Лекционный курс по частной вирусологии вирусы вызывающие болезни жвачных и однокопытных для студентов факультета ветеринарной медицины
|
|
Скачать 1.85 Mb.
|
ДИАГНОСТИКАИРТ диагностируют на основании клинико-эпизоотологических данных, патологоанатомических изменений в органах и тканях с обязательным подтверждением лабораторными методами. Латентную инфекцию устанавливают только лабораторными исследованиями. Лабораторная диагностика включает: 1) выделение вируса из патологического материала в культуре клеток и его идентификацию в РН или РИФ; 2) обнаружение АГ вируса ИРГ в патологическом материале с помощью РИФ; 3) выявление AT в сыворотке крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в РН или РИГА. Для лабораторной диагностики ИРТ используют набор диагностикумов ИРТ КРС. Диагностику ИРТ проводят параллельно с исследованием материала на ПГ-3, аденовирусную, PC-инфекции и ВД-БС. ^ на ИРТ КРС ставят на основании положительных результатов обнаружения АГ в патологическом материале РИФ с учетом эпизоотологических и клинических данных, а также патологических изменений. ^ ставят на основании совпадения результатов РИФ с выделением и идентификацией вируса; совпадение результатов РИФ с обнаружением AT в 30% и более вторых проб сывороток в титрах не ниже 1:2 в РН и 1:26 в РИГА и обнаружением 4-кратного и более увеличения титра AT в парных пробах сывороток. Предварительный диагноз ставят в вет лабораториях в течение 2-3 дн, окончательный - в течение 15-30 дн. Выделить вирус из носовой полости, влагалища и с конъюнктивы удается с 5-го по 10-й дн, а ВНА - с 5-8-го дня после заражения. Более высокий титр AT наблюдается после 35 дн, затем начинается медленное снижение. Для выделения вируса ИРТ из бразильской спермы использовали 2 линии перевиваемых клеток МДВК и метод непрямой ИФ (67). Установлено, что максимальное количество вируса выделяется во время подъема температуры тела на 4-7-й дн болезни и продолжался до 10-14 дн. ^ Обнаружение специфических телец-включений. В ядрах клеток эпителия пораженных слизистых оболочек носовой полости, вульвы, вагины и конъюнктивы находят специфические тельца-включения. Через 18-20 ч после заражения их можно обнаружить в клетках культуры, окрашенной гематоксилин-эозином. ^ . Вирус выделяют в культурах клеток почек телят, почек эмбрионов телят, тестикул бычков. В настоящее время для выделения вируса ИРТ используют 2 линии клеток МДВК. В этой линии клеток выделяли вирус из бразильской коммерческой спермы с признаками ЦПЭ и подтверждением методом прямой ИФ. ^ . Для обнаружения вируса ИРТ применен метод молекулярной гибридизации с использованием радиоактивно меченых ДНК-зондов. Однако более перспективным является применение нерадиоактивного метода детекции вирусной ДНК. Описаны выявленные последовательности BHV-1 гибридизацией in situ с помощью меченного биотином ДНК-зонда. Предложенный зонд также имел существенный недостаток, поскольку неспецифически связывался с ДНК вируса БА. Поэтому разработан нерадиоактивный метод детекции вируса ИРТ на основе высокочувствительного зонда, меченного биотином. Время тестирования биотинилированного зонда составляет около суток, что существенно меньше по сравнению с вирусологическим тестированием (до 40 дн). Наиболее важным представляется использование биотинилированного ДНК-зонда в случае выявления вируса в период карантинирования вновь завезенных животных, а также для обнаружения заболевания на ранних стадиях и диагностики латентной формы ИРТ для выявления возможного содержания вируса ИРТ в сперме быков. Разработана также ПЦР для обнаружения герпесвируса типа 1 КРС. ^ ИФ. Техника постановки её такая же, как и при диагностике аденовирусной инфекции КРС. Обращают внимание на свечение АГ в цитоплазме и перинуклеарной зоне неповрежденных клеток. Ярко-зеленая флюоресценция в виде гранул или диффузного свечения цитоплазмы не менее чем в 10% клеток позволяет оценить препарат как положительный. Предварительный диагноз ставят при наличии не менее 30% положительных препаратов от общего количества исследованных проб. В мазках из влагалища и конъюнктивы специфическую флюоресценцию отмечали через 24 ч, из препуция - через 48, из носа и трахеи - через 72 ч после заражения. Присутствие специфического АГ удается подтвердить заражением культуры клеток почки телят, в которой обнаруживается специфическая перинуклеарная и диффузная цитоплазматическая флюоресценция, свойственная ИРТ. Использование культуры клеток почки кролика позволяет освободиться от неспецифического свечения. Совпадаемость результатов ИФ и патологоанатомических изменений составляет 87%, а ИФ и вирусологических исследований - 44%. При параллельном исследовании сывороток в РН и РИГА результаты совпадали в 94% случаев. В полевых условиях РИФ оказалась положительной в 18,5%, а метод вирусовыделения - в 15,9% случаев. РИФ можно использовать для экспресс-диагностики ИРТ с последующим подтверждением диагноза вирусологическими методами. РН. При наличии ЦПД в культурах клеток, зараженных изолятом, и положительной ИФ проводят окончательное типирование вируса в РН, которую ставят общепринятым методом в первичной культуре ПЭК или перевиваемой линии клеток МДВК. Результаты РН учитывают по ЦПД вируса, для чего определяют титр типируемого изолята в присутствии специфической и отрицательной контрольной сывороток. Титр рассчитывают по методу Рида и Менча и выражают в ТЦДзо/мл. Затем вычисляют индекс нейтрализации. Видовую принадлежность изолята устанавливают при разности в титрах вируса не менее 2 lg; при разности от 1 до 2 реакцию считают сомнительной, в этом случае её повторяют; при разности нейтрализации менее 1 реакцию считают отрицательной. При положительных результатах РН изолят считают идентифицированным. РТГА. Ставят её микрометодом при 4°С с 0,5-1%-ной взвесью эритроцитов белых мышей, разбавитель - трис-буферный р-р с 0,2% БСА. В качестве АГ используют культуральную жидкость, которую концентрируют ПЭГ-6000 или ультрацентрифугированием. ELISA. Иммунопероксидазный метод можно использовать для исследования прижизненно взятых нозофарингиальных мазков-отпечатков в клетках, полученных из носовых смывов. Кроме того, для лабораторной идентификации вируса ИРГ рекомендован непрямой антикомплементарный иммунопероксидазный метод НАИП. При световой микроскопии он обеспечивает четкое выявление вирусного АГ в цитоплазме инфицированных клеток в виде окрашенных в коричневый цвет образований, которые видны при увеличении в 140 раз. Специфичность показателей, полученных этим методом, подтверждается постановкой специальных иммунологических контролей. При постановке перекрестной иммунопероксидазной реакции с гетерологичными АГ эта реакция имеет выраженный видоспецифический характер: АГ реагирует только с гомологичной сывороткой. Эндогенная пероксидаза в культуре клеток ПЭК и LF не выявляется. Таким образом, НАИП является перспективным при диагностике острых респираторных вирусных инфекций КРС. При использовании его для индикации вируса ИРТ в культуре клеток ПЭК АГ выявляется через 18-22 ч после заражения. Три прямых серологических метода быстрого обнаружения вирусных АГ (ИФ, ИФА и ELISA) одинаково применимы для обнаружения вируса во время лихорадки, но не на поздних стадиях болезни. ^ Иммунопероксидазный метод с использованием монАТ является более чувствительным и специфичным по сравнению с обычными методами выделения вируса. Помимо того, данный метод имеет преимущество в быстроте получения результатов. Быстрое подтверждение вируса ИРГ (инфекции) возможно методом культивирования его с последующим ИФА зараженной культуры с использованием монАТ. Проведена молекулярная характеристика южноамериканских изолятов герпес-вируса-1 (ИРГ) КРС с помощью монАТ и электрофореза в полиакриламидном геле с доде-цилсульфатом натрия. ^ . Описаны методы клонирования фрагментов генома вируса ИРТ, выделение и характеристика рекомбинантного ДНК-зонда, которые позволяют определять вирус в клинических пробах. С помощью метода дот-блот-гибридизации выявлена ДНК вируса ИРГ в пробах спермы, полученной от серопозитивных животных, когда выделение вируса в культуре клеток давало отрицательный результат. Хороший результат также получен при использовании инфицированных культур клеток. ^ AT к вирусу ИРТ можно обнаружить в сыворотках крови больных и переболевших животных в РН, РНГА и др. Для постановки ретроспективного диагноза используют парные пробы сывороток, взятые с интервалом в 3 нед. Результат серодиагностики учитывают по возрастанию титра AT в парных пробах сыворотки, а также числа серопозитивных животных через указанный интервал. РН. Ставят методом разведения испытуемых сывороток с постоянной дозой вируса в культуре клеток ПЭК или ТБ. Вирус предварительно титруют в культуре клеток. Зараженные и контрольные культуры инкубируют при 37°С, ежедневно учитывая ЦПД вируса, окончательный учет проводят на 5-7-е сут. Наибольшей чувствительностью обладает РН, основанная на 24-ч инкубации смеси вирус-сыворотка. Титром вируса считают обратную величину его наибольшего разведения, вызывающего ЦПД в 50% культур, который высчитывают по методу Рида и Менча, или Кербера и выражают в ТЦДзо/мл. Титры 1:32, 1.64 обнаруживаются редко. В неблагополучных по данной болезни стадах ВНА выявляются у 12% клинически здорового скота. Ретроспективный диагноз на ИРТ ставят при 4-кратном и более приросте AT в пробах сывороток реконвалесцентов. В настоящее время широко используют микрометод РН. РНГА. Биологическая промышленность нашей страны выпускает эритроцитарный диагностикум. РНГА ставят согласно методическим указаниям в микропанелях с U-образными лунками наборов микротитрования Такачи или Титертек по общепринятой методике. Результаты РНГА с используемыми сыворотками оценивают по титрам; положительные - 1:16 и выше, сомнительные - 1:8, отрицательные - 1:4, 1:2 и нулевые. Увеличение титров AT в парных сыворотках в 2-4 раза свидетельствует о наличии инфекции. Применяя РНГА, можно обнаружить AT в более ранний период инфекции, чем с помощью РН. Установлено соответствие результатов РНГА и РН в 95% случаев. Высокие титры чаще выявляли в РНГА. С её помощью быстрее, чем РН проводить тонирование AT к вирусу ИРТ. Титры AT были в 7-10 раз выше выявляемых в РН. РДП. Не нашла широкого применения в диагностической практике, хотя многие исследователи рекомендуют её использовать для серодиагностики ИРТ. Marchang (1982) считает, что диагностика по наличию ПА имеет ряд преимуществ по сравнению с РН: она проще и быстрее в постановке, чем РН. ПА обнаруживают вскоре после введения вируса в организм, но они быстро исчезают. По наличию ПА можно уловить недавно прошедшую инфекцию, в то время как ВНА длительно циркулируют в организме, и заболевание можно уловить только по парным сывороткам. При выявлении ПА лучше всего брать пробы крови на 8-й и последующие дни болезни. РТГА. Может использоваться для выявления и количественной оценки AT к вирусу ИРТ. Титр анти-ГА коррелирует с титром ВНА. Положительный результат РТГА уже в 1-ом разведении сыворотки (1:4) указывает на наличие AT к вирусу ИРГ в данной пробе сыворотки. 4-кратный и более прирост титров анти-ГА в парных пробах сыворотки является показателем активной инфекции. ELISA. Широко применяют в Нидерландах, США, Великобритании, Швеции, странах бывшего СССР. Он оказался пригодным для обнаружения AT к вирусу ИРТ в молоке. Для этого достаточно получения проб смешанного молока от 5-10 коров. AT определяют после предварительного концентрирования в них Ig. Совпадаемость данных серологических реакций в пробах сыворотки крови и молока составляла 92,8%. С помощью метода можно оперативно определять иммунологический статус поголовья лактирующих коров целого региона, а также проводить обследование экспортируемых и импортируемых животных. Предложен непрямой метод IgM-ELISA для определения недавней инфекции ИРТ. Ранние AT IgM выделены на 6-й да после заражения, к 9-му да происходил рост титра AT Ig, a к 13-му да - ВНА. У телят, привитых инактивированной вакциной, раннего иммунного ответа не происходило - AT IgM не выявлялись, a IgM и ВНА появлялись позже, чем после заражения. Однако при этом следует иметь в виду, что наличие в сыворотке КРС ревматоидного фактора может привести к ложноположительньш результатам диагностики в IgM-ELISA. В этом случае предварительная обработка проб сыворотки антибычьими IgM позволяет избежать ложноположительных результатов. Тест IgM-ELISA имеет большую ценность в диагностике ИРГ. В группе позитивных сывороточных проб корреляция между ELISA и РИГА составляла 98,3%, a ELISA с ИФ - 95,7% . ^ Основан на конкуренции между AT сыворотки крови КРС и нейтрализующими мышиными монАТ. Для его проведения лунки микротитрационных панелей обрабатывают очищенным вирусом ИРГ, и после высушивания их можно использовать немедленно или хранить при - 20°С. В обработанные вирусом лунки панелей последовательно вносят неразведенную испытуемую сыворотку, специфические к вирусу ИРГ монАТ, конъюгированные пероксидазой, субстрат пероксидазы. Результаты реакции учитывают в спектрофотометре при А405. В случае положительной реакции связывание монАТ ингибируется AT сыворотки крови. Метод оказался намного чувствительнее и специфичнее РН. ^ . Установлено, что при экспериментальном заражении наступает аллергизация организма, проявляющаяся положительной кожной аллергической реакцией уже на 7-й день после заражения, а при вакцинации живой вакциной это происходит через 2 нед после вакцинации, при естественном заражении (спонтанные аборты) аллергизация также наступает быстрее. В Болгарии и ФРГ применяют кожно-аллергическую реакцию для выявления переболевших и вакцинированных животных. С целью унификации методов дифференциальной диагностики болезней, проявляющихся с везикулярным синдромом, получены высокоактивные препараты для идентификации возбудителей ИРТ и ВД КРС. Использование этих праймеров при вирусологической экспертизе патологических материалов оказалось особенно полезным при смешанном течении ящура и указанных болезней. Применение ранее разработанных для диагностики ящура методов изготовления специфических АГ и антительных препаратов дает возможность изготовления аналогичных по качеству диагностикумов при идентификации вирусов ИРТ и ВД и унификации для схемы дифференциальной диагностики основных болезней, протекающих с везикулярным синдромом. ^ Переболевание сопровождается стойким и длительным иммунитетом, который может передаваться потомству с AT молозива. Иммунитет у переболевших животных длится не менее 1,5-2 лет, однако у животных-реконвалесцентов, имеющих AT, состояние абсолютной иммунности бывает редко, и их следует рассматривать как потенциальный источник инфи-цирования других животных. Даже выраженный гуморальный иммунитет не предотвращает персистенции вируса. В случае реинфекции вновь происходит размножение и выделение вируса, хотя болезнь протекает без видимых клинических признаков. При возникновении повторного заболевания трудно бывает отличить реинфекцию от реактивации персистирующего вируса. Поэтому всех животных, имеющих AT к ИРТ, следует считать носителями вируса, находящегося в состоянии латенции. Слизистые оболочки респираторного и генитального трактов больных животных продуцируют IgA и интерферон. AT в сочетании с комплементом ограничивают, но не исключают распространения вируса ИРТ в организме. В подавлении инфекции клеточный иммунитет при ИРТ более эффективный, чем гуморальный и в основном связан с Т-лимфоцитами и макрофагами. Инактивация ТК-гена снижает способность вируса (1-го типа) вызывать аборты у привитого КРС. ^ Живые вакцины при ИРТ отличаются большим разнообразием Только в США применяют 14 вариантов живых вакцин. Большинство из них - штаммы вируса, аттенуированные длительным пассированием в первичных культурах и перевиваемых линиях клеток. В Бельгии и Японии применяют ts-мутанты. Живые вакцины при ин-траназально-внутримышечном применении обусловливают хороший локальный иммунитет и защиту животных от клинического проявления инфекции. При вакцинации живыми вакцинами необходимо использовать такие штаммы, которые не способны к персистенции, ибо не исключается возможность возникновения рекомбинантных вариантов при взаимодействии аттенуированного и вирулентного штаммов вируса. В качестве живой вакцины предложен дефектный по ТК иммуногенный мутант, способный персистировать в организме привитых телят не менее 3-х мес и передаваться телятам без перехода в ТК-генотип. В РФ и странах СНГ для профилактики ИРТ применяют живую вакцину ТК-А (ВИЭВ) Её вводят подкожно в дозе 2-105 ТЦЦзо/мл. Иммунитет у привитых животных наступает на 5-7-й день после вакцинации и сохраняется не менее одного года. Широко применяют также живую бивалентную вакцину "Бивак", содержащую 2 вакцинных штамма: ПГ-3 и ИРТ Вакцина "Бивак" производится биофабрикой, она безвредна, иммуногенна. Персистенция и экскреция аттенуированного штамма вируса обнаружены также при применении других живых вакцин. Особенно часто и длительно вакцинный штамм вируса ИРТ выделяется со спермой привитых быков. Введение живой вакцины во время эстрального периода может сопровождаться поражением яичников, а вакцинация в ранний период стельности прерыванием беременности. Считается, что интраназальная вакцинация более эффективна, чем подкожная или внутримышечная. При этом введении вакцинный вирус быстро - в клетки верхних дыхательных путей и глоточного кольца и усиливается синтез IgA и локальное образование интерферона., а при генитальном введении проникает в эпителиальные клетки влагалища или препуция. Размножаясь в указанных клетках, вирус может выделяться во внешнюю среду в течение 2-х нед. Патентуется живая поливалентная вирус-вакцина из 5 типов аттенуированных вирусов наиболее широко распространенных в Японии и других странах: вирус ИРТ, ВД-БС, ПГ-3, PC-вирус и бычий аденовирус 7-го типа. Все компоненты приготовлены в клеточных культурах. Поливалентность препарата усиливает эффективность вакцинации КРС. ^ . В ген gill аттенуированного вакцинного штамма ИРТ (NY) dltk была встроена мономерная вставка эпигонов белка Р1 вируса яшура. Полученная модифицированная живая вакцина защищала телят от ИРГ и ящура. Получен также рекомбинант вируса ИРТ, экспрессирующий димерную вставку эпитопов вируса ящура. Возможно получение рекомбинантов с 3-валентными вставками эпитопов вируса яшура серотипов О, А и С. Получена генно-инженерная вакцина из мутанта вируса ИРТ. Инактивированные вакцины. По степени разрушения АГ детерминант инактиванты располагаются следующим образом: Уф облучение, нагревание (56°С), р-пропилактон, формальдегид и димерэтиленинин. В РФ применяется инактивированная димерэтилениминовая вакцина из эпизоотического шт. 4016, в которой в качестве адъюванта используется аэросил. В Чехословакии используется формолвакцина с масляным адъювантом. Препарат применяется двукратно в дозе 2 мл с 4-нед интервалом. У вакцинированных животных формируются гуморальные (1:128 - 1:256) и секреторные (1:2-1:8) AT. Наблюдалась корреляция между уровнем сывороточных AT и устойчивостью телят к заражению. Однако вакцинация серонегативных телят не предупреждала у них постинфекционной латенции вируса, но препятствовала ей у ранее перенесших спонтанную инфекцию. Колостральный иммунитет длился 4-5 мес. Вакцинация телят индуцировала сероконверсию лишь тогда, когда уровень материнских AT у них был очень низким. Применение инактивированной вакцины против ИРГ среди 100% серопозитивных коров способствовало снижению числа случаев патологических состояний, ассоциированных с инфекцией этим вирусом. Отмечено также и улучшение некоторых показателей воспроизводства: повышение процента рождаемости, снижение количества случек, необходимых для оплодотворения, уменьшение числа спонтанных абортов. Уже после однократной вакцинации у коров и стельных нетелей обнаружено повышение титра AT к ИРТ (6-9 log независимо от тира AT до вакцинации). Инактивированные вакцины, как и живые, применяют двукратно с 2-3-нед интервалом. Эффективность инактивированных вакцин против ИРТ зависит от концентрации АГ и природы адъюванта. Для оценки иммуногенности вакцины против ИРТ можно использовать кроликов в качестве лабораторной модели. По титрам накопления ВНА у привитых внутримышечно кроликов судят о качестве вакцины. Высокоиммуногенна инактивированная вакцина против ИРТ с двухкомпонентным масляным адъювантом ВНИЯИ и ГОА-сапониновым адъювантом. ^ . Показано минимальное размножение вируса ИРТ в организме животных, иммунизированных гликопротеином gIV, который может быть использован в качестве субъединичной вакцины в сочетании со свободным от вируса лизатом инфицированных клеток. Субъединичную вакцину готовили в виде иммуностимулирующего комплекса (ИСКОМ) из вирулентного штамма вируса герпеса типа 4 КРС. Очищенный вирус обрабатывали 1%-ным l-o-h-октил-глюкопиранозидом в течение нескольких часов при 4°С, затем центрифугировали в ступенчатом градиенте сахарозы. После диализа осадок растворяли в фосфатном буфере. Препарат в дозе 50 и 100 мкг вирусных компонентов дважды вводили внутримышечно 4-мес телятам с интервалом в 4 нед. Через 2 нед после второй вакцинации животных заражали интраназально вирулентным вирусом ИРТ. Все животные, иммунизированные ИСКОМ вакциной не заболели, вирус в носовом секрете не обнаруживался, титр ВНА составлял 1:3500 и выше. У телят, иммунизированных коммерческой вакциной, наблюдали подъём температуры и наличие вируса в носовом секрете. При испытании на телятах не было выявлено корреляции между титром сывороточных ВНА и устойчивостью к заражению. Запатентован метод получения субъединичной вакцины на основе полипегггидов герпесвируса КРС 1-го типа. В качестве кандидата в вакцину использовали мажорный гликопротеин gIV вируса ИРТ КРС. Опытных животных вакцинировали дважды с 3 нед интервалом. Препарат индуцировал ВНА в сыворотке крови и в слизистой носовых путей. Иммунизация приводила к предупреждению развития клинических признаков заболевания при экспериментальном заражении разрешающей дозой вируса. Сравнение иммуногенности субъединичной и инактивированной вакцины с масляным адъювантом дало сходные результаты. Титр гуморальных AT у КРС после 1- и 2 кратного применения субъединичной вакцины был выше, чем при прививке инактивированной вакциной. Секреторные AT формировались лишь после 2 кратной вакцинации и были равнозначными у животных, привитых обоими препаратами. В ФРГ имеется хороший опыт сочетанного применения живой и инактивированной вакцины против ИРГ. Живую вакцину вводили двукратно с интервалом в 6 нед сразу после установления диагноза. Спустя 7 мес 2 кратно с тем же интервалом вводили инактивированную вакцину. В результате такой вак-цинопрофилактики новых случаев заболевания не регистрировали. Спустя 4 г. после прекращения вакцинации животные оказались серонегативными. Авторы оценили предложенную ими схему применения живой и инактивированной вакцин как эффективную для оздоровления поголовья от ИРТ. Поскольку вирус ИРТ может приживляться и длительно персистировать в организме вакцинированных животных, трудно однозначно ответить на вопрос о значении специфической профилактики в оздоровлении хозяйств от ИРТ или точнее - можно ли путем систематического применения вакцин освободить хозяйство от носительства полевых штаммов вируса. Имеются сообщения о том, что полного оздоровления можно достичь лишь в результате систематического (4-летнего) применения в хозяйстве инактивированной эмульгированной вакцины,. ^ . Полной связи между титрами гуморальных AT и невосприимчивостью к вирусу нет. Даже низкий уровень AT может защитить животное от заражения. Это кажущееся противоречие можно объяснить тем, что в устойчивости организма к инфекции большое значение имеют местные (секреторные) AT и другие факторы иммунитета. Вирус ИРТ в организме индуцирует синтез интерферона, который препятствует размножению вируса в клетках. Интерферон в высоких титрах обнаруживается в течение 7 да при внутривенном введении вируса. Установлено и локальное образование интерферона в дыхательных путях при интраназальном и интратрахеальном заражениях. Вакцинный вирус также обладает высокой интерфероногенной активностью. Наступление ранней невосприимчивости у вакцинированных телят связано с появлением интерферона. Видимо, выявление специфических AT в сыворотке крови не является точным индикатором иммунитета, хотя остается критерием при иммунологической оценке. Большинство авторов считают, что ВНА в титре 1:2-1:4 защищают животных от заражения. Телята, имеющие индекс нейтрализации сыворотки крови 2,4 и 2,83±0,9 и титр AT в РИГА 1:232, клинически не реагировали на введение вирулентного вируса. ^ . Иммунизация животных живыми вакцинами против ИРГ снижает, но не предотвращает латентной инфекции у КРС. Со временем титр поствакцинальных AT при ИРТ снижается, но так как вирус в организме переболевшего и вакцинированного животного может реактивироваться из комплекса вирус-антитело, то содержание AT колеблется. По-видимому, этим и обусловлено выделение персистирующего вируса. Даже у животных с высоким титром AT вирус ИРТ был выделен из миндалин и лимфоузлов. В качестве профилактичских мер рекомендуют регулярное исследование проб сыворотки крови от быков-производителей на наличие AT, a материала из препуция - вируса. ^ . Изучением иммуногенных свойств вирус вакцины против ИРГ на коровах установлено, что при 1 кратном введении препарата максимальный уровень AT отмечали через 1-2 мес после вакцинации. Через 6 мес титр AT в РИГА снижался вдвое, а через 9 мес он был на уровне иммунного фона. Динамика ВНА имела такую же закономерность. Однако ВНА на высоком уровне удерживались дольше. Повторная иммунизация приводила к повышению титра гуморальных AT. У телят, полученных от вакцинированных коров, титр гуморальных AT был выше, чем у их матерей. Пассивно передающиеся AT в сыворотке крови телят и секретах из носовой полости появлялись уже в 1 дн после потребления молозива. Титр их в секретах носовой полости в большинстве случаев не превышал 1:8 в первые 15-20 сут после рождения. Длительность циркуляции поствакцинальных антител. У коров через 9 мес после прививки живой вакциной в РНГА с сывороткой крови AT не выявлялись. Колостральные АТ сохранялись в крови телят в достаточно высоком титре до 30 дн с последующим снижением к 60-му дн. Эффективность вакцины против ИРТ в Венгрии долгое время определяли в тесте нейтрализации с сывороткой вакцинированных телят. В настоящее время предложенболее чувствительный метод. Коэффициент корреляции между титром в РН и ELISA составлял 0,789. Серопрофилактика. Для серопрофилактики ИРТ, ПГ-3 и аденовирусной инфекции гипериммунные поливалентные сыворотки удается получать на лошадях, которых иммунизируют АГ, инактивированными электрическим полем или лазерным излучением. АГ применяют с масляными адъювантами. Поливалентные сыворотки применяют в промышленных комплексах по доращиванию и откорму молодняка КРС. ^ . Проведение мероприятий, изложенных в наставлении по борьбе с ИРТ, где предусмотрены надежная, систематически проводимая диагностика (включая исследование спермы быков-производителей на племенных станциях), строгий контроль за перемещением скота и активная профилактика обеспечивает создание устойчивого благополучия хозяйства в отношении ИРТ. Для обеспечения безинфекционного стада КРС проводится регулярное серологическое тестирование и удаление из стада инфицированных животных, вакцинация, дезинфекция и борьба с грызунами. ^ Семейство: Flaviviridae. Таксономическая структура семейства. Семейство: Flaviviridae. Рода: Flavivirus, Pestivirus, Hepacivirus Особенности вириона. Морфология. Вирионы сферической формы, имеют липидную оболочку; диаметр 40-60 нм. Капсид образован капсидным протеином (С), а оболочка содержит 2-3, мембранных протеина, кодируемых вирусом. Вцелом, общие структурные характеристики гепацивирусов сходны с таковыми флави- и пестивирусов. Геном. РНК: односпиральная, линейная, позитивная; размер 11 kb, 12,3 kb и 9,6 kb у флави-, пести- и гепацивирусов, соответствено. 3’-концевого поли(А)-трека нет. У вирусов рода Flavivirus по 5’-концу РНК есть кэп типа I. Протеины.Все вирусы семейства имеют один небольшой основной капсидный протеин и 2 (Flavivirus и Hepacivirus) или 3 (Pestivirus) мембрано-ассоциированных протеина. В составе сиквенсов неструктурных протеинов определены мотивы, характерные сериновой протеазе, РНК хеликазе и РНК-зависимой РНК полимеразе, которые имеют сходную локализацию в геноме у вирусов всех трех родов. ^ Липиды (15-20% общей массы вириона у флавивирусов), образующие оболочку вириона, имеют клеточное происхождение. Липидные компоненты пести- и гепацивирусов не идентифицированы. Углеводороды присутствуют в вирионе в виде гликолипидов и гликопротеинов. ^ Геномная РНК вирусов всех трех родов имеет сходную организацию. В инфицированных клетках обнаруживают только мРНК, которая имеет одну ORF, фланкированную по 5’- и 3’-концам некодирующими участками (noncoding regions, NCR), формирующими специфические вторичные структуры, необходимые для репликации генома. У флавивирусов инициация трансляции кэп-зависимая в случае, тогда как у пести- и гепацивирусов идентифицирован внутренний сайт входа рибосомы (internal ribosomal entry site, IRES). Вирусные протеины синтезируются как части полипротеина (более 3000 аминокислот), который подвергается ко- и посттрансляционному разрезанию вирусными и клеточными протеиназами. Структурные протеины расположены в N-концевой части полипротеина, а неструктурные – в остальной. Последние включают сериновую протеазу, РНК хеликазу и РНК-зависимую РНК полимеразу. Синтез РНК происходит в цитоплазме в ассоциации с мембранами через синтез негативных промежуточных форм. Сборка вириона и приобретение оболочки происходит на внутриклеточных мембранах, частицы транспортируются в секреторных цитоплазматических везикулах и высвобождаются из клетки путем экзоцитоза. ^ Между вирусами разных родов антигенного родства нет. Перекрестная активность в серологических тестах наблюдается на внутриродовом уровне (Flavivirus, Pestivitus). Гепацивирусы антигенному анализу пока не поддаются. Род: Flavivirus. Типовой вид: Yellow fever virus (YFV) (вирус желтой лихорадки). Характерные особенности. Распространение флавивирусов происходит с участием членистоногих переносчиков (мокитов или клещей), в которых они активно репродуцируются. Некоторые флавивирусы являются этиологическими агентами зоонозов грызунов и летучих мышей, не связанных с участием членистоногих переносчиков. ^ Морфология.Вирионы сферические; диаметр 50 нм. Различают две формы вирионов. Зрелые вирионы содержат два вирусных мембрано-ассоциированных протеина Е и М. Внутриклеточные незрелые вирусные частицы имеют в своем составе вместо М его предшественника – prM, который протеолитически разрезается во время созревания. Детальный структурный анализ был проведен в отношении вируса клещевого энцефалита (Tick-borne encephalitis virus, TBEV). Его мажерный оболочечный протеин Е формирует димеры, атомная структура которых определена с использованием методов кристаллографии в рентгеновских лучах (X-ray cristallography). Димеры протеина Е имеют палочковидную (цилиндрическую) форму и ориентированы параллельно мембране, т.е. не образуют спайко-подобных выступов (при своем нейтральном рН).Криоэлектронные микрофотографии дают основание полагать, что оболочка вириона и кор имеют икосаэдральную симметрию. Точная Mr вириона не определена, но расчетная, в соответствии с композицией вируса, составляет примерно 60х106. Плавучая плотность в сахарозе составляет 1,19 г/см3, S20w 200S. Вирус стабилен при рН 8,0, но быстро инактивируется при низких значениях рН, температуре выше 40 оС, при воздействии органических растворителей, детергентов, УФ лучей и g-облучении. Геном. РНК: односпиральная, позитивная, линейная; размер примерно 11 kb. 5’-конец имеет кэп типа I (m-7GpppAmp), предшествующий консервативному динуклеотиду AG. 3’-конец не имеет поли(А)-трека и заканчивается консервативным динуклеотидом CU. Протеины.В состав вириона входит 3 структурных протеина: капсидный протеин (С), мажерный оболочечный протеин Е, и либо prМ (у незрелых вирионов), либо М (у зрелых вирионов). Атомная структура растворимых димерных форм протеина Е определена кристаллографией в рентгеновских лучах. Протеин Е является вирусным гемагглютинином и участвует в процессе связывании с рецептором и рН-зависимого слияния мембран (вируса и клетки) в процессе рецептор-медиированного эндоцитоза. В инфицированных клетках синтезируется 7 неструктурных протеинов: NS1, NS2А, NS2В, NS3, NS4А, NS4В, NS5. NS3 является мультифункциональным протеином. N-концевая треть протеина формирует вместе с NS2В комплекс вирусной сериновой протеиназы, участвующий в процессинге полипротеина. С-концевая часть NS3 содержит РНК хеликазный домен, участвующий в репликации РНК, а также обладает РНК-трифосфатазной активностью, которая, вероятно, используется в формировании 5’-концевой кэп-структуры вирусной РНК. NS5 является самым крупным и наиболее консервативным протеином флавивирусов. NS5 является РНК-зависимой РНК полимеразой, и также, предположительно, имеет мотив, определяющий метилтрансферазную активность, участвующий в метилировании 5’-кэп-структуры. ^ Липиды (17% массы вириона) имеют клеточное происхождение. Углеводороды, составляющие 9% массы вириона (гликолипиды и гликопротеины) имеют композицию и структуру, зависимые от клеток-хозяина (позвоночных или членистоногих). Сайты N-гликозилирования присутствуют у протеинов prМ (1-3 сайта), Е (0-2 сайта) и NS1 (1-3 сайта). ^ В инфицированных клетках обнаруживают только одну вирусную мРНК, которая имеет одну ORF (более 10000 оснований), кодирующую все структурные и неструктурные протеины, фланкированную по 5’- и 3’-концам короткими некодирующими участками (NCR). Хотя нуклеотидные сиквенсы дивергентны, предполагаемая вторичная структура 5’- и 3’-NCRs консервативна у разных флавивирусов. NCRs имеют консервативные участки, различающиеся у флавивирусов, распространяемых москитами или клещами. Длина 3’-NCR вируса клещевого энцефалита может значительно варьировать (45-800 нуклеотидов) и, в некоторых случаях, содержать внутренний поли(А)-тракт. Синтез РНК происходит на мембранах перинуклеарного эндоплазматического ретикулума. После трансляции исходной геномной РНК, запускается процесс репликации РНК, начинающийся с синтеза комплементарных негативных цепей, которые затем используются в качестве матриц для образования полноразмерных позитивных молекул РНК. Они синтезируются по полуконсервативному механизму с образованием промежуточных (содержащих как двухцепочечные участки, так и вновь синтезированные одноцепочечные молекулы) и репликативных (дуплексы молекул РНК) форм. Синетез негативных цепей в клетках, инфицированных флавивирусами, продолжается в течение всего цикла репликации. Трансляция обычно начинается с первого AUG ORF, но у флавивируосв, передающихся москитами, может также начинаться со второго внутреннего AUG, расположенного на 12-14 кодонов ниже. Полипротеин процессируется клеточными протеазами и вирусной NS2B-NS3 сериновой протеазой с образованием зрелых структурных и неструктурных протеинов. Топология протеинов относительно эндоплазматического ретикулума и цитоплазмы определяется внутренними сигналами и специфическими стоп-трансферными сиквенсами (stop-transfer sequences). Пролиферация и гипертрофия внутриклеточных мембран является характерной особенностью клеток, инфицированных флавивирусами. Репликативные комплексы осаждаются с мембранными фракциямии экстракта инфицированных клеток. Первоначально вирусные частицы могут быть обнаружены в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме, который считается местом сборки вирионов. Затем такие незрелые вирионы транспортируются через мембранные системы секреторного аппарата клетки к ее поверхности, где происходит их экзоцитоз. Непосредственно перед высвобождением вириона протеин prМ разрезается фуриновыми или фурино-подобными клеточными протеазами с образованием зрелых вирионов. Инфицированные флавивирусами клетки высвобождают также неинфекционные субвирусные частицы, имеющие более низкий (по сравнению с целым вирионом) коэффициент седиментации (70 S против 200 S) и проявляющие гемагглютинирующую активность (медленно седиментирующий гемагглютинин, SHA). ^ Все флавивирусы серологически родственны, что может быть продемонстрировано в ELISA или реакции ингибиции гемагглютинации с использованием поли- и моноклональных антител. Реакция нейтрализации более значима и может быть использована для определения отдельных серокомплексов более близкородственных флавивирусов. Оболочечный протеин Е является основной мишенью для нейтрализующих антител и вызывает образование протективного иммунитета. Протеин Е индуцирует, также, образование перекрестно реагирующих, но не обладающих нейтрализующей активностью антител. Антигенные сайты, участвующие в нейтрализации определены для всех трех структурных доменов протеина Е. АТ, специфичные prМ, взаимодействуют, в основном, с нейтрализованными вирионами. ^ Спектр естественных хозяев. Флавивирусы могут инфицировать различные виды позвоночных и, во многих случаях, членистоногих. Некоторые вирусы имеют ограниченный спектр восприимчивых хозяев-позвоночных (например, только приматы); другие могут инфицировать широкий спектр видов (млекопитающих, птиц и др.). Членистоногие обычно инфицируются во время прокормления на хозяине (позвоночном), во время виремии, или при ее отсутствии (последнее описано в отношении флавивирусов, передающихся клещами). ^ Большинство флавивирусов являются арбовирусами и поддерживаются в природе путем передачи между кровососущими членистоногими (переносчиками) и позвоночными (хозяевами). Примрено 50% известных флавивирусов распространяются москитами, 28% - клещами, а остальные являются зоонозными агентами, распространяющимися между грызунами и летучими мышами при отсутствии известных векторов. В некоторых случаях цикл передачи не идентифицирован. ^ Флавивирусы распространены повсеместно, но некоторые виды встречаются в определенных эндемичных или эпидемичных районах, например, вирус желтой лихорадки (YFV) – в тропических и субтропических областях Африки и Южной Америки, вирус Денге (DENV) – в тропических областях Азии, Океании, Африки, Австралии и Америки, вирус японского энцефалита (JEV) – в Юго-Восточной Азии, вирус клещевого энцефалита (TBEV) – в Европе и Северной Азии. ^ Более 50% известных флавивирусов асоциированы с болезнями человека, включая такие опасные патогены как YFV, DENV (тип 1-4), JEV и TBEV. Болезни, вызываемые флавивирусами, могут быть ассоциированы с симптомами поражения центральной нервной системы (менингиты, энцефалиты), лихорадкой, артралгией, сыпью и геморрагической лихорадкой. Некоторые флавивирусы патогенны для домашних и диких животных (лошадей, свиней, овец, собак, индеек, куропаток, андатр) и вызывать экономически значимые болезни. ^ Видовую принадлежность флавивирусов определяют по следующим критериям: нуклеотидный и аминокислотный сиквенс; антигенные свойства; географическое распространение; переносчики; естественные хозяева; ассоциация с болезнью; экологические характеристики. Вирусы данного рода сгруппированы по серологическим характеристикам и в соответствии с преобладающими векторами. Виды (53 вида):
Предполагаемые виды: Tamana bat virus (TABV), Cell fusing agent virus (CFAV)[M91671]. ^ Типовой: Bovine viral diarrhea virus1(BVDV1)(в.вирусной диареи КРС 1). Характерные особенности. Пестивирусы кодируют два уникальных продукта генов. Первый протеин ORF – неструктурный протеин Npro, обладающий аутопротеолитической активностью, отвечающей за высвобождение из вновь образованного полипротеина. Один из трех вирусных оболочечных гликопротеинов Erns обладает РНКазной активностью. ^ Морфология. Вирионы сферические, оболочечные; диаметр 40-60 нм. На поверхности вириона различают кольцевидные (ring-like) субъединицы размером 10-12 нм. Структура и симметрия кора не изучена. Точная Mr вириона не определена, но расчетная, в соответствии с композицией вируса, составляет примерно 60х106. Плавучая плотность в сахарозе составляет 1,10-1,15 г/см3, S20w 140-150S. Инфекционность вируса стабильна в пределах относительно широкого спектра рН, но быстро снижается при температуре выше 40 оС и воздействии растворителей и детергентов. Геном.РНК: односпиральная, позитивная, линейная; размер примерно 12,3 kb. Данных, свидетельствующих о наличии кэпа по 5’-концу, нет. 3’-конец не имеет поли(А)-тракта. Геномная РНК содержит одну ORF, охватывающую почти весь геном вируса. У некоторых цитопатогенных штаммов BVDV-1 в определенных участках генома (NS2 или по месту перехода NS2 в NS3) идентифицированы небольшие вариабельные интегрированные фрагменты нуклеиновой кислоты (вирусного или клеточного происхождения). Другие цитопатогенные изоляты BVDV имеют генетические дуплексы, охватывающие целиком или частично участки генома, кодирующие протеины Npro или NS3, что приводит к увеличению вирусного генома до 16,5 kb. Во всех этих случаях сохраняется одна большая ORF. Цитопатогенные вирусы могут также образовываться при делециях больших участков генома. Такие дефектные геномы могут сохраняться в присутствии интактного хелперного вируса (помощника). Протеины.В состав вириона входит 4 структурных протеина: основной нуклеокапсидный протеин (С), и 3 оболочечных гликопротеина Erns, Е1 и Е2. Все три глкопротеина существуют в виде межмолекулярных комплексов, связанных дисульфидными связями: гомодимеры Erns, гетеродимеры Е1-Е2, гомодимеры Е2. Erns обладает РНКазной активностью и является уникальным продуктом пестивирусов, не найденым у вирусов других родов семейства. Пестивирусы кодируют 7-8 неструктурных протеинов (NS). Протеин Npro, также уникальный для пестивирусов, является протеиназой, аутокаталитически высвобождающейся от вновь образованного полипротеина. Неструктурный протеин р7, вероятно, участвует в созревании вируса. Протеин NS2-3 многофункциональный. N-концевая область (40%, или NS2) является гидрофобной и содержит мотив “цинкового пальца” (zinc finger motif), что свидетельствует о его участии в связывании РНК или репликации. С-концевая область (60% или NS3) функционирует как сериновая протеиназа, участвующая в процессинге полипротеина и как РНК-хеликаза/NTPаза, вероятно, участвующая в репликации РНК. NS2-3 обнаруживается у нецитопатогенных BVDV. У цитопатогенных изолятов BVDV, вируса пограничной болезни овец (BDV) и классической чумы свиней (CSFV) NS2 и NS3 могут продуцироваться в добавление к NS2-3. Протеин NS4A действует как кофактор для NS3-протеиназной активности. Роль NS4B неизвестна. NS5A является единственным фосфорилированным пестивирусным протеином и, вероятно, участвует в репликации РНК. NS5B обладает активностью РНК-зависимой РНК полимеразы. ^ Имеет липидную оболочку, но по композиции липидов данных нет. Все вирусные оболочечные гликопротеины имеют N-связанные гликаны. ^ Геномная РНК состоит из одной ORF, кодирующей полипротеин примерно в 4000 аминокислот, предшествующей ей 5’-NCR (360-385 нуклеотидов), и следующей за ней 3’-NCR (230 нуклеотидов). Порядок расположения генов:5’-Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-3(NS2-NS3)-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-3’. Репликация пестивирусов инициируется рецептор-опосредованным эндоцитозом, в котором участвуют один или более поверхностных клеточных молекул и вирусных гликопротеинов Erns и E2. После эндоцитоза и раздевания геномная РНК служит в качестве мРНК. Субгеномных молекул мРНК нет. Инициация трансляции происходит по кэп-независимому внутреннему инициирующему механизму с использованием внутреннего сайта входа рибосомы (IRES), расположенного в 5’-NCR РНК. Процессинг полипротеина осуществляется ко- и посттрансляционно за счет клеточных и вирусных протеиназ. Неструктурный протеин Npro (первый протеин ORF) отрезается аутопротеолитически от вновь образованного полипротеина по сайту Npro/С. Последующие разрезания полипротеина, сопровождающиеся образованием структурных протеинов C, Erns, E1 и E2, вероятно медиируется клеточными сигнальными пептидазами. Транслокация гликопротеина в эндоплазматический ретикулум происходит, вероятно, при участии внутренней сигнальной последовательности, возможно внутри протеина C. Разрезание между Е2 и р7 происходит не полностью, что приводит к образованию внутриклеточных форм Е2 с разными С-концами. В зависимости от вируса NS2-3 остается интактным (нецитопатогенные вирусы) или обнаруживаются вместе с N- и С-концевыми продуктами NS2 и NS3 (цитопатогенные вирусы). Механизм образования NS3 включает события рекомбинации РНК. Цитопатогенные BVDV имеют генетические вставки, делеции, дуплексы или реорганизации, что, в итоге, приводит к продукции NS3. NS3 (или NS2-3 у нецитопатогенных вирусов) обладает активностью сериновой протеазы, ответственной за весь последующий процессинг полипротеина. NS4A облегчает разрезание, обусловленное NS3, по сайтам NS4B/5A и 5A/5B. Репликация РНК происходит в ассоциации с внутрицитоплазматическими мембранами, предположительно в репликационных комплексах, образованных вирусной РНК и вирусными неструктурными протеинами. Обнаруживаются репликативные формы РНК пестивирусов. Соотношение позитивных и негативных цепей РНК в клетках, через 12 часов после инфицирования, равно 10. Синтез РНК не ингибируется актиномицином D. Созревание вируса изучено не достаточно. Вирусные протеины не обнаружены на поверхности клетки, что свидетельствовует о созревании вирионов во внутриклеточных везикулах, и последующем высвобождении путем экзоцитоза. Значительное количество инфекционных вирусных частиц остаются клеточно-ассоциированными. Синтез клеточных РНК и протеинов продолжается в процессе инфекции. ^ Пестивирусы антигенно родственны, и имеют общие эпитопы, участвующие в перекрестной активности. Отдельные антигенные детерминанты были определены с использованием моноклональных антител. Антигенные вариации особенно хорошо просматриваются между изолятами BVDV. N-концевая часть Е2 содержит гипервариабельный, в антигенном отношении, участок. Профиль взаимодействия с моноклональными антителами согласуется генетическим родством вирусов. У инфицированных животных вырабатываются антитела, специфичные двум структурным гликопротеинам (Erns и Е2) и протеину NS3, тогда как на все остальные протеины ответ развивается очень слабый или не развивается совсем. Протеины Erns и Е2 способны индуцировать протективную защиту независимо друг от друга. Моноклональные антитела, специфичные этим протеинам могут обладать нейтрализующей активностью. Антитела, специфичные NS3, нейтрализующей активностью не обладают. ^ Спектр естественных хозяев. Пестивирусы инфицируют свиней и жвачных, включая КРС, овец, коз и диких жвачных. Беспозвоночных хозяев нет.Пути распространения. Передача вируса происходит путем прямого и непрямого контактов. Трансплацентраная и конгенитальная передача происходит у всех видов животных. Патогенность. Пестивирусные инфекции могут протекать субклинически и сопровождаться различными клиническими состояниями, включая диарею, острый геморрагический синдром, острую фатальную болезнь и изнуряющую болезнь. Трансплацентарное инфицирование может приводить к смерти плода, врожденным нарушениям или развитию пожизненной персистентной инфекции. Фатальная болезнь слизистых случается у КРС, персистентно инфицированного нецитопатогенным BVDV, который суперинфицируется цитопатогенным вирусом. Экспериментальная инфекция. В экспериментальных условиях ни у каких видов животных, кроме естественных хозяев вызвать инфекцию BVDV или BDV не удалось. Однако CSFV был адаптирован к репродукции у кроликов. Культуры клеток. Клетки, полученные от естественных хозяев (КРС, свиней, овец) поддерживают репликацию вируса. Большинство вирусных изолятов нецитопатогенны и создают персистентную инфекцию в культуре клеток. Инфекционный нецитопатогенный BVDV часто присутствует в продуктах сыворотки крови КРС, используемых для культивирования клеток. Цитопатогенные BVDV, которые возникают у животных во время персистентной инфекции, способны к бляшкообразованию и ЦП действию. Гемагглютинация. Пестивирусы гемагглютинирующей активностью не обладают. ^ Видовую принадлежность пестивирусов определяют по следующим критериям: родство по нуклеотидному сиквенсу; серологическое родство; вид животного-хозяина (от которого выделен изолят). Подразделение пестивирусов на виды проводится по нескольким параметрам, и их родству с типовыми вирусами видов, идентифицированных, на данный момент (BVDV-1: NADL; BVDV-2: 890; BDV: BD31 и CSFV: Alfort/187). Родство по нуклеотидному сиквенсу является важнейшим критерием подразделения пестивирусов на виды. Например, сиквенсы 5’-NCR между типовыми вирусами четырех известных, на данный момент, видов различаются на 15%. В большинстве случаев степень гомологии по 5’-NCR позволяет дифференцировать виды. Однако иногда родство по нуклеотидному сиквенсу может быть непоянтным (двусмысленным) и должно быть подкреплено дополнительными сравнительными анализами. Сывортка крови переболевших животных, содержащая антитела против данного вида пестивирусов (например, BVDV-1), обычно имеет титр нейтрализующей активности в несколько раз выше в отношении вирусов соответствующего вида (BVDV-1), чем против вирусов других видов. Наконец, различия по виду животного, от которого выделен вирус, могут (но не всегда) помочь в определении видовой принадлежности. Например, BVDV-1 и CSFV считаются разными видами, так как они отличаются друг от друга по (1) не мнее чем 25%-му различию нуклеотидного состава (по полному геному), (2) не менее чем 10-ти кратным различиям по титрам нейтрализации, при проведении реакции перекрестной нейтрализации с использованием поликлональных антител (сывороток иммунных животных), и (3) по спектру восприимчивых видов животных-хозяев (в естественных условиях CSFV инфицирует только свиней, тогда как BVDV-1 инфицирует как жвачных, так и свнией). Виды (4 вида):
Род: Hepaсivirus. Типовой вид: Нepatitis C virus (HCV) (вирус гепатита С). Характерные особенности.Гепацивирусы распространяются между людьми, через контакт с контаминированной кровью или продуктами крови. Беспозвоночных переносчиков (векторов) нет. Гепацивирусы отличаются от флави- и пестивирусов неспособностью к эффективному накоплению в культурах клеток и по тому, что протеин-предшественник, состоящий из неструктурных (NS) протеинов 2 и 3, аутокаталитически разрезается по сайту соединения NS2-3 по цинк-зависимому механизму. ^ Морфология.Вирионы сферические, оболочечные; диаметр около 50 нм. Вирусный кор сферический, около 30 нм в диаметре. Инактивируются при обработке хлороформом. Детально структура вириона не изучена. Плавучая плотность в сахарозе составляет 1,06 г/см3, если вирус выделен из сыворотки крови при остром течении инфекции, и 1,15-1,18 г/см3, если вирус выделен из сыворотки крови при хроническом течении инфекции. Более низкая плотность является результатом физической ассоциации вирионов с сывороточными низкоплотностными липопротеинами. Более высокая плотность появляется в следствие связывания вируса с сыворотчными антителами. Вирус гепатита С (HCV), полученный из культуры клеток, имеет плавучую плотность в сахарозе 1,12 г/см3. S20w 150S. Вирионы стабильны в буфере рН 8,0-8,7, но чувствителльны к нагреванию, органическим растворителям и детергентам. Геном.РНК: односпиральная, позитивная, линейная; размер примерно 9,6 kb. 5’-конец содержит внутренний сайт входа рибосомы (IRES) и имеет длину 340 нуклеотидов. 3’-конец сложный и содержит вариабельные участки (примерно 50 нуклеотидов), полипиримидиновый, различающийся по длине, участок (примерно 100 нуклеотидов) и высоко консервативный концевой участок (около 100 нуклеотидов). Протеины.В состав вириона входит как минимум 3 протеина: коровый (нуклеокапсидный) протеин С (р19) и два оболочечных протеина Е1 (gp31) и Е2 (gp70). Дополнительный протеин р7 неполностью отрезается от предшественника Е2, что приводит к образованию Е2-р7 и р7, хотя не ясно, являются ли они структурными компонентами вириона. Два оболочечных протеина образуют в составе вириона гетеродимеры (вероятно нековалентно связанные). Распознаваемые неструктурные протеины включают: NS2 (Mr 21х103) – протеин, который до разрезания является частью цинк-зависимой протеиназы, соединяющей NS2 и NS3, и медиирующей аутокаталитическое разрезание по месту соединения NS2/NS3; NS3 (Mr 70х103) – протеин с активностью сериновой протеазы, хеликазы и NTP-азы (протеиназная активность используется для разрезания по сайтам между оставшимися неструктурными протеинами); NS4А (Mr 6х103) – кофактор, существенный для активности сериновой протеазы NS3; NS4В (Mr 27х103) (функция не известна); NS5А – сериновый фосфопротеин, с неясной функцией (Mr 56-58 х 103, в зависимости от степени фосфорилирования); NS5В (Mr 68х103) – протеин с активностью РНК-зависимой РНК-полимеразы. ^ Наличие липидов не было показано непосредственно. Однако наблюдения по удалению вирусной оболочки и потере инфекционности при воздействии растворителей или детергентов свидетельствуют о присутствии липидов. Углеводы также не идентифицировнны непосредственно, но наличие сайтов гликозилирования в предполагаемых кодирующих областях генов Е1 и Е2 и демонстрация углеводов, ассоциированных с продуктами этих двух генов, экспрессированных как рекомбинантные протеины, согласуется с наличием углеводов в составе вирионов. ^ Геномная РНК состоит из одной ORF, кодирующей полипротеин примерно в 3000 аминокислот. Порядок расположения генов: 5’-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-3’. Все 3 структурных протеина (С, Е1 и Е2) кодируются в аминоконцевой части ORF. Непосредственно 3’ находится мелкий протеин р7, функция которого неизвестна. Идентифицированные структурные протеины кодируются в 3’-части ORF. Репликация изучена плохо, но есть данные, что она происходит в ассоциации с внутрицитоплазматическими мембранами. Репликативные формы вирусной РНК были обнаружены в ткани печени. Геномная РНК транслируется в полипротеин, который быстро процессируется ко- и посттрансляционно. Инициация трансляции происходит через IRES, расположенный внутри 5’-NCR, который также содержит несколько, расположенных близко друг к другу, AUGs. Транслокация структурных гликопротеинов в эндоплазматический ретикулум вероятно происходит с использованием внутренних сигнальных сиквенсов. Разрезание структурных протеинов осуществляется клеточными сигнальными пептидазами; вирусные протеазы разрезают все соединения между неструктурными протеинами. Сборка вирионов происходит, вероятно, путем почкования в везикулы. ^ Вирусспецифические антитела к структурным протеинам (С, Е1 и Е2) и неструктурным протеинам (в основном NS3, NS4 и NS5) могут быть выявлены, с использованием рекомбинантных антигенов, в крови людей, инфицированных HCV. В формировании гуморального иммунного ответа участвуют конформационно-зависимые и линейные эпитопым HCV. Значительная гетерогенность по геному отражается в некоторой серологической гетерогенности гуморального иммунного ответа, особенно в отношении продукта гена NS4. Наиболее широкая гетерогенность обнаружена по N-концевым 27 аминокислотам Е2 (гипервариабельный участок 1, HVR-1). Есть данные, что HVR-1 является нейтрализующим эпитопом протеинов HCV и, что уклоняющиеся от нейтрализации варианты (эскейп-варианты) селектируются под влиянием иммунного ответа хозяина. Могут быть другие эпитопы нейтрализации, но они еще не определены. Клеточно-опосредованный иммунный ответ на все протеины HCV был показан, но его значимость не ясна. Однако есть свидетельства, что такой ответ ассоциируется с улучшением или прекращением инфекции. Из-за отсутствия системы культуры клеток, приемлемой для культивирования HCV, нет возможности широкого использования реакции нейтрализации in vitro. Отсутствие протективного иммунитета у шимпанзе, ранее инфицированных HCV, на реинфицирование другим штаммом HCV или даже тем же (сходные данные получены по естественной инфекции у людей), свидетельствует, что определение серотипов HCV затруднительно. ^ Спектр естественных хозяев. Естественным хозяином и резервуаром HCV является человек. Экспериментально инфекция передавалась шимпанзе. Других хозяев не идентифицировано.Пути распространения. Вирус гепатита С распространяется почти исключительно парентерально, через кровь. Эффективный скрининг донорской крови и использование инактивирующих процедур могут значительно снизить уровень распространения HCV через кровь и ее продукты, однако и другие пути заражения, особенно через нестерильные шприцы, остаются важнейшими факторами риска в развивающихся странах. Сообщалось о возможности инфцирования при половом контакте и перинатально. Географическое распространение. Вирус гепатита С распространен повсеместно. Данные (по детекции антител) свидетельствуют, что в развивающихся странах около 0,1-2,0% населения могут быть инфицированы HCV, но в некоторых уровень достигает 20%. Высокий уровень антителоносителей, может быть результатом использования контаминированных игл и шприцов. Примерно 3% населения Земли инфицировано HCV, что обусловливает развитие болезни у 170 миллионов человек. Патогенность. Течение инфекции варьирует от субклинического до (редко) скоротечного (молниеносного). Персистенция вируса встречается в 80% случаев инфицирования. Из них около 20% переходит в хронический острый гепатит и цирроз. Персистентные инфекции эпидемиологически связаны с первичным раком печени, криптогенным циррозом и некоторыми формами аутоиммунного гепатита. Проявления HCV-инфекции вне печени сопровождаются смешанной криоглобулинемией в ассоциации с мембранопролиферативным гломерулонефритом и аутоиммунными состояниями. Тканевый тропизм. Сообщалось о репродукции вируса гепатита С в некоторых линиях клеток, происходящих из гепатоцитов и лимфоцитов, но накопление вируса было недостаточным для практического использования этих систем. In vivo HCV реплицируется в гепатоцитах при кажущемся отсутствии цитопатогенного эффекта. ^ На основе гетерогенности нуклеотидного состава генома изолятов, полученных из разных регионов мира, вирус гепатита С был классифицирован на 6 генетических групп. Они были названы генотипами HCV 1-6. Генотипы различаются между собой на нуклеотидном уровне на 25-35%. Генотипы 7-11 описаны, но более широкий генетический анализ переместил вирусы генотипов 7-9 и 11 в генотип 6, а генотип 10 – в генотип 3. Шесть генотипов, в свою очередь, были подразделены еще на 100 субтипов, которые раличаются между собой на нуклеотидном уровне на 15-25%. Хотя генотипы различаются, подразделение на субтипы менее ясное, из-за перекрывания по степени гетерогенности. Было предложено подразделять (и классифицировать) основные генетические группы HCV на генотипы 1-6. Из-за невозможности, серотипирования изолятов HCV, и из-за отсутствия других таксономических характеристик основных генотипов, за исключением, географического распространения, все 6 генетических групп HCV, в настоящее время, составляют 1 вид.
Характерные особенности.GBV-A и GBV-A-подобные агенты (GBV-A-like agents) представляют группу родственных вирусов, идентифицированных не менее, чем у 6 видов обезян Америки (Нового Света). Они не вызывают гепатитов у естественных хозяев или других восприимчивых видов животных. Место или орган, в котором происходит репродукция, не определены; хотя вирус передается через кровь, естественные пути передачи неизвестны. Эти вирусы имеют сходную с гепацивирусами организацию генома и отдаленное генетическое сходство, но отличаются отсутствием полного гена капсидного протеина и организацией 3’-NCR, которая имеет менее сложную структуру. ^ : GB virus В (GBV-В) [U22304]. Характерные особенности. GBV-В был выделен от обезьян тамаринов (tamarin monkey), но их пассажная история свидетельствует о происхождении от человека. Передается через кровь и вызывает гепатиты у некоторых видов обезьян Америки. По организации генома и сходству сиквенсов GBV-B наиболее близок гепацивирусам. Типовой вид: GB virus С/Hepatitis G virus (GBV-HGV) [U22304] (HGV-1) [044402]. Характерные особенности.GBV-C/HGV генетически гетерогенный вирус, имеющий происхождение от человека. Передается через кровь и ее продукты, но могут быть и другие пути распространения. Хотя описанный, первоначально, как вирус гепатита (поэтому и альтернативное название Hepatitis G virus), данные о его патогенности и месте репродукции остаются противоречивыми. Хотя и отдаленно, по признакам организации генома и генетическому сходству GBV-C наиболее близок группе вирусов GBV-A. ^ Bovine Viral Diarrhea/Mucosal disease (англ.); Schleimhautkrankheit der Kinder (нем.); Maladia muqueuse des bovines (франц.); Diarrea virica bovina (исп.) Вирусная диарея - болезнь слизитых оболочек (ВД-БС) - инфекционная контагиозная болезнь КРС, преимущественно молодых животных, характеризующаяся эрозивно-язвенным воспалением слизистых оболочек пищеварительного тракта, ринитом, увеличением лимфоузлов, высокой лихорадкой, общим угнетением, лейкопенией, постоянной или перемежающейся диареей, эрозивным и язвенным стоматитом с обильным слюноотделением, появлением слизисто-гнойных истечений из носовой полости. У коров возможны аборты. Впервые как самостоятельное заболевание ВД-БС была определена в штате Нью-Йорк (США) в 1946 г. при вспышке острой, часто со смертельным исходом болезни КРС, характеризовавшейся диареей и эрозийными поражениями ЖКТ. В настоящее время ВД-БС широко распространена на территориях многих стран и вместе с 2-мя другими пестивирусами (ВКЧС и вирус ПВО) инфицирует 173 вида домашних и диких жвачных животных и 11 видов свиней. Имеются публикации об обнаружении AT и АГ пестивируса у человека, но возможность его инфицирования только предполагается. На основании различий в клинических проявлениях вирусную диарею и болезнь слизистых оболочек КРС первоначально рассматривали как разные болезни. Позднее на основании анализа патологических изменений, особенностей эпизоотологии и клинических проявлений эти 2 болезни стали обозначать под названием вирусная диарея - болезнь слизистых оболочек КРС. Поскольку установлена идентичность возбудителей этих болезней, то их считают одной инфекцией с различными клиническими проявлениями, преимущественно респираторного или диарейного синдрома, в связи с чем болезнь чаше стали называть вирусная диарея КРС. Болезнь зарегистрирована во всех странах мира. В некоторых штатах США обнаруживается до 70-90% серопозитивных животных. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям