Инструкция 2005 «лабораторная диагностика туляремии у людей и выделение возбудителя туляремии из объектов внешней среды» раздел I
|
|
Скачать 0.5 Mb.
|
|
Эпизоотологическое обследование природных Инфомационные данные |
1 2
|
РАЗДЕЛ III ^ ОЧАГОВ ТУЛЯРЕМИИ ГЛАВА 8 МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ 30. При эпизоотологическом обследовании на туляремию исследованию подвергают диких животных, доставленных живыми или найденных мертвыми, гнезда, погадки птиц, помет хищных млекопитающих, солому, продукты, загрязненные выделениями грызунов, а так же воду из естественных водоемов, колодцев. Из членистоногих переносчиков основное внимание уделяют иксодовым клещам, кроме того, исследуют гамазовых клещей, блох, а в пойменно-болотных очагах – кровососущих двукрылых. Домашние животные исследуются по эпизоотологическим и эпидемическим показаниям. Наиболее эффективной и специфичной серологической реакцией для выявления туляремийного антигена при исследовании органов животных, погадок птиц, помете хищных млекопитающих, субстратах гнезд, почвы и тому подобнее является реакция нейтрализации с туляремийным эритроцитарным диагностикумом. При исследовании некоторых объектов (бактериальные суспензии, органы животных и другие) помимо РНАт можно применять ИФА, реакцию объемной агломерации (далее-РОА), реакцию коагглютинации (далее-РК) и некоторые другие методы. Постановка реакций осуществляется согласно методике по их применению. Основные объекты лабораторного исследования: при поисках эпизоотии в первую очередь исследуют высокочувствительных мелких млекопитающих 1 группы (большинство грызунов, зайцеобразные, землеройки); во вторую очередь исследуют малочувствительных к туляремии животных 2-й группы (полевые мыши, серые крысы и др.). Животных второй группы целесообразно помимо бактериологического метода, исследовать серологическими методами; при исследовании животных 3-й группы, хищных млекопитающих - лисиц, ласок, горностаев и других, а также птиц – эффективны серологические методы, направленные на выявление антител. Успех исследований зависит от свежести доставленного материала. Возможно вскрытие зверьков на месте с последующей консервацией для доставки в лабораторию. Консервантом может служить вазелиново-парафиновая смесь (1 часть парафина + 10 частей вазелинового масла, смесь стерилизуют 45 минут на кипящей водяной бане). В качестве консервантов можно также использовать касторовое масло, 5% раствор поваренной соли и др. В консервантах можно сохранять только вполне свежие, не загнившие органы (селезенку, лимфатические узлы) при низких температурах, лучше в замороженном состоянии и не более 1 месяца. Чем выше температура хранения, тем быстрее отмирают туляремийные бактерии. У животных добытых живыми основу диагностики туляремии, составляет биологическое исследование. При этом применяют групповое исследование 5-10 зверьков одного вида и пойманных в одном месте. Для исследования используются кусочки селезенки, лимфатические узлы. Отобранные органы кладут в стерильную ступку, добавляют небольшое количество стерильного песка (для улучшения растирания), физиологического раствора (0,5 мл на 0,1г органов) и смешивают в гомогенную массу. Через небольшой кусочек стерильной ваты 0,5 мл взвеси набирают в шприц и вводят белой мыши под кожу паховой области правой ноги. Органы животных, у которых при вскрытии обнаружены патологоанатомические изменения, исследуются индивидуально от каждого зверька. В этом случае кроме биологичекого метода применяют посев и люминесцентную микроскопию. Зверьков погибших в природе или павших в лаборатории подвергают индивидуальному исследованию. При исследовании трупов животных сочетают разные методы в зависимости от задач и технических возможностей (возможно выявление возбудителя туляремии путем бактериоскопии мазков отпечатков органов). В случае плохой сохранности трупа прибегают к биологическому методу исследования. Трупы животных 2-3 групп исследуют биологическим методом, позволяющим выявить даже единичные бактерии туляремии. Мумифицированные трупы животных, гнездовой материал обнаруженные при обследовании природных очагов туляремии серологическими методами (РПГА, РНАт, РНАг). С целью рекогносцировочного обследования значительных территорий на туляремию особенно эффективен метод серологического исследования погадок птиц и помета хищных млекопитающих. Он позволяет быстро обследовать значительные территории и получить ответ о наличии или отсутствии эпизоотии туляремии. Для исследования погадок и помета рекомендуется использовать РНАт (с антигенным диагностикумом). Использование РПГА с иммуноглобулиновым эритроцитарным диагностикумом дает большое количество неспецифических результатов. Исследование кровососущих членистоногих и беспозвоночных животных – гидробионтов. Добытых в природе насекомых, а также снятых с млекопитающих эктопаразитов исследуют в день доставки в лабораторию или не позднее следующего дня. Лишь иксодовых клещей можно сохранять живыми в пробирках на холоду 1-2 недели. Беспозвоночных животных перед бактериологическим исследованием определяют до рода или до вида и группируют в отдельные пробы. В одной пробе должны быть животные одного рода (вида), добытые из одного места. В данном случае наиболее эффективен биологический метод исследования. Иксодовые клещи. Сбор клещей производят в природных стациях путем поимки на фланелевый (марлевый флаг) или путем сбора с диких или домашних животных. Клещей собирают в пробирки или чистые стеклянные банки с корковой пробкой. Для сохранения клещей на дно пробирки (банки) помещают увлажненные древесные опилки и сохраняют на холоду. Перед бактериологическим исследование взрослых клещей усыпляют эфиром, затем в количестве 50 штук в один анализ, помещают в чистую пробирку и приливают 10-15 мл этилового спирта, встряхиванием промывают в течение 0.5-1 минуты и спирт сливают. Затем производят повторную промывку клещей спиртом, после чего 3 раза таким же образом промывают в стерильной дистиллированной воде. Отмытых клещей помещают в стерильную ступку и растирают пестиком в кашицу. Клещей с твердой хитиновой оболочкой или сильно упитанных кровью предварительно измельчают стерильными ножницами. При этом ступку прикрывают чашкой Петре, чтобы избежать разбрызгивания. К растертой массе добавляют 5 мл физиологического раствора и размешивают до однородной суспензии, если суспензия слишком густая, можно добавить еще 2-3 мл физиологического раствора. Суспензию набирают через небольшой кусочек стерильной ваты и вводят биопробному животному. Кровососущие двукрылые (слепни, комары, мошки). Доставленных на исследование насекомых слегка усыпляют парами эфира для ограничения подвижности. У слепней предварительно отстригают ноги и крылья. В один анализ включают 25-50 слепней или 100 комаров или 250 мошек. Насекомых растирают в ступке, добавляют до 5 мл физиологического раствора, полученную суспензию вводят биопробному животному. Беспозвоночные животные – гидробионты. Гидробионтов, ручейников, бокоплавов и других перед исследованием промывают в нескольких порциях воды и 1-2-х порциях стерильной дистиллированной воды. У животных, имеющих на теле чехлики или раковины, последние удаляют. Животных объединяют в группы по 5-10-20 экземпляров в зависимости от размеров особей, растирают в ступке, добавляют физиологический раствор и полученную суспензию вводят биопробному животному. 31. Исследование объектов внешней среды: пробы воды отбирают из различных водоемов: речек, ручьев, прудов, мелиоративных каналов, окраин озер, болот и так далее. Из одной точки необходимо брать по 2 и более пробы. Воду в количестве 100-200 мл отбирают в стерильные бутылочки емкостью 250 мл, закрывают резиновой пробкой, закрывают бумажным колпачком и обвязывают шпагатом. Бутылочки упаковывают в полиэтиленовые мешки, металлические ящики для доставки в лабораторию. Для избежания контаминации последующих проб, руки (перчатки) и инвентарь обрабатывают ватным тампоном, смоченным 70º спиртом. Исследование воды производят в день доставки воды биологическим методом. Для этого белой мыши вводят подкожно до 1 мл воды. От каждой пробы желательно поставить не менее 2-х биопроб; зерно, солома, другие субстраты. С зерна, соломы и других субстратов делают смыв физиологическим раствором. Для этого 5-10 г исследуемого субстрата кладут в стерильный сосуд, заливают двойным по весу количеством физиологического раствора и тщательно встряхивают. Смыв набирают в шприц через кусочек стерильной ваты и вводят биопробному животному; исследование домашних животных. Домашние животные относятся к видам, малочувствительным к туляремии. При их исследовании используют в основном серологические методы (РА и РПГА), а также внутрикожную пробу с тулярином. Посевы из органов или биологические пробы применяют только при исследовании павших или убитых больных животных. При серологическом исследовании домашних животных следует учитывать возможность обнаружения перекрестных реакций с бруцеллезом, а также принимать во внимание возможность выявления неспецифических реакций в начальных разведениях сыворотки. Целесообразно исследовать сыворотки этих животных в РА и РПГА, считая диагностическими титры в РА - 1:20 и в РПГА - 1:160 и выше. У свиней и овец серологическое обследование применяют в сочетании с внутрикожной пробой с тулярином. Титры антител у переболевших диких животных колеблются в пределах 1:10 - 1:320, редко выше, в зависимости от давности заболевания. У сельскохозяйственных животных они могут достигать 1:320 - 1:640, но чаще бывают низкими. Для выявления антител у животных могут быть использованы сыворотка, плазма или «смывы» из грудной полости. Наличие антител у животных указывает на контакт животного с возбудителем туляремии и наличие эпизоотии. Приложение 1 к Инструкции 4.2. 2005 «лабораторная диагностика туляремии у людей и выделение возбудителя из объектов внешней среды» Рецепты питательных сред Свернутая желточная среда Маккоя. Среду готовят из желтков куриных яиц, которые тщательно моют, протирают спиртом, обжигают на пламени горелки, разбивают, сливают желтки, отделяя их от белка, в стерильный градуированный сосуд, смешивают с физиологическим раствором (рН 7,0-7,2) в соотношении: 60% желтка и 40% физиологического раствора. Жидкую среду разливают в пробирки по 4-5 мл и помещают в аппарат для свертывания сывороток при наклонном положении пробирок, чем достигают скашивания среды. Свертывание среды производят при 80º С в течение 1 часа. Среду сохраняют при 4º С, предохраняя от высыхания. Правильно приготовленная среда должна иметь на дне пробирки конденсационную жидкость. Приготовленную среду можно использовать в течение 1 месяца. Для выделения и культивирования туляремийного микроба используют также агаровую среду с добавлением желтка. Среда готовится на основе сухого питательного агара Иркутского НИПЧИ: на 100 мл стерильного, расплавленного и охлажденного до 45ºС агара добавляют 5 мл куриного желтка с физиологическим раствором (в соотношении 3:2). Для культивирования туляремийных бактерий применяются различные варианты агаровых сред на рыбных, мясных, дрожжевых основах с обязательным добавлением цистина (цистеина) 0,1%; глюкозы 1%; дрожжевого экстракта (источник витамина В). Чувствительность указанных агаровых сред можно повысить добавлением дефибринированной кроличьей или лошадиной крови (5-10%). Разработаны и используются на практике питательные сухие агаровые среды для культивирования и выделения туляремийного микроба, содержащие все необходимые факторы роста и не требующие добавления крови (или желтка). Кровяная среда Емельяновой. Среду готовят на рыбно-дрожжевом гидролизате. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 20 мл гидролизата свежей рыбы, 10 мл гидролизата желатины, 2,5 мл аутолизата дрожжей, 0,5 г хлорида натрия, 1 г глюкозы, 0,1 г цистина (цистеина), 1,5-2,5 г агара (в зависимости от его качества); рН среды 7,0-7,2. После стерилизации в расплавленную и охлажденную до 45º С среду добавляют 10 мл свежей кроличьей или лошадиной дефибринированной крови, разливают в пробирки (или чашки) и скашивают. Правильно приготовленная кровяная среда хранится при 4-6 ºС в течение 1 месяца. Однако в процессе хранения чувствительность среды постепенно снижается. При необходимости в среду одновременно с кровью добавляют селективные добавки. FT - агар. Питательная среда выпускается в виде комплекта, состоящего из рыбно-солевого агара, глюкозо-витаминной добавки и селективной добавки. Состав и способ приготовления среды полностью описаны в инструкции по применению FT- агара, прилагаемой к комплекту. Приложение 2 к Инструкции 4.2. 2005 «лабораторная диагностика туляремии у людей и выделение возбудителя из объектов внешней среды» Подготовка материала к исследованию При исследовании трупов диких или лабораторных животных готовят суспензию из кусочков органов животных (селезенка, печень) путем растирания их в ступке с добавлением физиологического раствора из расчета 1:5 или 1:10. Полученную суспензию прогревают на кипящей водяной бане 10-15 мин, фильтруют (лучше через асбестовую вату) для получения относительно прозрачного фильтрата. Можно использовать остатки суспензии из органов, приготовленных для постановки биологической пробы. Для исследования субстрата гнезда грызунов желательно брать его целиком вместе с прилегающими слоями почвы. Материал заливают физиологическим раствором с избытком (примерно 10 мл). Через 1-6 часов надосадочную жидкость отсасывают, прогревают на кипящей водяной бане 10-15 мин, фильтруют и используют в серологических реакциях. Для серологического исследования бактериальной культуры последнюю выращивают 2 суток при 37 º С на желточной или агаровой среде, готовят взвесь на физиологическом растворе (рН 7,0-7,2) с концентрацией 10 (в степени 9) м.кл./мл по оптическому стандарту мутности, обеззараживают прогреванием 10-15 мин на кипящей водяной бане. Взвесь разводят в 10 раз до концентрации 100 млн. м.кл./мл, которую используют в серологических реакциях. Погадки птиц и помет хищных млекопитающих. Каждую погадку или пробу помета исследуют индивидуально. После поступления в лабораторию материал просушивают при комнатной температуре и взвешивают с точностью до 0,1 г на рычажных или пружинных весах. При последующем добавлении физиологического раствора следует учитывать вес погадки для получения исходного разведения 1: 5 (или 1:10). Дальнейшую обработку можно проводить двумя способами: Взвешенный образец помещают в пакетик из тонкой полиэтиленовой пленки, размер которого определяется величиной исследуемого объекта. В пакет шприцем вводят подогретый до 70º С физиологический раствор рН 7,2 (лучше забуференный) в необходимом количестве. При использовании холодного физиологического раствора титры реакций в положительном случае будут на 1-2 разведения ниже. Содержимое пакета растирают в однородную массу и через 20-30 мин сливают в пробирку для центрифугирования. Суспензию прогревают на кипящей водяной бане 10-15 мин и после охлаждения адсорбируют взвесью 50% формализированных бараньих эритроцитов (2 капли эритроцитов на 1 мл суспензии). Смесь выдерживают 1 час при комнатной температуре, после чего центрифугируют 10-15 мин при 2000 об/мин. Полученную прозрачную надосадочную жидкость используют для постановки реакции. При отсутствии полиэтиленовой пленки для пакетиков или центрифуги подготовить материал к исследованию можно другим способом, который, однако, более трудоемок. Погадку или пробу помета растирают пестиком в фарфоровой ступке, добавляя расчетное количество подогретого до 70ºС физиологического раствора (рН 7,2). Полученную суспензию отсасывают пастеровской пипеткой через ватный тампон, переносят в пробирку и прогревают 10-15 мин на кипящей водяной бане. Суспензию фильтруют через асбестовую вату до получения относительно прозрачной жидкости. Использование в реакции такого фильтрата, как правило, не дает неспецифических результатов даже в начальных разведениях, поэтому дополнительная обработка суспензии формализированными эритроцитами не требуется. ОГЛАВЛЕНИЕ Инструкция 4.2. 2005 «Лабораторная диагностика туляремии у людей и выделение возбудителя из объектов внешней среды»
^ 1.Настоящая Инструкция разработана специалистами Министерства здравоохранения Республики Беларусь (Мазик М.М., Кожемякин А.К.), ГУ «Республиканский центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья» (Пашкович В.В., Гулин В.В., Клавсуть Г.А., Павлюченко С.П), ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» (Титов Л.П., Петкевич А.С., Владыко А.С., Капитулец С.П), ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования» (Коломиец Н.Д., Тонко О.В), ГУ «Гомельский областной центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья» (Кирилова Л.Е., Науменко Т.В.) 2.Утверждена постановлением Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь от …………. 2005 № 3. Введена взамен Инструкции по лабораторной диагностике туляремии у людей № 28-6/3, утвержденной заместителем Министра здравоохранения СССР 25 июня 1981 г. |
1 2
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям