Правила хранения, переливания крови и ее компонентов, препаратов крови в организациях здравоохранения
|
|
Скачать 0.68 Mb.
|
|
новорожденным по системе АВО
Приложение 2 к Правилам хранения, переливания крови и ее компонентов, препаратов крови в организациях здравоохранения ^ 1. Метод агглютинации в геле для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител 1. Метод основан на агглютинации эритроцитов в агаровом геле сефадекс, позволяет стандартизовать реакции гемагглютинации и получать достоверные результаты. 2. Для проведения гелевого теста используют следующее оборудование и реактивы: 1) идентификационные карты (далее - ID-карты) для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител; 2) идентификационная центрифуга (далее - ID-центрифуга) для центрифугирования ID-карт; 3) термостат 370С; 4) штатив для пробирок и карт; 5) пробирки вместимостью 5 и 10 мл; 6) пипетки полуавтоматические одноканальные (10, 25, 50 мкл); 7) раствор для разведения 1 (раствор бромелина); 8) раствор для разведения 2 (раствор низкой ионной силы - LISS); 9) 0,9 % изотонический раствор натрия хлорида; 10) стандартные типированные эритроциты человека для выявления антител и проведения перекрестной реакции. 3. ID-карты представляют собой пластиковые карточки, в которые встроено по 6 микропробирок. В 5 пробирках содержится смесь геля и антисывороток. 6-я пробирка - контрольная, содержит нейтральный гель без антител - ctl. Маркировка пробирок в ID-карте осуществляется по выявляемым антигенам, например A-B-AB-D-CDE-Ctl. 4. Диапазон выполняемых тестов включает в себя определение фенотипа эритроцитов (включая слабые варианты антигенов), антиглобулиновый тест, скрининг и идентификацию антител, тесты на совместимость и некоторые другие. 5. Гелевая технология предусматривает разделение эритроцитов при центрифугировании, при этом неагглютинированные эритроциты проходят через гель и оседают на дне пробирок (отрицательный результат), в то время как агглютинированные эритроциты задерживаются на поверхности или в толще геля (положительный результат). ^ 6. Забуференный декстрановый гель может быть как нейтральным, так и содержащим специфические антисыворотки или антиглобулиновый реагент на гелевом матриксе. 7. На гель наносятся эритроциты или смесь эритроцитов и сыворотки. Клетки всегда вносятся перед сыворотками, чтобы тестируемые сыворотки не контактировали с гелем, что особенно важно при проведении антиглобулинового теста. 8. После инкубации смесь эритроцитов и сыворотки центрифугируют. Для центрифугирования используют автоматическую ID-центрифугу, строго придерживаясь режима центрифугирования для данного метода, определенного в инструкции на ID-центрифугу. 9. При отклонении от режима центрифугирования могут быть ложноположительные (центрифугирование недостаточно длительное или слишком мягкое), или ложноотрицательные (при форсировании) результаты. 10. Для проведения теста используются три вида геля: 1) нейтральный, не содержащий специфических антител (применяется для поиска и идентификации антител солевым и ферментным методами, на холодовой стадии пробы на совместимость крови донора и реципиента); 2) специфический, содержащий антитела (моноклональные или поликлональные) к антигенам эритроцитов крови человека (применяется для типирования антигенов эритроцитов систем ABО, резус, Kell и тогда далее); 3) антиглобулиновый, содержащий антитела (полиспецифические или моноспецифические) к иммуноглобулинам человека и компонентам системы комплемента (применяется для прямого и непрямого антиглобулинового теста, то есть реакции Кумбса, при поиске и идентификации ауто- и аллоиммунных антител, пробе на совместимость крови донора и реципиента). 11. В зависимости от силы реакции агглютинации в гелевой среде принята следующая оценка полученных результатов: 1) сильноположительный (++++) - образовавшиеся агглютинаты эритроцитов задержались на поверхности геля; 2) положительный (+++) - агглютинаты располагаются в верхней трети столбика геля; 3) слабоположительный (++) - агглютинаты фиксированы в верхних двух третях геля; 4) очень слабоположительный (+) - агглютинаты располагаются в нижней трети геля; 5) отрицательный (-) - эритроциты формируют на дне микропробирки компактный осадок. ^ 12. ID-карты должны храниться в сухом, защищенном от света месте при температуре 18-250С. Срок годности карт - 18 месяцев. Срок годности реагентов - 2 года. Срок годности указан в паспортной части каждой карты и на упаковочных коробках. 13. Растворы для приготовления суспензии эритроцитов, а также стандартные сыворотки и стандартные идентификационные эритроциты (далее - ID-эритроциты), должны храниться в сухом, защищенном от света месте при температуре 2-80С. Срок годности указан на этикетке каждого флакона и упаковочной коробке. 14. Запрещается использование реагентов и карт с истекшими сроками годности, а также высохших, содержащих пузырьки газа, или с повреждением оболочки. 15. Для исследования могут быть использованы: 1) образцы цельной крови (взятые в чистую, сухую пробирку); 2) образцы крови, взятые на консервантах и стабилизаторах; 3) артериальная, капиллярная и пуповинная кровь без отмывания. 16. Результаты исследования сохраняются в низменном виде 48 часов при комнатной температуре и три недели в холодильнике (при 2-80С) при заклеенной липкой лентой верхней части ID-карты. 17. Нижнее поле ID-карты можно отклеить или отрезать и использовать как документ в истории болезни или в картотеке. 18. Перед использованием образцы и реагенты должны иметь комнатную температуру. ^ 19. ID-карты предназначены для одновременного определения группы крови по системе АВО и резус-принадлежности эритроцитов доноров и реципиентов (включая их слабые варианты антигенов) и для типирования других антигенов эритроцитов. ID-карты можно использовать взамен или параллельно с изогемагглютинирующими сыворотками, реагентами анти-D, анти-DCE, цоликлонами анти-А, анти-В, анти-D и анти-D Супер. 20. Первый этап исследования выполняется в зависимости от вида используемых ID-карт, содержащих поликлональные или моноклональные антитела. 21. При использовании ID-карт, содержащих поликлональные антитела готовится взвесь исследуемых эритроцитов в растворе для разведения 1 (), для чего необходимо: 1) выдержать раствор для разведения-1 до достижения им комнатной температуры; 2) провести маркировку чистых пробирок; 3) приготовить 5 % суспензию исследуемых эритроцитов в растворе для разведения-1, поместив в пробирку 0,5 мл раствора для разведения-1 и 50 мкл исследуемой цельной крови или 25 мкл эритроцитной массы; аккуратно смешать и инкубировать 10 мин при комнатной температуре; 4) использовать не позднее 15 минут после инкубации. 22. При использовании ID-карт моноклональные антитела готовят взвесь исследуемых эритроцитов в растворе для разведения-2, для чего необходимо: 1) выдержать раствор для разведения-2 до достижения им комнатной температуры; 2) провести маркировку чистых пробирок; 3) приготовить 5 % суспензию исследуемых эритроцитов в растворе для разведения-2, поместив в пробирку 0,5 мл раствора для разведения-2 и 50 мкл исследуемой цельной крови или 25 мкл эритроцитной массы. 23. На втором этапе исследования необходимо: 1) произвести маркировку ID-карты (N исследуемого образца сыворотки или Ф.И.О. пациента); 2) снять защитную фольгу с пробирок ID-карты; 3) в каждую пробирку ID-карты внести по 10 мкл исследуемых эритроцитов, приготовленных в соответствии с пунктом 20, или по 50 мкл исследуемых эритроцитов, приготовленных в соответствии с пунктом 21; 4) установить ID-карты в ротор ID-центрифуги (с обязательным уравновешиванием другими ID-картами, возможно неиспользованными); 5) отцентрифугировать ID-карты (время и скорость центрифугирования постоянны и заданы автоматически); 6) оценить результат исследования. 24. Результат в контрольной микропробирке "ctl" должен быть всегда отрицательным. Положительная реакция в контроле может быть вызвана присутствием аутоантител и неспецифическими плазменными белками. Если контроль положителен - определение недостоверно. Его необходимо повторить после однократного отмывания образцов эритроцитов 0,9 % раствором хлорида натрия или раствором для разведения-2. 25. Результаты определения каждого антигена вносят в соответствующую графу ID-карты (на белом поле внизу под каждым антигеном). 26. Результат идентифицируют согласно таблице 1. Таблица 1 Результаты исследований антигенов группы крови АВJ и резус-принадлежности в ID-карте АВ0/Rh
Примечание: Специфичность исследования подтверждается по отрицательному результату в пробирке с контролем ID-карты. 27. Определение группы крови АВО и резус-принадлежности проводят путем идентификации специфических антигенов и антител (двойная или перекрестная реакция). ^ 28. Пробы на индивидуальную совместимость предотвращают трансфузии гемокомпонентов, несовместимые по антигенам эритроцитов. Проведение такой пробы позволяет: 1) подтвердить АВО-совместимость донора и реципиента; 2) выявить антитела в сыворотке реципиента, направленные против антигенов эритроцитов донора, способные вызвать повреждение перелитых эритроцитов, посттрансфузионные реакции и осложнения гемолитического типа. 29. Тестирование на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента по антигенам эритроцитов не заменяет обязательное иммуногематологическое исследование (типирование антигенов эритроцитов систем АВО, резус, Kell, выявление антиэритроцитарных антител, поиск и идентификацию аллоантиэритроцитарных антител). 30. Пробы на совместимость с использованием свежей сыворотки пациента, полученной после последней трансфузии, проводятся в следующем порядке: 1) выдерживается раствор для разведения-2 до достижения комнатной температуры (20-240С); 2) проводится маркировка ID-карты и пробирки (Ф.И.О. донора и реципиента); 3) готовится 0,8 % суспензия эритроцитов донора и реципиента в растворе для разведения-2, для чего в две маркированные пробирки вносится по 1 мл раствора для разведения-2, добавляется по 10 мкл крови донора и реципиента соответственно, смешивается; 4) снимается защитная фольга с соответствующей ID-карты; 5) добавляется по 50 мкл приготовленной суспензии эритроцитов донора в микропробирки ID-карты 1, 2, 3, 4, 5; 6) добавляется по 50 мкл приготовленной суспензии эритроцитов реципиента в микропробирки ID-карты 4, 5, 6; 7) добавляется по 25 мкл сыворотки или плазмы реципиента в микропробирки ID-карты 1, 2, 3, 6; 8) добавляется 25 мкл раствора для разведения 1 в микропробирку ID-карты 4 (ферментный тест); 9) проводится инкубация в течении 15 минут при температуре 370С; 10) проводится центрифугирование (время и скорость центрифугирования постоянны и заданы автоматически); 11) оцениваются результаты исследования. 31. Оценка совместимости по антигенам А, В, D проводится в микропробирках 1, 2, 3: 1) четкий положительный или отрицательный результат указывает на соответствие антигенов А, В, D эритроцитов крови донора и реципиента; 2) если наблюдается двойная популяция эритроцитов (в одной микропробирке положительный и отрицательный результаты), антигены А, В, D донора и реципиента не идентичны; 3) определение совместимости по антигенам А, В, D действительно только при отрицательной реакции в 6-й микропробирке (аутоконтроль). 32. Учет результатов пробы на совместимость в микропробирках 4, 5: 1) положительный результат в микропробирках ID-карт 4, 5 при отрицательном контроле (микропробирка 6) свидетельствует о несовместимости крови донора и реципиента по антигенам эритроцитов; 2) отрицательный результат в микропробирках ID-карт 4, 5, 6 свидетельствует о совместимости крови донора и реципиента по антигенам эритроцитов; 3) положительная реакция в микропробирке ID-карты 6 (аутоконтроль) требует дальнейшего определения ауто- и аллоантител в сыворотке (плазме) реципиента. 33. Проба на совместимость должна быть проведена для каждого образца крови донора. 34. Ошибки при учете результатов пробы на совместимость: 1) определенные лекарственные средства могут вызывать ложноположительную реакцию Кумбса; 2) при некоторых патологических состояниях у больных может наблюдаться положительная реакция Кумбса; 3) бактериальное или другое загрязнение используемого материала может вызывать ложноположительный или ложноотрицательный результат; 4) остатки фибрина в исследуемых образцах могут связывать неагглютинированные клетки и после центрифугирования образовывать собой тонкую розовую линию на поверхности геля, тогда как большинство клеток будут локализоваться на дне микропробирки; 5) суспензии эритроцитов, имеющие чрезмерную концентрацию, могут вызывать ложноположительные реакции. ^ 35. Групповая принадлежность крови определяется реакцией агглютинации при помощи реактивов, содержащих антитела по отношению к агглютиногенам эритроцитов А и В. Реакция производится при комнатной температуре на плоскости со смачиваемой поверхностью. 36. На пластинку в три точки под обозначениями анти-А, анти-В, анти-АВ помещают по 2 капли (0,1 мл) реагента и рядом по одной капле осадка эритроцитов (0,01-0,02 мл). Сыворотку и эритроциты перемешивают стеклянной палочкой. Пластинку периодически покачивают, наблюдая за ходом реакции в течение 5 минут. По истечении 5 мин в реагирующую смесь можно добавить по 1-2 капли (0,05-0,1 мл) физиологического раствора для снятия возможной неспецифической агрегации эритроцитов. 37. Оценка результата: реакция в каждой капле может быть положительной (наличие агглютинации эритроцитов) и отрицательной (отсутствие агглютинации). Различные сочетания положительных и отрицательных результатов дают возможность судить о групповой принадлежности исследуемой крови (таблица 2). Таблица 2 Групповая принадлежность исследуемой крови
Примечание: Знаком (+) обозначена агглютинация, знаком (-) - ее отсутствие. 38. В тех случаях, когда положительный результат получен с сывороткой всех трех групп, для исключения неспецифической агглютинации производится контрольное исследование со стандартной сывороткой АВО (IV), не содержащей групповых агглютининов. Лишь отсутствие агглютинации в этой контрольной пробе позволяет учесть положительный результат с сыворотками групп Оab (I), Аb (II), Вa (III) как истинный, то есть, принадлежность исследуемой крови к группе АВО (IV). Примечание РЦПИ: a - латинская буква Альфа b - латинская буква Бета ^ 39. Определение группы крови производится с помощью реакции гемаггллютинации на плоскости, в солевой среде или на пластинке. Для определения А и В антигенов эритроцитов используют стандартные реагенты моноклональные антитела (Цоликлоны анти-А и анти-В). 40. В случае определения группы крови системы АВО с помощью моноклональных типирующих реагентов в виду их высокой активности и выраженности агглютинирующего эффекта, а также полной стандартности используют по одной серии Цоликлонов анти-А и анти-В. 41. На пластинке антитела и кровь смешивают в соотношения 10:1 и наблюдают за реакцией агглютинации в течение 3-х минут. 42. Учет результатов реакции гемааглютинации, проведенной с моноклональными АВО- типирующими реагентами: 1) если агглютинации нет ни с Цоликлоном анти-А, ни с Цоликлоном анти-В, то исследуемая кровь принадлежит к группе О (I); 2) если агглютинация наблюдается только с Цоликлоном анти-А, то исследуемая кровь принадлежит к группе А (II); 3) если агглютинация наблюдается только с Цоликлоном анти-В, то исследуемая кровь принадлежит к группе В (III); 4) если агглютинация наблюдается как с Цоликлоном анти-А так и с Цоликлоном анти-В, то исследуемая кровь принадлежит к группе АВ (IV). 43. При подозрении на спонтанную агглютинацию у больных с группой крови АВ (IV) необходимо провести контрольное исследование крови, взяв вместо Цоликлона изотонический раствор хлористого натрия. Реакция агглютинации должна быть отрицательной. ^ 44. Резус-принадлежности определяется в соответствии с инструкцией, прилагаемой к сыворотке антирезус. 45. В лаборатории проводят следующие исследования: 1) реакцию агглютинации на плоскости с Цоликлонами анти-D супер; 2) методом конглютинации с применением желатина; 3) с помощью универсального реагента антирезус. 46. При всех методах определения резус-принадлежности обязательна постановка контролей, а именно включение в реакцию стандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов, а также обязательное исследование крови на возможную аутоагглютинацию, с 10 % раствором желатина (если используется метод с применением желатина) или с 33 % раствором полиглюкина (если используется стандартный универсальный реагент антирезус). ^ 47. Наносят большую каплю (около 0,1 мл) реагента на пластинку или планшет. 48. Наносят рядом маленькую каплю (0,02-0,03 мл) исследуемых эритроцитов. Тщательно смешивают реагент с эритроцитами стеклянной палочкой. 49. Через 10-20 с мягко покачивают пластинку. 50. Результаты реакции учитывают через 3 минуты после смешивания, несмотря на то, что четкая агглютинация наступает в первые 30 секунд. 51. При наличии агглютинации исследуемая кровь маркируется как резус положительная, при отсутствии - как резус отрицательная. 52. Для определения резус-принадлежности ускоренным методом на плоскости при комнатной температуре могут быть использованы поликлональные сыворотки анти-D с неполными антителами, приготовленные в комбинации с коллоидами (альбумином, полиглюкином). ^ 53. Используют реагенты, содержащие неполные поликлональные антитела (сыворотки анти-D) или неполные моноклональные антитела (цоликлоны анти-D). 54. В 2 пробирки вносят по 0,02-0,03 мл осадка эритроцитов, для чего выдавливают из пипетки небольшую каплю эритроцитов и касаются ею дна пробирки. Затем в первую пробирку добавляют 2 капли (0,1 мл) желатина и 2 капли (0,1 мл) реагента, во вторую (контрольную) пробирку добавляют 2 капли (0,1 мл) желатина и 2 капли (0,1 мл) 0,9 % изотонического раствора натрия хлорида. 55. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием, после чего их помещают в водяную баню на 15 минут или термостат на 30 минут при температуре +46 - 480С. По истечении указанного времени в пробирки добавляют по 5-8 мл 0,9 % изотонического раствора натрия хлорида и перемешивают содержимое путем 1-2-кратного переворачивания пробирок. 56. Результат учитывают, просматривая пробирки на свет невооруженным глазом или через лупу. Агглютинация эритроцитов свидетельствует о том, что исследуемый образец крови резус положительный, отсутствие агглютинации - о том, что испытуемая кровь резус отрицательная. В контрольной пробирке агглютинация эритроцитов должна отсутствовать. 57. Для определения резус-принадлежности ускоренным методом в пробирке при комнатной температуре может быть использован универсальный реагент, представляющий собой сыворотку анти-D с неполными антителами, разведенную 33 % полиглюкином. ^ 58. Проба на индивидуальную совместимость позволяет убедиться в том, что у реципиента нет антител, направленных против эритроцитов донора и таким образом предотвратить трансфузию эритроцитов, несовместимых с кровью больного. 59. Проба на совместимость, выполняемая на плоскости при комнатной температуре, имеет целью выявить у реципиента полные групповые агглютинины системы АВО, MNSs, Lewis и другие. 60. Проба на совместимость с применением 10 % желатина, 33 % полиглюкина, непрямая проба Кумбса предназначена для выявления у реципиента неполных групповых антител. 61. Двухэтапная проба в пробирках с антиглобулином предусматривает выявление и тех и других антител, в том числе групповых гемолизинов. 62. Наиболее чувствительной и рекомендуемой является двухэтапная проба в пробирках с антиглобулином, затем комбинация двух проб - пробы на плоскости при комнатной температуре и непрямой пробы Кумбса. 63. Вместо непрямой пробы Кумбса может быть применена реакция конглютинации с 10 % желатином или реакция конглютинации с 33 % полиглюкином. Последняя проба уступает по чувствительности первым двум, однако занимает меньше времени. ^ 64. На первом этапе в маркированную пробирку вносят 2 объема (200 мкл) сыворотки реципиента и 1 объем (100 мкл) 2 % взвеси трижды отмытых эритроцитов донора, суспендированных в 0,9 % изотонического раствора натрия хлорида или LISS (раствор низкой ионной силы). Содержимое пробирки перемешивают и центрифугируют при 2500 об/мин (около 600g) в течение 30 секунд. Затем оценивают наличие гемолиза в надосадочной жидкости, после чего осадок эритроцитов ресуспендируют, слегка постукивая кончиком пальца по дну пробирки, и определяют наличие агглютинации эритроцитов. При отсутствии выраженного гемолиза и/или агглютинации переходят к выполнению второго этапа пробы с использованием антиглобулиновой сыворотки. 65. На втором этапе в пробирку помещают в термостат при температуре 370С на 30 минут, после чего снова оценивают наличие гемолиза и/или агглютинации эритроцитов. Затем эритроциты трижды отмывают 0,9 % изотоническим раствором натрия хлорида, добавляют 2 объема (200 мкл) антиглобулиновой сыворотки для пробы Кумбса и перемешивают. Пробирки центрифугируют в течение 30 секунд, осадок эритроцитов ресуспензируют и оценивают наличие агглютинации. 66. Учет результатов проводят невооруженным глазом или через лупу. Выраженный гемолиз и/или агглютинация эритроцитов указывает на присутствие в сыворотке реципиента групповых гемолизинов и/или агглютининов, направленных против эритроцитов донора, и свидетельствует о несовместимости крови реципиента и донора. Отсутствие гемолиза и/или агглютинации эритроцитов свидетельствует о совместимости крови реципиента и донора. ^ 67. На пластинку наносят 2-3 капли сыворотки реципиента и добавляют небольшое количество эритроцитов с таким расчетом, чтобы соотношение эритроцитов и сыворотки было 1:10 (для удобства рекомендуется сначала выпустить через иглу несколько капель эритроцитов из контейнера на край пластинки, затем оттуда стеклянной палочкой перенести маленькую каплю эритроцитов в сыворотку). Далее эритроциты перемешивают с сывороткой, пластинку слегка покачивают в течение 5 минут, наблюдая за ходом реакции. По истечении указанного времени в реагирующую смесь можно добавить 1-2 капли 0,9 % изотонического раствора натрия хлорида для снятия возможной неспецифической агрегации эритроцитов. 68. Учет результатов. Наличие агглютинации эритроцитов означает, что кровь донора несовместима с кровью реципиента и не должна быть ему перелита. Если по истечении 5 минут агглютинация эритроцитов отсутствует, то это означает, что кровь донора совместима с кровью реципиента по групповым агглютиногенам. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям