Морфология органов иммуногенеза нерпы байкальской и экспериментальная оценка эффективности ее липидов при разных патологиях 06. 02. 01 диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных
|
|
Скачать 0.58 Mb.
|
|
На правах рукописи Ламажапова Галина Петровна МОРФОЛОГИЯ ОРГАНОВ ИММУНОГЕНЕЗА нерпы байкальской И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЕЕ ЛИПИДОВ ПРИ РАЗНЫХ ПАТОЛОГИЯХ 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Благовещенск – 2011 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Восточно-Сибирский государственный технологический университет»
Защита диссертации состоится 30 _ноября_ 2011 г. в _10_ часов на заседании диссертационного совета Д 220.027.02 при ФГОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет» в Институте ветеринарной медицины и зоотехнии в аудитории 2(а) 5 корпуса по адресу: 675005, г. Благовещенск, ул. Политехническая, 86. E-mail: [email protected]. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет». Автореферат диссертации опубликован на сайте ВАК РФ http//vak.ed.gov.ru. Автореферат разослан ____ __________ 2011 года Ученый секретарь диссертационного совета Самусенко О.Л.
Актуальность работы. Уникальность экологической системы озера Байкал несомненна и признана мировым и российским обществом юридически. В 1996 году озеро и непосредственно примыкающие к нему территории были включены в Список природных объектов Всемирного наследия ЮНЕСКО. В 1999 году принят Закон Российской Федерации «Об охране озера Байкал». В связи с этим, значительное внимание ученых и специалистов, работающих на Байкале в последние годы, уделено исследованию загрязнения озера Байкал, в том числе его биоты. По данным двух независимых групп исследователей (Японии и США, 1991-2000 гг.) байкальские воды можно отнести к чистым. Оказалось, что концентрации основных экотоксикантов в водах Байкала по порядку величин были такими же, как найденные в Северном Ледовитом океане, и сопоставимы с теми, которые были найдены в озерах Верхнее и Гурон из системы Великих озер Северной Америки (Грачев М.А., 2002). Имеющиеся наблюдения по динамике численности живых организмов на протяжении длительного времени не выявили достоверных изменений населяющих Байкал популяций за время, прошедшее с начала промышленной революции. Можно предполагать, что эти популяции существенно не изменяются и не изменятся под действием химических антропогенных факторов и в ближайшие десятилетия. Регулярный мониторинг фито- и зоопланктона пока не дал информации, которая требовала бы принятия неотложных практических решений (Грачев М.А., 2002). Несмотря на это, никак нельзя рекомендовать его прекращение. Более того, по нашему мнению, необходимо расширение и углубление разработок и исследований по поиску более чувствительных и интегральных методов мониторинга экосистемы озера. Уникальной особенностью пресноводной экосистемы Байкала является наличие в ней эндемичного байкальского тюленя - нерпы (^ Gmel.), единственного млекопитающего, и, поэтому, высшего звена пищевой цепи. В последние годы биология байкальской нерпы достаточно хорошо изучена, в особенности благодаря работам В.Д. Пастухова (1993) и его учеников (Петров Е.А., 1997; 1998 и др.). Численность нерпы, определенная по методике Пастухова В.Д. (1993) в модификации Петрова Е.А. (1998), после 1972 года варьирует в пределах от 70 до 140 тысяч особей. Большое внимание общественности к благополучию популяции байкальской нерпы было привлечено осенью 1987 - зимой 1988 гг., так как в это время произошла массовая гибель этих животных. Возникли подозрения, что гибель нерпы вызвана поступившими в Байкал неизвестными ядовитыми веществами. Но применение методов молекулярной биологии позволило однозначно установить, что причиной массовой гибели являлся мoрбилливирус, аналогичный вирусу чумы плотоядных и родственный вирусу кори человека. В литературе иногда высказываются предположения, что байкальские тюлени в те годы были поражены морбилливирусами по причине ослабления их иммунитета из-за накопления высоких концентраций хлорорганических веществ (Nakata Sh. et al., 1997). Такое предположение имеет право на существование, поскольку известно, что хлорорганические вещества относятся к иммунотоксикантам, так как органами-мишенями являются органы иммунной системы. Однако убедительных доказательств взаимосвязи морбилливирусных эпизоотий с накоплением хлорорганических веществ в тканях животных до настоящего времени не получено. В этой связи состояние иммунной системы, ответственной за поддержание внутренней среды организма, является чувствительным показателем влияния химического и биологического загрязнения. В настоящее время иммунный статус байкальской нерпы практически остается не изученным. По-прежнему отсутствует четкая картина по морфологии и цитоархитектонике органов иммунной системы. Имеющиеся в литературе данные отрывочны и недостаточны для решения проблем охраны здоровья, сохранения и рационального использования данного вида тюленей. Для сохранения биоразнообразия и биоравновесия экосистемы озера Байкал популяция байкальской нерпы поддерживается в определенных пределах путем санитарного отлова строго ограниченного количества животных – в пределах от 1-3 до 6 тысяч особей в год. Животное добывается с целью получения меха, а остальная часть (жир и внутренние органы) в лучшем случае направляется на зверофермы. Вместе с тем, ткани байкальской нерпы (подкожное сало и печень) являются перспективными источниками биологически активных полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК). Исследования химического состава показали, что они содержат достаточное количество ω-6 и ω-3 ПНЖК в оптимальных соотношениях – 3.19:1 (в печени) и 0.77 (в жире). Исследованиями многих ученых (Антонов В.Ф., 1982; Vaugn, D.M., 1994; Левачев М.М., 1999; Тутельян В.А., 1999; Погожева А.В., 2004; Wijendran V., Hayes K.C., 2004; Титов В.Н., 2005; Chaplin S., 2005; Sampath H., Ntambi J.V., 2005; Шендеров Б.А., 2008 и др.) доказана роль ПНЖК в поддержании нормальной деятельности клеточных мембран как обязательных компонентов клетки, а также в оптимизации мембранных и других клеточных процессов, и соответственно, в развитии адаптационных реакций при различных патологических состояниях. Создание супрамолекулярных наноразмерных систем, таких как липосом на основе липидов нерпы, содержащих ПНЖК, решает задачи целенаправленной доставки биологически активных соединений в патологические очаги организма. Наличие тропности и других свойств у липосомальных форм биологически активных веществ и лекарственных препаратов дает ряд преимуществ по сравнению с применением их в интактном виде, что изучено многими учеными (Торчилин В.П., 1982; Грегориадис Г., Аллисон Л., 1983; Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д., 1986; Zhang L. et al., 1997; Каплун А.П. с соавт., 1999; Ramadas M. et al., 2000; Манаенков О.В., 2006; Баллюзек Ф.В. с соавт., 2008; Селина О.Е. с соавт., 2008; Швец В.И. с соавт., 2008; Зайцев С.Ю., 2010 Сейфулла Р.Д., 2010 и др.). Эффективность воздействия липосом обусловлена возможностью их проникновения в ткани и клетки-мишени. Таким путем может быть обеспечена доставка не только полезных для организма липидов, из которых состоит липосомальная мембрана, но и других веществ, транспортируемых липосомами. Значимость и необходимость исследований по данной работе подтверждается государственной поддержкой в следующих грантах и программах: - «Исследование иммунного статуса байкальской нерпы в системе биомониторинга озера Байкал» (гранты по приоритетным направлениям науки для молодых ученых ВСГТУ, 2000 и 2005 гг.); - «Получение гистоморфологических показателей органов иммунной системы байкальской нерпы» (Федеральные целевые программы «Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки на 1997-2000 гг.», 1999 г. и «Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 годы», 2003 г.); - «Разработать способы получения и использования вторичных источников местного сырья животного и растительного происхождения в качестве иммунопротекторов», 1996-2000 гг. и «Разработка и исследование эффективности новых липосомальных форм биологически активных веществ», 2003-2005 гг. (Региональная научно-техническая программа «Бурятия. Наука и техника»); - «Проведение экспедиционных исследований эндемиков озера Байкал как биоиндикаторов его системы (Федеральная целевая программа «Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 годы», 2001 г.); - «Проведение экспедиционных исследований эндемиков озера Байкал» (Международный экспедиционный проект СО РАН, 2002 г.); - «Разработка рекомендаций по использованию нетрадиционных индикаторов в практике государственного экологического контроля и мониторинга окружающей среды на основе анализа влияния загрязнений озера Байкал на состояние особо ценных биологических компонентов экосистем» (Федеральная целевая программа «Экология и природные ресурсы России», подпрограмма «Охрана озера Байкал и Байкальской природной территории», 2003 г.); - РИ-111/001/009 «Выполнение разработки метода получения пролипосом, содержащих жир байкальской нерпы» (Федеральная целевая научно-техническая программа «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы), 2005 г.; - «Иммуноморфологические особенности организма при воздействии компонентов функционального питания», 2006-2007 гг., «Разработка наноформ биологически активных веществ природного происхождения», 2008-2010 гг. (Аналитическая ведомственная целевая программа «Развитие научного потенциала высшей школы» Мероприятие 1). Целью настоящей работы явилось исследование морфологии органов иммунной системы и лимфоидных структур кишечника байкальской нерпы, а также оценка эффективности липосом на основе липидов нерпы при различных патологиях. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи: 1. Изучить гистоморфологические особенности структурной организации органов иммунной системы (тимуса, селезенки, лимфатических узлов) и лимфоидной ткани, ассоциированной со стенками кишечника, байкальской нерпы. 2. Установить особенности развития органов иммуногенеза и лимфоидных структур кишечника байкальской нерпы в постнатальном онтогенезе. 3. Определить характер изменения иммуноморфологических реакций в лимфоидных структурах кишечника байкальской нерпы под влиянием биогенных факторов среды (сапрофитной микрофлоры кишечника и паразитофауны желудочно-кишечного тракта). 4. Исследовать биологическую активность липосом из вторичного липидного сырья байкальской нерпы (покровного жира и жира печени), содержащего уникальное соотношение ω-6/ω-3 жирных кислот. 5. Исследовать фармакотерапевтическую эффективность (гепатопротекторное, ранозаживляющее и адаптогенное действие) липосомальных биологически активных средств на основе липидов нерпы. 6. Исследовать возможность использования липосом на основе ПНЖК жира нерпы для повышения эффективности биологически активных средств (пептидного биорегулятора и растительных средств, обладающих противовоспалительным, ранозаживляющим и адаптогенным действиями). ^ Впервые исследованы морфология и цитоархитектоника тимуса, селезенки, брыжеечных лимфатических узлов, а также структурных элементов диффузной лимфоидной ткани, ассоциированной со стенками пищеварительного тракта байкальской нерпы (Pusa sibirica Gmel.). Впервые раскрыты особенности строения, возрастные и половые различия органов иммунопоэза байкальской нерпы. Изучены изменения в лимфоидных структурах пищеварительного тракта нерпы, связанные с глистной инвазией и влиянием сапрофитной микрофлоры. Теоретически обоснована возможность использования ценного по оптимальному содержанию ω-3 и ω-6 жирных кислот вторичного липидного сырья (покровного жира и жира печени) байкальской нерпы при создании супрамолекулярных наноразмерных систем. Способы получения липосом, содержащих биологически активные липиды байкальской нерпы, защищены патентами РФ. В модельных экспериментах по воспроизведению различных патологических состояний выявлена биологическая активность и фармакотерапевтическая эффективность разработанных липосомальных средств. Установлена иммуномодулирующая, мембраностабилизирующая, антиоксидантная, гиполипидемическая и противовоспалительная активность липосом на основе липидов нерпы. Выявлено, что липосомальное средство, содержащее липиды нерпы, обладает адаптогенным, гепатопротекторным и ранозаживляющим действиями. Показано, что применение биологически активных средств в липосомальных структурах, содержащих эссенциальные ω-3 и ω-6 жирные кислоты в оптимальном соотношении, способствует усилению фармакологической активности и фармакотерапевтической эффективности исследуемых средств. ^ Результаты проведенных исследований содержат сведения по морфологии и клеточному составу некоторых органов иммунной системы уникального пресноводного млекопитающего - байкальской нерпы и могут быть рекомендованы для оценки состояния популяции этого животного в системе биомониторинга экосистемы озера Байкал. Оперативная оценка состояния иммунных органов нерпы позволит разработать меры по сохранению биоразнообразия озера. Разработаны липосомальные средства с добавлением жира байкальской нерпы, а также липосомальное ранозаживляющее средство на основе липидов нерпы. Результаты проведенных исследований являются экспериментальным обоснованием дальнейших работ по конструированию лечебно-профилактических средств нового поколения на основе нанокапсул из вторичных природных липидов и получения липосомальных форм лекарственных средств с использованием триацилглицеролов, содержащих оптимальное соотношение ω-6/ω-3 жирных кислот. Результаты исследований могут быть использованы: - при написании разделов справочной и учебной литературы по видовой и возрастной сравнительной морфологии и лимфологии; - в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по анатомии и гистологии животных на биологических, охотоведческих и ветеринарных факультетах высших учебных заведений. Теоретические и прикладные результаты работы применяются при чтении курса лекций и проведении лабораторно-практических занятий в Восточно-Сибирском государственном технологическом университете, изложены в методических указаниях для студентов специальностей «Технология мяса и мясных продуктов» и «Биотехнология», в 2 монографиях, а также выпускных квалификационных и научно-исследовательских работах студентов. ^ 1. Особенности морфологии и цитоархитектоники органов иммунной системы и лимфоидных структур кишечника байкальской нерпы. 2. Онтогенетические особенности структурной организации органов иммуногенеза байкальской нерпы. 3. Иммуноморфологические изменения в лимфоидных структурах пищеварительной системы байкальской нерпы под влиянием биогенных факторов среды как чувствительный показатель состояния иммунной системы организма. 4. Высокая фармакологическая активность и выраженная фармакотерапевтическая эффективность липосомальных средств на основе липидов нерпы при различных патологиях в эксперименте. 5. Усиление биологической активности и повышение фармакотерапевтической эффективности биологически активных средств при включении в липосомальные структуры, полученные на основе жира нерпы, обусловленное действием эссенциальных ω-3 и ω-6 жирных кислот и адресной доставкой в организм. ^ Основные результаты работы докладывались, обсуждались и одобрены на международных и российских научных конференциях и симпозиумах: Международной конференции молодых ученых «От фундаментальной науки к новым технологиям. Химия и биотехнология БАВ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Тверь, 2001); Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001); Международной научной конференции «Научные основы сохранения водосборных бассейнов: междисциплинарные подходы к управлению природными ресурсами» (Улан-Удэ, Улан-Батор, 2004); Международной научно-практической конференции - 8-м Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология – 2005» (Пущино, 2005); II Международной научно-технической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы технологии живых систем» (Владивосток, 2007); Четвертом и Шестом Московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007, 2011); IX Международной конференции «Опто-, наноэлектроника, нанотехнологии и микросистемы» (Ульяновск, 2007); Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию проф. И.А. Спирюхова «Актуальные вопросы экологической, сравнительной, возрастной и экспериментальной морфологии» (Улан-Удэ, 2007); Всероссийской конференции молодых ученых «Экология в современном мире: взгляд научной молодежи» (Улан-Удэ, 2007); 3rd International Symposium in Chemistry «Chemistry and Food Safety-2008» (Ulaаnbaatаr, Mongolia, 2008); Международной научно-практической конференции «Биотехнология: Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008); III Международной научной конференции «Traditional Medicine: a current Situation and Perspectives of Development» (Ulan-Ude, 2008); Erdos Forum on Development of International Traditional Medicine (Erdos, China, 2009); III Международной научно-технической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы технологии живых систем» (Владивосток, 2009); III Международной научно-практической конференции молодых ученых «Жас-Галым-2009» (Тараз, Казахстан, 2009); Международной школе-семинаре «Current Problems of Food Engineering and Biotechnology» (Ulan-Ude, 2009); International Conference on «Innovation in food and nutrition science» (Ulaanbaatar, Mongolia, 2010); I Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и дальнего Востока» (Улан-Удэ, 2010); XI Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2010); XIII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии – 2010» (Иваново, 2010); Международной научной конференции «Проблемы экологии: чтения памяти проф. М.М. Кожова» (Иркутск, 2010) и других (Иркутск, 1999; Элиста, 2000; Чита, 2000; Улан-Удэ, 2003, 2004; Москва, 2005; Оренбург, 2009). Публикации. По материалам выполненных исследований опубликовано 66 работ, в том числе 11 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, получено 3 патента РФ на изобретения, опубликованы 2 монографии. ^ Диссертация изложена на 290 страницах, содержит 45 таблиц, 91 рисунок и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, главы собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений, списка литературы, включающего 348 источников, из них иностранных авторов - 119. В соответствии с поставленными задачами диссертационной работы были проведены исследования по схемам, представленным на рисунках 1 и 2.
Рис. 1. Схема исследования иммунного статуса байкальской нерпы и количество исследованных особей
Рис. 2. Схема исследований по экспериментальной оценке эффективности липидов байкальской нерпы и объем проведенных исследований 2. Материал и методы исследования 2.1. Исследование иммунной системы байкальской нерпы Исследования структурной организации и клеточного состава органов лимфопоэза байкальской нерпы проводились в Проблемной научно-исследовательской лаборатории Восточно-Сибирского государственного технологического университета и лаборатории функциональной анатомии Научно-исследовательского института морфологии человека РАМН (г. Москва). Отбор материала производился от особей байкальской нерпы в ходе комплексных научных экспедиций, приуроченных к промысловой добыче байкальской нерпы, в период с 2000 по 2009 гг. Отлов животных производился 2 раза в год (весенний и осенний периоды) в районе Среднего Байкала. При исследовании материала учитывалась принадлежность особей байкальской нерпы к той или иной возрастной группе. Возрастные группы выделяли согласно возрастной периодизации байкальской нерпы, предложенной Е.А. Петровым (2003). В соответствии с ней, были выделены следующие возрастные группы особей байкальской нерпы: 1) особи в возрасте 1 месяца, 2) особи в возрасте до 1 года, 3) особи в возрасте от 2 до 4 лет, 4) особи в возрасте от 4 до 12 лет, 5) особи в возрасте от 13 до 19 лет. У каждой особи для исследований отбирался тимус, селезенка, брыжеечные лимфатические узлы, принимающие лимфу от тонкого кишечника, участки подвздошной кишки с групповыми лимфоидными узелками и участки прямой кишки. Для исследований использовали материал только от тех особей байкальской нерпы, которые не имели внешних признаков заболеваний и патологических изменений внутренних органов. Определение возраста животных проводили по роговым валикам на когтях по методу, предложенному Чапским К.К. (1941) и по годовым слоям в тканях зубов (Клевезаль Г.А., Клейненберг С.Е., 1967). Кусочки органов (объемом 1-2 см3) фиксировали в 10%-ом водном растворе нейтрального формалина и, после стандартной спиртовой проводки, заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизон (для морфологической оценки препарата и изучения площадей структурных компонентов). Подсчет клеток проводили на срезах, окрашенных азур-II-эозином. Метод окрашивания клеток метиловым зеленым пиронином по Браше, позволяющий выявить клеточные формы, богатые нуклеиновыми кислотами, использовался для более точной дифференцировки бластных форм лимфоцитов, а также для определения степени зрелости и функциональной активности плазматических клеток. Изучение микротопографии лимфоидных органов проводили при помощи бинокулярной лупы МБИ-1 (увеличение: ок. х12.5; об. х4.0) методом точечного счета (Глаголева А.А., 1941) в модификации Стефанова С.Б. (1974), позволяющим в относительных величинах определить площади, занимаемые структурными компонентами органа (в % от общей площади среза). Для измерения применяли стандартную сетку с шагом 1 мм. При изучении цитоконструкции структурно-функциональных компонентов органов иммунной системы животного подсчет клеток проводили при помощи микроскопа МБИ-3 при увеличении объектива – х90 под масляной иммерсией по методу Стефанова С.Б. (1974) с использованием 25-узловой морфометрической сетки с шагом 10 мкм, вмонтированной в окуляр (х10) микроскопа. Подсчитывали следующие виды клеток: бластные формы, большие, средние и малые лимфоциты, клетки с картинами митоза, незрелые и зрелые плазматические клетки, нейтрофильные и эозинофильные лейкоциты, эпителио-ретикулоциты, макрофаги, деструктивно измененные клетки. Подсчет клеток проводили на условной единице площади гистологического среза (880 мкм2). Полученный цифровой материал подвергали компьютерной статистической обработке по программе Statistika 6.0 и Excel. ^ Материалом исследований служили липосомы из яичных фосфолипидов; липосомы из фосфолипидов печени нерпы; липосомы из яичных фосфолипидов, загруженные активной фракцией тимуса, отваром противовоспалительного фитосбора; липосомы из фосфолипидов печени нерпы, загруженные водным раствором экстракта какалии копьевидной, водным раствором экстракта черных листьев бадана толстолистного. Все полученные липосомы содержали жир байкальской нерпы в концентрации 3 мг/мл и антиоксидант α-токоферола ацетат в концентрации 1% (по отношению к липидному компоненту), соответствующий требованиям ФС 42-2654-89-8.10. Жир нерпы получен согласно ТУ 9281-017-02069473-2001. Экстракцию фосфолипидов из яичных желтков производили по классическому методу Фолча (Биохимия, 1989), из печени нерпы - по методу, предложенному М. Кейтс (1975). Липосомальные структуры готовили по методу, предложенному Bangham A.D. et al. (1964). Ультрамикроскопирование липосомальных частиц производили с помощью электронного просвечивающего микроскопа JEOL JEM-2000 FXII. Количество малонового диальдегида (МДА) как конечного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) в липосомах определяли методом пробы с 2-тиобарбитуровой кислотой (Сорокоумова Г.М., 2000). Активную фракцию тимуса получали из вилочковой железы молодняка крупного рогатого скота модифицированным методом В.Я. Ариона (1982). Экстракты какалии копьевидной (ЭКК) (Патент РФ №2206333), черных листьев бадана толстолистного (ЭБТ) (Лубсандоржиева П-Н.Б., 2002), комплексный противовоспалительный фитосбор (Самбатова Э.И., 2001) получены в химико-фармацевтической лаборатории Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (ИОЭБ СО РАН). Отвар фитосбора готовили согласно требованиям ГФ XI. Экспериментальные исследования проводились на: 1) половозрелых мышах обоего пола линии СВА и гибридах (СВАхС57Bl/6) массой 20-22 г, полученных из питомника РАМН «Столбовая»; 2) белых беспородных крысах обоего пола массой 150-250 г, полученных из питомника филиала №5 ГНЦ «Институт биофизики федерального управления «Медбиоэкстрем» при Минздраве России г. Ангарск. Животные находились в стандартных условиях содержания в виварии на обычном рационе. Эксперименты осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г.). Фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов (ПМ) мышей в отношении Staph. aureus в системе in vitro исследовали по методике И.С. Фрейдлин (1976). Макрофагальное звено иммунного ответа исследовали в реакциях Fc-розеткообразования и определения антигенпрезентирующей активности макрофагов (Имельбаева Э.А., 1996). Иммуномодулирующую активность липосомальных средств изучали в реакциях, опосредующих клеточный (в реакциях «Гиперчувствительность замедленного типа» - ГЗТ (Методические рекомендации, 1992) и «трансплантат против хозяина» - РТПХ (Тессенев В., 1979)) и гуморальный (в реакции антителообразования (Методические рекомендации, 1992)) иммунитет. Ростстимулирующую активность тимоцитов морской свинки оценивали в реакции «активного розеткообразования» с эритроцитами кролика (Nekam K. et al., 1982). Для гистоморфологического исследования участки слепой кишки подопытных мышей и раневые участки крыс фиксировали в 10%-ом растворе нейтрального формалина, депарафинированные гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизон (Меркулов Г.А., 1969). Изучение противовоспалительной активности исследуемых средств проводили на стандартных моделях асептического воспаления, «ватной гранулемы» согласно Методическим рекомендациям (1983) и формалинового отека лапок крыс (Тринус Ф.П., 1975). Также определение противовоспалительной активности проводили на двух моделях острого перитонита (Александров П.Н. с соавт., 1986; Методические рекомендации …, 1989). Острый адреналиновый отек у мышей вызывали введением раствора адреналина гидрохлорида подкожно (Томчин А.Б. с соавт., 1997). Оценку мембраностабилизирующей активности липосомальных средств осуществляли по выраженности степени гемолиза эритроцитов, вызываемого реактивом Фентона (перекисный гемолиз), и добавлением дистиллированной воды (осмотический гемолиз) (Ковалев И. Е. с соавт., 1986). Степень выраженности окислительных процессов в организме экспериментальных животных определяли по содержанию малонового диальдегида в сыворотке крови (Клебанов Г.И. с соавт., 1988) и печени животных (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977) в модификации Строева Е.А. и Макаровой В.Г. (1986), а также уровня окисленного и восстановленного глутатиона в сыворотке крови (Anderson M.E., 1989). С целью оценки состояния антиоксидантной системы у животных в сыворотке крови определяли активность глутатионпероксидазы (по методу Stults F.H. et al., 1977), глутатионредуктазы (по методу Racker E., 1955), каталазы (Королюк М.А. и др., 1988) и супероксиддисмутазы (Чевари С. и др., 1985). Уровни содержания в крови животных липидов (общего холестерина, холестерина липопротеидов низкой и очень низкой плотности, холестерина липопротеидов высокой плотности, триглицеридов) определяли стандартизированными биохимическими методами с помощью наборов реагентов производства ЗАО «Вектор-Бест»: «Новохол», «ЛВП-Холестерин-Ново» и «Триглицериды-Ново». Гепатопротекторное действие липосомальных средств было изучено на животных c токсическим гепатитом, который вызывали пероральным введением тетрахлорметана согласно (Олейник А.Н., 1984). Желчь для исследования получали в условиях острых опытов по методике Н.П. Скакуна и А.Н. Олейника (1967). Оценку желчеобразовательной и желчевыделительной функции печени проводили по скорости секреции и общему количеству выделенной желчи, концентрации желчных кислот (Карбач Я.И., 1961), а концентрацию холестерина в желчи определяли по методу С.М. Дроговоз (1971), билирубина – по методу Ван ден Берга в модификации Н.П. Скакуна (1956). Для воспроизведения раневых повреждений были использованы модели линейной, плоскостной кожно-мышечной кожной раны и модель химического ожога кожи (Клюев М.А., 1989; Пономарева-Астраханцева Л.З., 1954; Ойвин И.А., Шетель С.Л., 1961). Прочность образовавшегося рубца определяли методом тензиометрии (Коваленко И.В., 1984); проводили планиметрическое, цитологическое и гистологическое исследования раны (Шалимов С.А., 1989). Реакции поверхностной иммунофлуоресценции выполняли на клетках, прикрепленных к стеклу с помощью поли-L-лизина (Иммунологические методы, 1987). Об адаптогенных свойствах липосомальных средств судили по времени выносливости крыс в стандартном тесте плавания до полного утомления (Dawson C.A., Horvath S.M., 1970), по ориентировочно-исследовательскому поведению и суммарной двигательной активности животных в тестах «открытое поле» (Калуев А.В., 1998) и «Т-образный лабиринт» (Буреш Я. с соавт., 1991). Для оценки влияния средств на состояние гематологических показателей у животных определяли концентрацию гемоглобина унифицированным гемоглобинцианидным методом (Пупочная В.И., 2003) с помощью набора реагентов «Диагем-Т» (НПО «РЕНАМ») и вычисляли лейкоцитарную формулу крови общепринятым методом (Меньшиков В.В. с соавт., 1987). Полученные цифровые данные обрабатывали статистически с применением непараметрических (Вилкоксона-Манна-Уитни) (Гублер И.В., 1973) и параметрических (Стьюдента - с помощью компьютерной программы Jandel SigmaPlot32) критериев. Рассчитывали достоверность отличий данных в группах. Достоверными считались отличия с вероятностью p<0.05. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям