Оптимизация микробиологических исследований для повышения эффективности диагностики гонококковой инфекции 14. 01. 10 кожные и венерические болезни
|
Скачать 385.39 Kb.
|
|
На правах рукописи ПОЛЕВЩИКОВА Светлана Алексеевна ОПТИМИЗАЦИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДИАГНОСТИКИ ГОНОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ 14.01.10 – кожные и венерические болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва, 2012 г. Работа выполнена в отделах лабораторной диагностики инфекций, передаваемых половым путем, и болезней кожи и отделении урогенитальных инфекционных заболеваний Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научный центр дерматологии и косметологии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Ведущая организация: Российский Университет Дружбы Народов, г. Москва Защита диссертации состоится «___»__________ 2012 года на заседании Диссертационного совета (Д 208.115.01) при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Государственный научный центр дерматологии и косметологии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России) по адресу:107076, г. Москва, ул. Короленко, д.3, стр.6. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России Автореферат разослан «____»_________ 2012г. Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук Наталия Константиновна Иванова ^ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Несмотря на наблюдаемую в последние десятилетия тенденцию к снижению заболеваемости гонококковой инфекцией в Российской Федерации, уровень заболеваемости продолжает оставаться достаточно высоким (по данным государственной статистики, в 2010 году он составил 42,7 случаев на 100 000 населения), существенно превышая показатели заболеваемости в странах Европы и СНГ. В некоторых Федеральных округах уровень заболеваемости гонококковой инфекцией существенно превышает заболеваемость по России в целом (Ресурсы и деятельность кожно-венерологических учреждений. Заболеваемость за 2009 – 2010 годы (статистические материалы). Выявление гонококковой инфекции во многом зависит от организации работы клинико-диагностических/бактериологических лабораторий и качества лабораторных исследований, направленных на выявление больных гонококковой инфекцией (А.А. Кубанова, 2004, А.А. Кубанова, 2008, Н.В. Фриго и соав., 2008) Важным для оценки качества проведения лабораторных исследований с целью диагностики гонококковой инфекции является изучение ресурсного обеспечения лабораторий, правильности и адекватности применяемых методов диагностики и разработка мероприятий, направленных на стандартизацию исследований. Ведущим регламентированным методом в диагностике гонококковой инфекции в Российской Федерации в настоящее время продолжает оставаться культуральный метод исследования (Васильев М.М. 1998, Дмитриев Г.А. 2003, Савичева А.М. и др. 2004, Unemo M. et al, 2006, Pope C.F. et al, 2010), однако качество диагностики, осуществляемой с использованием данного метода, зависит от качества применяемых питательных сред. В настоящее время при осуществлении культурального метода применяются неселективные питательные среды, включающие питательные вещества, необходимые для роста гонококка, и селективные питательные среды, включающие дополнительно антибиотики, которые необходимы для подавления роста сопутствующей микрофлоры. Отечественной промышленностью производятся только неселективные среды, что приводит к ложноотрицательным результатам исследования за счет подавления роста гонококка вследствие конкурентных взаимоотношений между микроорганизмами (Поляк М.С. и соав., 2003, Савичева А.М. и соав., 2004, Черкасова Л.С., 2008, Unemo M. et al, 2006). Низкий уровень лабораторных исследований при диагностике гонококковой инфекции может быть также обусловлен отсутствием эффективной системы контроля их качества, и, прежде всего - разработанных отечественных контрольных штаммов N.gonorrhoeae. Все вышеперечисленное определяет актуальность проведения исследований, направленных на повышение качества и эффективности микробиологических исследований при диагностике гонококковой инфекции. Цель исследования Разработка методов и путей повышения эффективности микробиологических исследований для диагностики гонококковой инфекции, внутрилабораторного и внешнего контроля качества и их стандартизация. Задачи исследования
^
^ Научная новизна исследования заключается в разработке стандартизированных условий проведения всех этапов лабораторных исследований для выделения и идентификации возбудителя гонококковой инфекции. Впервые предложена отечественная селективная добавка к питательной среде для выделения и культивирования N.gonorrhoeae. Впервые созданы контрольные штаммы возбудителя гонококковой инфекции, охарактеризованные по морфологическим свойствам и показателям чувствительности к антимикробным препаратам. ^ Впервые в современных условиях произведена оценка ресурсного обеспечения клинико-диагностических/бактериологических лабораторий медицинских организаций дерматовенерологического профиля, осуществляющих лабораторную диагностику гонококковой инфекции на территории Российской Федерации, и применяемых методов исследований для диагностики гонококковой инфекции; требования к условиям организации деятельности лабораторий легли в основу Приказа Минздравсоцразвития № 1087н от 29.09.2011 года «О внесении изменения в Порядок оказания медицинской помощи больным дерматовенерологического профиля», утвержденный приказом Минздравсоцразвития России от 16 марта 2010 года № 151н». Впервые разработаны и внедрены в практику методические материалы, позволяющие стандартизованным способом осуществлять все этапы микробиологических лабораторных исследований. Впервые для осуществления внутрилабораторного и внешнего контроля качества проведения лабораторных исследований с целью диагностики гонококковой инфекции созданы отечественные контрольные штаммы возбудителя гонококковой инфекции, охарактеризованные по морфологическим свойствам и чувствительности к антимикробным препаратам. ^ Стандартные операционные процедуры по забору биологического материала у пациентов с подозрением на гонококковую инфекцию; транспортировке биологического материала и выделенных культур возбудителя гонококковой инфекции; проведению видовой идентификации возбудителя гонококковой инфекции с использованием бактериоскопического и культурального методов; определению чувствительности гонококка к антимикробным препаратам, а также «Стандартные требования к организации деятельности лабораторий, осуществляющих диагностику ИППП» внедрены в практику работы Лабораторного центра ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России и в клинико-диагностические и бактериологические лаборатории специализированных медицинских учреждений дерматовенерологического профиля (ОГУЗ «Томский ОКВД», ГУЗ «РККВД» республики Чувашия, ГУЗ «ККВД» Краснодарского края, ГУЗ «Архангельский ОККВД», ГУЗ «Брянский ОКВД», ГУЗ «Ставропольский КККВД», ГУЗ «Калужский ОКВД», осуществляющих микробиологические исследования при диагностике гонококковой инфекции. Разработаны и получены патенты: № 2380407 «Селективная добавка к питательной среде для выделения и культивирования Neisseria gonorrhoeae»; № 2440411 «Контрольный штамм N. gonorrhoeae для осуществления внутрилабораторного контроля качества диагностики гонококковой инфекции бактериологическим (культуральным) методом». Подготовлена и зарегистрирована заявка на патент № 2010141945 «Контрольная панель штаммов ^ для осуществления внутрилабораторного и внешнего контроля качества при определении чувствительности N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам» (приоритет от 14.10.2010г.). Результаты работы использованы при подготовке Приказа Минздравсоцразвития № 1087н от 29.09.2011 года «О внесении изменения в Порядок оказания медицинской помощи больным дерматовенерологического профиля», утвержденный приказом Минздравсоцразвития России от 16 марта 2010 года № 151н». ^ Результаты проведенного исследования доложены на: II Всероссийском конгрессе дерматовенерологов, 25-28 сентября 2007 г., г. Санкт-Петербург; Научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года». 28-30 сентября 2009 г. Москва; III Всероссийском конгрессе дерматовенерологов, 27-30 октября 2009 г., г. Казань; XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», 12-16 апреля 2010 г, г. Москва; XII Международном конгрессе по антимикробной терапии МАКМАХ/ESCMID, 18-20 мая 2010 г., г. Москва; Научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии и косметологии», 9-10 сентября 2010 г., г. Томск; XI Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов, 9-12 ноября 2010 г., г. Екатеринбург; 2-ом Континентальном конгрессе дерматологов международного дерматологического общества, 4-ом Всероссийском конгрессе дерматовенерологов 6-9 июля 2011 г., г. Санкт-Петербург; 17th ISSTDR Meeting (10th IUSTI World Congress) USA, Seattle, 2007; Spring Meeting. N-York, 7-10.05.2008 Sex Transm Inf 2008; Сonference on Sexually Transmitted Infections and HIV/AIDS, 24th IUSTI - Europe, 4th-6th 2008, Milan; ISSTDR/in conjunction with BASHH , London, 2009; 25th IUSTI-Europe Conference, Tbilisi, Georgia, 2010; 19th ISSTDR, Quebec, Canada, 2011. ПУБЛИКАЦИИ Результаты диссертационного исследования отражены в 29 публикациях, в том числе в 5 статьях, опубликованных в изданиях, рекомендованных ВАК России. ^ Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, 7 глав, содержащих результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические рекомендации, заключение и список литературы. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 6 рисунками. Список литературы содержит 142 источника, в том числе 43 отечественных и 99 зарубежных авторов. ^ ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ Данное исследование осуществлялось в несколько этапов. На первом этапе с целью оценки ресурсного обеспечения клинико-диагностических/бактериологических лабораторий и правильности организации их работы при проведении микробиологических исследований для диагностики гонококковой инфекции были разработаны стандартные требования к организации деятельности лабораторий, осуществляющих диагностику ИППП. ^ проводилось анкетирование 86 клинико-диагностических/бактериологических лабораторий, выполняющих лабораторные исследования по выявлению возбудителя гонококковой инфекции в специализированных медицинских учреждениях дерматовенерологического профиля субъектов Российской Федерации, по вопросам ресурсного обеспечения лабораторий и применяемых методов диагностики гонококковой инфекции. ^ была осуществлена разработка селективной добавки к питательной среде для выделения и культивирования N. gonorrhoeae, которая включала: - подбор компонентов и концентраций препаратов для включения в состав селективной добавки к питательной среде для выделения и культивирования N. gonorrhoeae; - разработку технологии приготовления и выбор оптимальной формы выпуска селективной добавки к питательной среде для выделения и культивирования N. gonorrhoeae - оценку ростовых, селективных свойств и стабильности селективной питательной среды с добавкой для выделения и культивирования N. gonorrhoeae; - изучение клинической эффективности (чувствительности и специфичности) селективной питательной среды для выделения и культивирования Neisseria gonorrhoeae с добавкой на биологическом материале, полученном от пациентов. На четвертом этапе выполнения исследования были созданы контрольные штаммы N.gonorrhoeae для осуществления контроля качества проведения микробиологических исследований с целью диагностики гонококковой инфекции. ^ . Материалами исследования явились: - данные анкетирования 86 специализированных медицинских учреждений дерматовенерологического профиля по вопросам материально-технического оснащения, кадрового обеспечения и уровня подготовки специалистов, спектра выполняемых методов исследования и состояния внутрилабораторного и внешнего контроля качества проведения лабораторных исследований; - действующие нормативные документы Министерства здравоохранения, содержащие требования к оснащению лабораторий, осуществляющих исследования для диагностики гонококковой инфекции, оборудованием, медицинским персоналом, и организации их работы (Приказ МЗ СССР № 868 от 19 июня 1986 года, Приказ Минздрава РФ № 380 от 25 декабря 1997 года, Приказ Минздрава РФ № 753 от 01 декабря 2005 года Приказ Минздравмедпрома РФ № 8 от 19 января 1995 года (ред. от 25.12.1997); - методические материалы и рекомендации по стандартизации методов диагностики (рекомендации Международного комитета по стандартизации (ISO) серии 9 000 и 15 000, методические рекомендации ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича по составлению стандартных операционных процедур, СП 3.3.2.1288-03), нормативные документы Минздравсоцразвития России: Приказ Минздравсоцразвития России и Министерства экономики Российской Федерации № 432/512 от 3.12 1999 г., Приказ Минздравсоцразвития России № 267 от 19.06.2003 г); - данные отечественной и зарубежной литературы о составе селективных добавок к питательным средам для выделения и культивирования N.gonorrhoeae; - антимикробные препараты, включенные в состав селективной добавки к питательной среде для выделения и культивирования N.gonorrhoeae и оказывающие ингибирующее влияние на флору, сопутствующую возбудителю гонококковой инфекции - N.gonorrhoeae: полимиксина В сульфат, линкомицина гидрохлорид и нистатин. - селективные и неселективные питательные среды для выделения и культивирования N.gonorrhoeae, в том числе: плотная неселективная «Питательная среда для выделения гонококка сухая», производства ФГУП «НПО Микроген», г. Ставрополь, взятая за основу при получении селективной питательной среды (с добавкой) для выделения и культивирования N.gonorrhoeae; GC-агар, Бектон Дикинсон, США; GC-агар и селективная добавка VCAT, Бектон Дикинсон, США, использованные для сравнительного исследования диагностической эффективности полученной селективной среды; - «Микробиологические паспорта выделенных штаммов N.gonorrhoeae» (n=50), хранящихся в Коллекции штаммов и генетического материала возбудителей ИППП ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России использованные для отбора контрольных штаммов N.gonorrhoeae; - штаммы N. gonorrhoeae (n=76), в том числе 50 штаммов - использованны для изучения ростовых, селективных свойств и стабильности селективной питательной среды для выделения и культивирования N.gonorrhoeae; 25 штаммов, выделенные от больных острой гонококковой инфекцией, – использованы для изучения клинической эффективности селективной питательной среды; контрольный штамм Neisseria gonorrhoeae 49226 из коллекции АТСС использовался в целях стандартизации проведения работ и обеспечения внутрилабораторного контроля качества выполняемых исследований; -лабораторные штаммы (n=26) грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов (S.epidermidis, E.coli и др.) и грибов рода Candida - использованы для оценки селективных свойств, стабильности и (штаммы микроорганизмов, выделенных от больных урогенитальными инфекциями) для оценки клинической эффективности селективной питательной среды для выделения и культивирования N.gonorrhoeae. В настоящей работе были применены следующие методы исследования: - метод анкетирования; -микробиологические методы исследования: микроскопический (бактериоскопический); культуральный (бактериологический); определение чувствительности штаммов N. gonorrhoeae к АМП диско – диффузионным методом и методом серийных разведений в агаре; - методы и технологии получения селективной добавки для выделения и культивирования N. gonorrhoeae (механическое перемешивание, растворение, лиофилизация, паровая и радиационная стерилизация); - статистические методы: результаты анкетирования специализированных медицинских учреждений были обработаны с использованием ПК «IBM / PC Pentium 4» и пакета прикладных программ для статистической обработки «Exel» и «Statistica». Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований включала в себя расчет средних значений показателей (М) с определением средней ошибки (m), среднего квадратичного отклонения (s), достоверности различий между показателями (t, р) с определением достоверности различий с помощью t-критерия Стьюдента. Статистический анализ был проведен с помощью коммерческих пакетов программ Excel (Microsoft Office 2007) на персональном компьютере Пентиум 4. ^ РАЗРАБОТКА СТАНДАРТНЫХ ТРЕБОВАНИЙ К КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИМ/БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИМ ЛАБОРАТОРИЯМ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МЕДИЦИНСКИХ УЧРЕЖДЕНИЙ ДЕРМАТОВЕНЕРОЛОГИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИМ ЛАБОРАТОРНУЮ ИДЕНТИФИКАЦИЮ N.GONORRHOEAE С целью проведения профилактических мероприятий по предотвращению распространения гонококковой инфекции на территории Российской Федерации, выполнения качественных лабораторных исследований, проведения мониторинга антибиотикорезистентности N.gonorrhoeae и оптимизации контроля качества проведения микробиологических исследований для диагностики гонококковой инфекции разработаны стандартные требования к организации деятельности лабораторий, выполняющих исследования по диагностике гонококковой инфекции, в том числе к оснащению типовых бактериологических лабораторий основным и вспомогательным лабораторным оборудованием, к их персоналу и организации работы. Разработка стандартных требований к организации работы клинико-диагностических/бактериологических лабораторий специализированных медицинских учреждений дерматовенерологического профиля направлена на обеспечение оптимальных условий организации их деятельности, улучшение условий материально-технического обеспечения необходимым лабораторным оборудованием и формирование штата специалистов в соответствии с целями и задачами функционирования лабораторий. Разработанные «Стандартные требования к организации деятельности лабораторий, осуществляющих диагностику ИППП» включали разделы: - требования к помещениям лабораторий и соблюдению условий проведения исследований, связанных с выявлением возбудителей инфекционных заболеваний III-IV групп патогенности; - требования к оборудованию лабораторий (табель оснащенности); - требования к персоналу лабораторий; - требования по ведению документации. «Стандартные требования к организации деятельности лабораторий, осуществляющих диагностику ИППП» в 2008 году изданы в виде сборника и внедрены в деятельность специализированных медицинских учреждений дерматовенерологического профиля, принимавших участие в выполнении мероприятий Подпрограммы «Инфекции передаваемые половым путем» Федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с социально-значимыми заболеваниями (2007-2011 годы)». В 2011 году положения «Стандартных требований к организации деятельности лабораторий, осуществляющих диагностику ИППП», касающиеся оснащенности клинико-диагностических/бактериологических лабораторий включены в основу Приказа Минздравсоцразвития № 1087 н от 29.09.2011 года «О внесении изменения в Порядок оказания медицинской помощи больным дерматовенерологического профиля», утвержденный Приказом Минздравсоцразвития России от 16 марта 2010 года № 151 н». РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ РЕСУРСНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ ЛАБОРАТОРИЙ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ МЕДИЦИНСКИХ УЧРЕЖДЕНИЙ ДЕРМАТОВЕНЕРОЛОГИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ И МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ГОНОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ Оценка ресурсного обеспечения в лабораториях проводилась путем сопоставления результатов их анкетирования с положениями «Стандартных требований к организации деятельности лабораторий, осуществляющих диагностику ИППП». Результаты анкетирования клинико-диагностических/бактериологических лабораторий показали, что в их деятельности имеется ряд серьезных недостатков. В результате анкетного опроса установлено: недостаточное снабжение лабораторий необходимым основным и вспомогательным оборудованием (77% лабораторий), по отдельным позициям достигавшее 10,6-31,4%; преобладание приборов с истекшим сроком амортизации (60% лабораторий), низкий уровень оснащения лабораторий современными видами оборудования (40% лабораторий) и персональными компьютерами (81% лабораторий). Выявлено, что лаборатории в недостаточной степени укомплектованы необходимым персоналом. Коэффициент укомплектованности лабораторий врачами клинической лабораторной диагностики составил 0,75, лаборантами 0,65. В ряде лабораторий отсутствовали аттестованные (имеющие категорию) специалисты высшего (36% лабораторий) и среднего звена (26% лабораторий), у 30-35% специалистов нарушалась своевременность прохождения последипломной подготовки. Таким образом, значительная доля специалистов лабораторий не имела права заниматься медицинской деятельностью, что могло повлечь к возникновению ошибок при диагностике гонококковой инфекции. Результаты анкетирования лабораторий по вопросам о применяемых методах исследования для диагностики гонококковой инфекции показали, что наиболее распространенным методом диагностики являлся микроскопический метод, используемый во всех (100%) специализированных медицинских учреждениях дерматовенерологического профиля, что соответствовало тенденциям, отмечаемым в мировой литературе, однако в ряде (4%) лабораторий этот метод являлся единственным методом исследования, что могло служить причиной ошибок при выявлении гонококковой инфекции у женщин, детей и пожилых пациентов, при обследовании которых данный метод обладает низкой чувствительностью и специфичностью. Отмечено недостаточное использование лабораториями высокочувствительных и специфичных методов диагностики гонококковой инфекции (культуральный метод применялся лишь в 75% лабораторий, метод ПЦР - в 35% лабораторий). Отмечен ряд недостатков, связанных с технологией выполнения внутрилабораторного и внешнего контроля качества проведения исследований: - в 20% лабораторий при проведении культурального исследования использовались не разрешенные к медицинскому применению на территории Российской Федерации, не стандартизованные среды собственного (лабораторного) изготовления; - в большинстве (75%) лабораторий при проведении культурального исследования и бактериоскопии не использовались контрольные штаммы N. gonorrhoeae, не проверялось качество питательных сред; - более 40% лабораторий не участвовали в программах внешнего контроля качества диагностики гонококковой инфекции; среди участников таких программ проводился лишь контроль метода микроскопии, т.к., согласно разработкам ФСВОК, контроль качества проведения культурального метода исследования не предусмотрен. Таким образом, выявленные недостатки ресурсного обеспечения клинико-диагностических/бактериологических лабораторий, использования и методологии применяемых методов исследования для диагностики гонококковой инфекции и отсутствие адекватного, соответствующего современным требованиям, контроля качества выполняемых исследований послужили основанием для разработки методов и путей повышения эффективности микробиологических исследований при диагностике гонококковой инфекции. ^ В целях обеспечения проведения качественных микробиологических исследований в специализированных медицинских учреждениях дерматовенерологического профиля на территории РФ в рамках единой методологии необходима стандартизация выполняемых методов исследования. Для этого на основании анализа существующего Российского и международного опыта разработаны стандартные операционные процедуры:
Стандартные операционные процедуры учитывают особенность технологии проведения исследования в условиях отдельной клинико-диагностической/бактериологической лаборатории, имеющей свою организационную структуру, численность персонала, набор производственных помещений и комплектацию лабораторного оборудования, объем и регулярность проведения разных видов лабораторных тестов. СОП выпущены в виде отдельных пособий (Рисунок 1). СОП должны быть утверждены руководителем соответствующего специализированного медицинского учреждения дерматовенерологического профиля и включены в «Руководство по качеству» лаборатории. Разработка и создание «Руководство по качеству» определено действующими Приказами Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Рис. 1. Стандартные операционные процедуры. Разработка СОП позволила: - стандартизовать методы забора биологического материала, его доставки и хранения, осуществление видовой идентификации и определение антибиотикочувствительности возбудителя гонококковой инфекции; - проводить исследования по мониторингу антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae в субъектах РФ в рамках единой методологии и существенно повысить качество диагностики гонококковой инфекции в учреждениях – участниках ФЦП. Это нашло свое отражение в значительном (на 10 %) повышении процента выделения чистых культур N. gonorrhoeae, в ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России из общего числа культур, полученных из учреждений – участников ФЦП в 2010 году в сравнении с 2007 годом. ^ Одной из важных задач, способствующих повышению эффективности микробиологических исследований при диагностике гонококковой инфекции, явилась разработка селективной добавки к питательной среде для выделения и культивирования N. gonorrhoeae. В состав селективной добавки были включены антимикробные и фунгицидные препараты (полимиксин В сульфат, линкомицин гидрохлорид и нистатин), подавляющие рост Грам + и Грам – флоры, а также грибов рода Candida. В результате серии экспериментов были установлены оптимальные концентрации входящих в добавку ингредиентов, которые обеспечивали подавление роста сопутствующей флоры и не оказывали влияния на рост N. gonorrhoeae (таблица 1). Таблица 1 Состав селективной добавки к питательной среде для выделения и культивирования N.gonorrhoeae
При приготовлении селективной добавки к питательной среде для выделения и культивирования N.gonorrhoeae в порошковидной форме производилось механическое смешивание ее компонентов с последующей радиационной стерилизацией. Для приготовления селективной добавки к питательной среде для выделения и культивирования N.gonorrhoeae в жидкой форме производилось растворение ее компонентов в дистиллированной воде с последующей стерилизацией автоклавированием. Приготовление селективной добавки к питательной среде для выделения и культивирования Neisseria gonorrhoeae в лиофильной форме предусматривало смешивание входящих в ее состав компонентов и их лиофилизацию в замороженном состоянии под вакуумом. Полученную селективную добавку вносили в основу питательной среды для выделения гонококка производства ФГУП «НПО Микроген» (г. Ставрополь) и тщательно перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 10 минут. При смешивании разработанной селективной добавки с известной отечественной питательной средой ФГУП «НПО Микроген», разрешенной к медицинскому применению на территории Российской Федерации, была получена селективная среда для выделения и культивирования N. gonorrhoeae. На основании сравнительного анализа простоты изготовления, длительности, и удобств хранения различных форм селективной добавки (в лиофильной, жидкой и порошковидной формах), в качестве оптимальной формы выпуска отобрана порошковидная форма выпуска добавки, быстро (1 час) и просто (механическое перемешивание) изготавливаемая, длительно (в течение не менее 12 месяцев) сохраняющаяся при комнатной температуре (20-250С) без потери стабильности (таблица 2). Таблица 2 ^
Примечание: 1 балл – наиболее простой способ приготовления; 2 балла – средний; 3 балла – наиболее сложный способ приготовления. Критерием диагностической эффективности селективной среды для выделения и культивирования N. gonorrhoeae служили ее ростовые и селективные свойства: способность вызывать рост типичных колоний N. gonorrhoeae при инкубации культур N. gonorrhoeae на среде с добавкой в условиях атмосферы 5-10 % СО2 при 36 - 370С в течение 24 - 48 часов и способность подавлять рост лабораторных штаммов микроорганизмов S.epidermidis, E.coli и С. albicans и не подавлять рост N. gonorrhoeae. В результате экспериментальных исследований было установлено, что ростовые свойства полученной селективной среды соответствуют или даже превышают аналогичные свойства общепризнанных сред зарубежного производства: обильный рост колоний N. gonorrhoeae на среде с разработанной добавкой регистрировался спустя 16, 24, и 48 часов после бактериологического посева (таблица 3). Таблица 3. ^
Примечание: р – достоверность отличий интенсивности роста N. gonorrhoeae на испытуемой среде и других питательных средах. В результате изучения селективных свойств селективной среды для выделения и культивирования N. gonorrhoeae было установлено, что испытуемая среда эффективно подавляет рост штаммов Грам+ и Грам– микроорганизмов и грибов рода Candida и не подавляет роста N. gonorrhoeae, что также соответствовало или даже несколько превышало аналогичные свойства общепризнанных сред зарубежного производства (таблица 4). Таблица 4 ^
Стабильность (т.е. сохранение ростовых и селективных свойств селективной добавки к питательной среде для выделения и культивирования N.gonorrhoeae) изучалась на протяжении 14 месяцев при хранении селективной добавки в жидкой форме при температуре 2-80С, в лиофильной, порошковидной форме при комнатной температуре (20-250С). В целях изучения стабильности селективной добавки к питательной среде для выделения и культивирования N. gonorrhoeae осуществлялись посевы культур N. gonorrhoeae на питательную среду с добавкой через каждые 15 дней на протяжении 14 месяцев с изучением сохранности тинкториальных и морфологических свойств N. gonorrhoeae и селективных свойств среды (наличие или отсутствие роста на испытуемой среде лабораторных штаммов S. epidermidis, E.coli и С. albicans). В результате изучения стабильности селективной среды для выделения и культивирования N. gonorrhoeae отмечено сохранение ростовых и селективных свойств селективной среды на протяжение 14 месяцев хранения в жидкой форме при температуре 2-80С, в лиофильной, порошковидной форме при комнатной температуре (20-250С). Оценка клинической эффективности селективной добавки для выделения и культивирования N. gonorrhoeae проводилась с использованием культур N.gonorrhoeae, полученных от 25 больных острой гонококковой инфекцией, и культур других грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, выделенных от 25 пациентов, не страдающих гонококковой инфекцией. Результаты исследования роста культур N.gonorrhoeae, выделенных из биологического материала, полученного от 25 больных острой гонококковой инфекцией, показали, что на испытуемой среде с разработанной селективной добавкой для выделения и культивирования N.gonorrhoeae отмечался обильный сливной рост микроорганизмов по всей поверхности среды (более 500 колоний) уже после 16-18 часов инкубации. Колонии N. gonorrhoeae были округлой формы, непрозрачные, выпуклые, с блестящей поверхностью, 0,5 – 2 мм в диаметре. Результаты исследования роста других грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, выделенных от 25 пациентов, не страдавших гонококковой инфекцией (бактериальный вагиноз, урогенитальный кандидоз, неспецифический уретрит, кольпит и вагинит), показали, что на испытуемой среде с разработанной селективной добавкой для выделения и культивирования N.gonorrhoeae отсутствовал рост культур данных микроорганизмов, что свидетельствовало о высоких селективных свойствах и специфичности испытуемой селективной среды. Таким образом, в результате оценки клинической эффективности селективной питательной среды для выделения и культивирования N.gonorrhoeae, включающей разработанную селективную добавку к питательной среде, установлена 100% чувствительность и специфичность разработанного диагностикума (рисунок 2).
Рис. 2. Селективная добавка к питательной среде для выделения и культивирования ^ По материалам проведенных разработок получен патент на изобретение № 2380407 «Селективная добавка к питательной среде для выделения и культивирования N. gonorrhoeae». В настоящее время в установленном порядке осуществляются работы по Государственной регистрации селективной добавки к питательной среде для выделения и культивирования N. gonorrhoeae в качестве изделия медицинского назначения. ^ С целью оптимизации внутрилабораторного и внешнего контроля качества проведения микробиологических исследований для диагностики гонококковой инфекции впервые в РФ были созданы отечественные контрольные штаммы N. gonorrhoeae: контрольный (эталонный) штамм N. gonorrhoeae и контрольная панель штаммов N. gonorrhoeae. При создании контрольного штамма N.gonorrhoeae и контрольной панели штаммов N.gonorrhoeae использованы штаммы N.gonorrhoeae, полученные из специализированных медицинских учреждений дерматовенерологического профиля Российской Федерации, находящиеся на хранении в условиях низкой температуры (-70…-80°С) в Коллекции штаммов и генетического материала возбудителей ИППП ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России. Данная коллекция создана в ходе выполнения подпрограммы «Инфекции, передаваемые половым путем» Федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями» в период с 2004 по 2010 г.г. На каждый из штаммов N.gonorrhoeae, хранящийся в коллекции, имеется заполненный «Микробиологический паспорт выделенного штамма N. gonorrhoeae», куда внесены результаты видовой идентификации N.gonorrhoeae, результаты определения чувствительности N.gonorrhoeae к антимикробным препаратам (АМП), а также результаты определения молекулярных маркеров резистентности N.gonorrhoeae к АМП. Для получения контрольных штаммов N.gonorrhoeae проведена ревизия Коллекции, в результате которой на основании анализа Микробиологических паспортов штаммов N.gonorrhoeae отобраны штаммы N.gonorrhoeae, обладающие разным спектром и уровнем чувствительности к АМП: пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину, цефтриаксону, спектиномицину, азитромицину. Всего проанализировано 50 «Микробиологических паспортов выделенных штаммов возбудителя N. gonorrhoeae» и отобрано 7 штаммов N.gonorrhoeae. Контрольный (эталонный) штамм N. gonorrhoeae представляет собой лиофильно- высушенную, чистую культуру гонококка, выделен от больного с неосложненной гонококковой инфекцией до начала его лечения антимикробными препаратами (рис. 3). Контрольный штамм N.gonorrhoeae обладает всеми свойствами, присущими микроорганизму рода Neisseria, вида Gonorrhoeae. Определение культуры N. gonorrhoeae приведено по определителю Bergey's. Штамм чувствителен к антимикробным препаратам: пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину, цефтриаксону, спектиномицину. Контрольный штамм депонирован в Государственную коллекцию микроорганизмов ФГУП «НИИ стандартизации и контроля биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора» под № 283. Рис. 3. Контрольный штамм N. gonorrhoeae для осуществления внутрилабораторного контроля качества микробиологических исследований для диагностики гонококковой инфекции На «Контрольный штамм^ e для осуществления внутрилабораторного контроля качества проведения микробиологических исследований для диагностики гонококковой инфекции культуральным методом» получен патент на изобретение № 2440411. Контрольная панель штаммов N.gonorrhoeae, состоит из 6-и лиофильно высушенных штаммов N. gonorrhoeae с установленным спектром и уровнем чувствительности к антимикробным препаратам, традиционно применяемым для определения чувствительности N. gonorrhoeae. Каждый из штаммов N.gonorrhoeae, входящих в состав контрольной панели, обладает всеми свойствами, присущими микроорганизму рода Neisseria, вида Gonorrhoeae. Определение культуры N. gonorrhoeae приведено по определителю Bergey's. Каждый штамм имеет разный спектр и уровень чувствительности к АМП. Разработана и зарегистрирована заявка на патент «Контрольная панель штаммов N. gonorrhoeae для осуществления внутрилабораторного и внешнего контроля качества при определении чувствительности N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам» (заявка на патент № 2010141945, приоритет от 14.10.2010г.). ВЫВОДЫ 1. Установлено слабое развитие материально-технической базы клинико-диагностических/бактериологических лабораторий специализированных медицинских учреждений дерматовенерологического профиля, неполная укомплектованность квалифицированными кадрами, недостаточное использование культурального метода исследования (в 75% лабораторий) и ПЦР (в 35% лабораторий); применение нестандартизованных питательных сред собственного изготовления; несовершенство внутрилабораторного и внешнего контроля качества лабораторных исследований. 2. Разработанные стандартизованные требования к организации работы, материально-техническим и кадровым ресурсам клинико-диагностических/бактериологических лабораторий специализированных медицинских учреждений дерматовенерологического профиля и к проведению микробиологических исследований при диагностике гонококковой инфекции позволяют унифицировать преаналитический, аналитический и постаналитический этапы микробиологических исследований при диагностике гонококковой инфекции. 3. Разработанная селективная добавка к плотной питательной среде для выделения и культивирования Neisseria gonorrhoeae имеет высокие селективные свойства и повышает эффективность культуральной диагностики гонококковой инфекции. 4. Созданные контрольные штаммы Neisseria gonorrhoeae (контрольный, эталонный штамм Neisseria gonorrhoeae и контрольная панель штаммов ^ охарактеризованные по морфологическим свойствам и имеющие установленный спектр и уровень чувствительности Neisseria gonorrhoeae к антимикробным препаратам, повышают эффективность внутрилабораторного и внешнего контроля качества микробиологических исследований при диагностике гонококковой инфекции. ^
^
^ АМП – антимикробные препараты АТСС – Американская коллекция типовых культур ГИСК им. Л.А.Тарасевича – Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича ^ – стандартная операционная процедура РФ – Российская Федерация ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России - Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации ФГУП «НПО Микроген» - Федеральное Государственное Унитарное предприятие «Научно-производственное объединение Микроген» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации ФЦП – Федеральная целевая программа С. albicans – Candida albicans E.coli – Еscherichia coli N.gonorrhoeae – Neisseria gonorrhoeae S. epidermidis – Staphylococcus epidermidis |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Добавить документ в свой блог или на сайт
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2013
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям