижена уже в субклинической стадии При повышенном содержании в крови общего количества лейкоцитов исследуют животных в РБТЛ Диагноз на лимфолей-коз считают подтвержденным при показателе РБТЛ не выше 35%. Если он выше, то постановку реакции повторяют с интервалом 3 мес. у тех животных, у которых нарастают гематологические изменения. ^ Срезы готовят и окрашивают гематоксилин-эозином. При лимфоидном лейкозе наблюдают в селезенке и лимфоузлах стирание рисунка за счет диффузной инфильтрации клеток лимфоидного ряда, среди которых, в основном выявляют зрелые лимфоциты, в меньшем количестве обнаруживают пролимфоциты, лимфобласты. В костном мозге строма сохранена, выявляется значительное истончение и рассасывание балок, скопления лимфоцитов могут располагаться в виде очагов или диффузно, заполняя все костно-мозговые пространства (лимфоидная метаплазия), в почках, печени, сердце, сычуге и других органах обычно выявляют скопления лимфоцитов в просветах капилляров и инфильтрации лимфоидными клетками интерстициальной ткани. При недифференцированном и слабо дифференцированном лейкозе (гемо-цитоблазтоз) в костном мозге, селезенке, лимфоузлах и других органах наблюдают очаговые и диффузные пролифераты, клеточный состав которых представлен недифференцированными или слабо дифференцированными клетками типа гемоцитобластов (родоначальная клетка). ^ . Основан на обнаружении в периферической крови повышенного количества лейкоцитов, в основном лимфоидного ряда, и слабодифференцированных клеток (родоначальных, пролимфоцитов, лимфобластов). Количество лейкоцитов подсчитывают с помощью электронного счетчика частиц или в камере Горяева и выводят лейкоцитарную формулу. Животных, подозрительных по заболеванию лейкозом, подвергают дополнительньм гематологическим исследованиям с интервалом 2-3 мес. до получения 2-х подряд качественно одинаковых результатов, по которым их признают здоровыми или больными лейкозом. Следует иметь в виду, что некоторые острые и хронические болезни КРС (перикардиты, ретикулиты, гепатохолангиты, циррроз печени, туберкулез, бруцеллез и др. ) могут сопровождаться лейкоцитозом. При этом в отличие от лейкоза увеличение количества лейкоцитов крови происходит, в основоном, за счет найтрофилов, эозинофилов или моноцитов. ^
Эти изменения крови имеют временный характер, их дифференцируют от лейкоза повторными гематологи-м исследованиями. Есть методика выделения мононуклеарных клеток из периферической крови инфицированного КРС и их культивирования репродукции инфекционного вируса лейкоза. Метод позволяет получать максимальный с инфицированных вирусом лейкоза лимфоцитов. Из 10 мл цельной крови получают примерно 107 мононуклеарных клеток. Чтобы максимизировать продукцию вирионов и вирус) АГ, к культуре лимфоцитов добавляют Кон-А в конечной концентрации 5 мг/мл. ^ Наиболее чувствительный метод выявления р24-АГ в краткосрочных культурах лимфоцитов крови инфицированных животных. Метод заключается в том, что экстракт, приготовленный из 48-ч культуры лимфоцитов крови, исследуется на присутствие АГ р24 путем определения его способности предотвращать связывание меченого изотопом р24 со специфическими AT. Для диагностики инфекции ВЛКРС у телят младше 6-мес. возраста, которым выпаивали молозиво инфицированных матерей, а также у взрослых животных, иммунизированных убитым вирусом или вирусными АГ, необходимо использовать методы, основанные на прямом выявлении инфекционного вируса или вирусных АГ в культурах лимфоцитов крови исследуемых животных. ПЦР. Дает возможность обнаруживать провирусную ДНК через 2 нед после заражения животных. Для амплификации в ПЦР использовали пары праймеров, соответствующих определенным участкам генов gog 24, env-gp5 или pol вируса лейкоза Метод позволяет идентифицировать одну копию генома вируса лейкоза на 100000 клеток крови. Сконцентрированные также праймеры для амплификации специфических для вируса лейкоза КРС последовательностей генов pol и рХ. С помощью этого набора праймеров удавалось амплифицировать и выявлять 10 копий ДНК вируса в присутствии в образце 1 мкг хромосомной ДНК. Доказана возможность использования нерадиоактивных зондов для выявления вируса лейкоза КРС в лимфоцитах периферической крови и клетках лимфосаркомы. Разработан метод ПЦР с последующей нерадиоактивной блот-гибридизацией для тестирования провируса лейкоза КРС в исследуемом материале. ^ ИФ. Используют прямой и непрямой варианты при исследовании мазков крови и измененных органов, краткосрочных и перевиваемых культур крови и тканей. Непрямой вариант испытывали на концентрате с 80% живых лейкоцитов. В качестве AT применяли сыворотку больной лейкозом коровы и меченную ФИТЦ кроличью сыворотку против глобулинов быка. При микроскопии препаратов отмечена флюоресценция на поверхности лимфоцитов в виде яркого светящегося кольца или кольца из пунктиров. В препаратах из лейкоцитов здоровых животных подобного свечения не наблюдается или оно слабо выражено в некоторых клетках Для объективной оценки препаратов рассчитывается индекс флюоресценции (ИФ) по формуле ИФ = (А - В) : А, где А - процент несветящихся клеток в контроле; В - процент несветящихся клеток в опыте. Положительной считается реакция, если ИФ свыше 0,2 ; сомнительной - 0,11-0,2; отрицательной - ниже 0,1. ^ . У животных, зараженных ВЛ КРС, вырабатываются AT к вирусным АГ, которые выявляются с помощью серологических реакции. Характерной особенностью инфекции ВЛКРС у КРС является, как правило, пожизненная персистенция вируса и вирусспецифических AT у больного животного. Поэтому серологические методы обнаружения специфических сывороточных AT являются наиболее практичными, экономичными и широко используемыми в диагностике онковирусной инфекции у КРС. Серологическими методами ВЛКРС можно выявлять у животных старше 6 нес, так как у телят, выпаиваемых молозивом и молоком инфицированных ВЛКРС матерей, появляются пассивно приобретенные материнские AT, которые могут персистировать до 6-мес. возраста. У зараженных животных в крови циркулируют AT к нескольким структурньм белкам вируса. Однако диагностическое значение имеют AT против gp51 и р24 ВБЛ. Количественные соотношения AT анти-р24 и анти-gр51 могут коррелировать со стадией инфекционного процесса, но при этом, AT к gp51 появляются раньше и содержатся в более высоком титре, чем антитела к р24 и, следовательно, серологические реакции, направленные на выявление aimi-gp51 - AT по со чувствительности будут превосходить аналоги, в которых используется в качестве АГ р24. В научно-исследовательских лабораториях для обнаружения специфических AT используются РН, подавления раннего и позднего поликариоцитоза, нейтрализации псевдотипов и радиоиммуноанализ (РИА). Для эпизоотологического обследования, контроля и борьбы с ВБЛ-инфекцией широко применяют РИД и ИФА, для постановки которых выпускаются соответствующие коммерческие диагностические наборы. Все вышеперечисленные методы предназначены для выявления AT в индивидуальных пробах сыворотки. Для обнаружения AT в низких титрах, например, в индивидуальных пробах молока или в сывороточных пулах, иди в образцах, полученных из молочного танка, требуется высокая чувствительность РИА или ИФА. Разработан ряд серологических реакций для диагностики инфекции, таких как РИФ, РСК, РДП в геле, реакция агглютинации латекса (РАЛ), ELISA, РНГА и реакция нейтрализации псевдотипа (РНПТ). РДП. Благодаря простоте, специфичности и достаточно высокой эффективности эта реакция получила наибольшее применение с гликопротеинным АГ ВЛКРС. Из вируса, осажденного методом ультрацентрифугирования культуральной жидкости краткосрочных культур лейкоцитов лейкозных животных, очищенного в градиенте плотности сахарозы и обработанного эфиром, получают АГ, который используют в РДП. С помощью этого АГ в сыворотках крови инфицированных ВЛКРС животных выявляют ПА к внутреннему полипептиду вируса р24. РДП с гликопротеидным AT - более чувствительный метод выявления инфицированных ВЛКРС животных, чем РДП с полипептидным АГ РДП (РИД) в геле агара, направленная на выявление анти-gр51 AT, используется в качестве основного диагностического теста, регламентирующего международную и внутреннюю торговлю племенными животными, спермой и эмбрионами. При первичном обследовании сывороток крови одной РИД считается достаточно для объявления стада свободным от ВБЛ-инфекции. РИД применяется в системе противолейкозных мероприятий в неблагополучных хозяйствах. Специфические ПА к ВЛКРС появляются через 2 мес. после инфицирования и сохраняются пожизненно. Для постановки РДП используют диагностический набор, в состав которого обязательно должны входить специфический АГ ВЛКРС, специфическая положительная сыворотка крови КРС Реакцию ставят макро- и микрометодами. Для изготовления АГ используют клеточную линию FLK-BLV. Из культуральной жидкости вирусный АГ выделяют методом преципитации сульфатом аммония или полиэтиленгликолем. Но наиболее технологичным методом выделения вирусного АГ считают ультрафильтрацию на полупроницаемых мембранах. На результат реакции иммунодиффузии влияют многие факторы качество АГ и контрольных сывороток, количественные соотношения АГ и AT, качество агаpa, pH и ионная сила буфера, температура, диаметр лунок и расстояние между ними. Для постановки РИД выпускают диагностические наборы. Они представляют собой наборы, состоящие из 2-8 препаратов. Обязательными компонентами каждого набора являются препараты тест-системы: вирусный АГ и антисыворотка, которые в результате специфического взаимодействия АГ (gp51 ВБЛ) и AT в процессе диффузии формируют в геле агара нерастворимый комплекс в виде опалесцирующей полосы. Дополнительно наборы могут комплектоваться сухой солевой смесью агара, стерильным разбавителем для вирусного АГ и контрольньми сыворотками, которые поставляются в жидком или лиофилизированном виде. В последнем случае наборы комплектуют соответствующими разбавителями контрольных сывороток. Наборы рассчитаны на 90-500 исследований и содержат 3-5 мл вирусного АГ. РИД проходит в 0,8-1,0% геле агара, который готовят на трис-НС! или боратном буферах в диапазоне pH 7,2-8,6, содержащим 8-8,5% NaCl. Методика постановки реакции одинаковая для всех диагностикумов и предусматривает заполнение лунок АГ, антисывороткой и испытуемыми сыворотками по схеме 1:2:4 или 1:3:3. Принято 2 стандарта на диаметр лунок и расстояние между ними: 1 вариант в странах ЕЭС, тогда как в США, Канаде и странах СНГ приняты параметры, соответствующие второму варианту. ^
Минимальные необходимые требования, которым должен удовлетворять диагностический набор, заключаются в следующем: АГ должен содержать оболочечный гликопротеин ВБЛ, стандартизованный по референтной сыворотке -1; референтная сыворотка Е-4, разведенная отрицательной сывороткой в соотношении 1:10, должна быть выявлена как положительная без повторной постановки реакции или предварительной концентрации. Референтные сыворотки Е-1 и Е-4 изготовлены в Национальной ветеринарной лаборатории Дании (P.O. Box 373, DK-1503 Copengagen) и предназначены для стандартизации всех диагностических наборов для постановки РИД и ИФА. Реакцию учитывают через 48 ч и при следующих показаниях контролей: наличие четкой контрольной полосы преципитации между АГ и специфической положительной сывороткой и отсутствие таковой с отрицательной контрольной сывороткой. Животных, сыворотки которых положительно прореагировали в РДП, считают зараженными ВЛКРС. Описаны модификация метода иммунодиффузии - усиленная танином непрямая двойная иммунодифузия в геле (НИД-Р) и её применение для выявления AT и АГ ВЛКРС. Современная диагностика энзоотического лейкоза КРС основана большей частью на тестах иммунодифузии и ELISA. При использовании РИД необходимо придерживаться рекомендаций производителя очень дорогого АГ. В целях снижения затрат при сохранении надежности результатов исследователи уменьшили размер отверстий в розетке и слой агара в чашке Петри, сохраняя прежнюю чувствительность теста. Предложен метод очистки вируса лейкоза КРС в градиенте плотности перколла. Метод рекомендован для получения очищенного вируса и специфического АГ. Показано значительное преимущество РИД при исследовании молозива титр AT был в 8-32 раза выше, чем в пробах сыворотки крови, исследовать необходимо первые порции молозива. Титр AT к gp51 и р24 ВЛ КРС сразу после отела был наивысшим – 1:2187- 1:59049 в ИФА и 116-1 512 в РДП. Через 1 сут. титр AT составлял 25% от исходного. РАЛ. В качестве теста для прижизненной диагностики лейкоза КРС можно использовать иммунохимическую реакцию агглютинации с латексом в соответствии с временными методическими рекомендациями Животные, сыворотки крови которых дали положительную реакцию агглютинации с латексом, подлежат тщательному обследованию на лейкоз другими методами. Реакция перспективна для прижизненной диагностики лейкозов Испытание показало в 67% случаев совпадение результатов с гематологическими и около 90% с гистологическими методами диагностики гемобластозов КРС. ИФ. Менее широко применяют для обнаружения AT в сыворотках крови инфицированных животных. При этом используют в качестве клеток-мишеней перевиваемые культуры, хронически инфицированные ВЛКРС. РНГА. Является чувствительным методом обнаружения AT в сыворотке крови и молоке Рекомендуют использовать при экспертизе и санитарной оценке молока Наибольший процент совпадений гематологических показателей с результатами серологических исследований был отмечен в РНГА. ELISA. Широко применяют в США, Бельгии с использованием монАТ для широкомасштабного выявления энзоотического лейкоза в стадах КРС. Чувствительность его выше чем РДП. Метод ELISA при диагностике лейкоза КРС может существенно повысить чувствительность серодиагностики по сравнению с РДП Он удобен для систематического контроля молока коров благополучных хозяйств. Существующие варианты ИФА включают 5 принципиальных этапов постановки реакции. ^ . Разработан аллерген для диагностики лейкоза у животных. Для проведения аллергических реакций наиболее подходящее место хвостовая складка у овец и КРС и дорсальная поверхность уха у свиней. ^ . Лейкоз необходимо отличать от актиномикоза, туберкулеза, паратуберкулеза и бруцеллеза. При актиномикозе поражаются, главным образом, лимфоузлы головы и грудной области (подчелюстные, заглоточные, околоушные и др.). Они плотной консистенции, с инкапсулированными абсцессами. В центре актиномикозного ума (гранулемы) гистологически обнаруживают друзы гриба. При туберкулезе чаще пораженш в виде узелков, имеющих специфическое гистологическое строение, находятся в легких, кишечнике. Для паратуберкулеза характерно наличие изменений в кишечнике и брыжеечных лимфоузлах. В кишечнике развиваются продуктивное воспаление и очаговые инфильтраты из эпителиоидных клеток, в результате чего стенка утолщается в 5 и более раз. В лимфоузлах отмечают обширные скопления из эпителиоидных элементов с наличием среди им гистиоцитов и клеток типа Лангерганса. Специфическим методом окраски выявляют бактерии паратуберкулеза, локализующиеся в эпителиоидных и гигантских клетках. Бруцеллез диагностируют с помощью РСК, РА . ^ Проблема специфической профилактики лейкоза КРС не решена, хотя исследования в этой области продолжаются и по сегодняшний день. Против лейкоза КРС получена рекомбинантная вирусвакцина, содержащая генетическую информацию, кодирующую gp51 и gp30 поверхностного АГ. Также показана возможность вакцинации КРС против лейкоза гетерологичными клетками млекопитающих, способными продуцировать оболочечные АГ ВЛКРС и его внутренний белок р24. Опубликованы результаты исследований по получению и использованию рекомбинантных вирусов осповакцины, включающих либо полный ген белка оболочки (env), либо только фрагмент гена env с последовательностью, кодирующей гликопротеин gp51 env и часть gp30 ВЛКРС. Вакцинация овец рекомбинантными BLV-вакцинами, содержащими полный ген env, защищает овец от инфекции ВЛКРС, свидетельством чего служит отсутствие персистенции высоких титров анти-gp51-AT по сравнению с невакцинированными ВЛ инфицированными животными, ярковыраженная пролиферативная реакция клеток СД-4 вакцинированных овец на специфические синтетические пептиды gp51 ВЛКРС и отсутствие провируса ВЛКРС у вакцинированных животных спустя 4 мес. после заражения диким вирусом. ВЕТЕРИНАРНО – САНТИТАРНАЯ ОЦЕНКА ПРОДУКЦИИ. При поражении мышц, л/у туши, паренхиматозных органов или при выявлении лейкозных разрастаний на серозных покровах туши её независимо от упитанности и продукты убоя утилизируют. При отсутствии паталогиеских изменений направляют образцы на бактериологическое исследование на сальмонеллёз. В случае обнаружения сальмонелл внутренние органы утилизируют, а тушу направляют на проварку. При отсутствие сальмонелл разрешается перерабатывать на варёные, варёно –копчёные колбасы , консервы или проварку. ^ Anemia infectiosa eqvorum (лат.); Eqvine infectious anemia (англ.);Anemia infectiuse du cheval (франц.) Инфекционная анемия лошадей (ИНАН, болотная лихорадка) - вирусная болезнь однокопытных, характеризующаяся поражением кроветворных органов, преимущественно хроническим течением, рецидивирующей лихорадкой (в периоды обострения) и анемий. До начала ХХ в. ИНАН регистрировалась во многих странах Европы, а также в США, Японии, Индии в виде эпизоотических вспышек. Наиболее широкое распространение она получила в период мировой войны, сопровождаясь высокой смертностью (до 80%). В последнее время по данным МЭБ ИНАН встречается в США, Австралии, Японии, Индии, в Северной и Южной Африки, Европы. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям