Л. В. Бибаева д м. н., профессор, зав кафедрой биологии гоу впо согма росздрава
|
|
Скачать 1.7 Mb.
|
|
государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «северо-осетинская государственная медицинская академия федерального агентства по здравоохранению и социальномуразвитию» КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ, ВИРУСОЛОГИИ И ИММУНОЛОГИИ СБОРНИК МЕТОДИЧЕСКИХ РАЗРАБОТОК ПО МИКРОБИОЛОГИИ ДЛЯ СТУДЕНТОВ ЛЕЧЕБНОГО, ПЕДИАТРИЧЕСКОГО, МЕДИКО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ^ ЧАСТЬ I Владикавказ 2008 Под редакцией доктора медицинских наук, профессора, зав.каф. микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО СОГМА Росздрава Л.Я. Плахтий. Авторский коллектив: И.Е. Третьякова, д.м.н., доцент, ^ к.м.н., А.К. Тадеева, А.Ч. Цховребов, Л.В. Алборова Основное назначение разработок — методическая помощь студентам к каждому практическому занятию в весеннем семестре. Разработки составлены в соответствии с федеральной программой по микробиологии, вирусологии и иммунологии студентов 2-3 курсов. Рецензенты: ^ - д.м.н., профессор, зав. кафедрой биологии ГОУ ВПО СОГМА Росздрава. А.Р. Кусова - д.м.н., профессор, зав. кафедрой гигиены с основами экологии ГОУ ВПО СОГМА Росздрава. ^ Т е м а: Микробиологическая лаборатория, режим работы и назначения. Морфология бактерий. Методы микроскопического изучения бактерий, простой метод окраски бактерий Учебная цель: 1. Изучить морфологию отдельных представителей бактерий. 2. Освоить технику микроскопирования. 3. Освоить простой метод окраски микроорганизмов. Студент должен знать:
2. Основные принципы классификации форм бактерий. Студент должен уметь:
Контрольные вопросы по теме занятия:
Самостоятельная работа студентов
Методические рекомендации
^ Окраска бактерий преследует цель сделать их резко отличными от фона, что позволяет изучить под микроскопом их морфологию и структуру. В микробиологии используют простые и сложные методы окраски препаратов. При ПРОСТОМ СПОСОБЕ окраски, мазок окрашивают какими-либо одним красителем, например, водным фуксином (2-3 мин.) или метиленовой синью (2-3 мин.), промывают водой, высушивают и микроскопируют. ^ В связи с очень малыми размерами бактерий изучение их морфологии возможно только при большом увеличении, достигаемом при помощи иммерсионного масла, которое позволяет создать единую систему между предметным стеклом и особым, х 90- кратным (с черной полоской) объективом. При микроскопии окрашенных объектов необходимо создать яркое освещение с помощью вогнутого зеркала, поднятого конденсора и полностью открытой диафрагмы. Каплю иммерсионного масла наносят на область мазка на стекле, лежащем на столе. Затем стекло переносят на столик микроскопа. Иммерсионный объектив погружают в масло осторожно, под контролем глаза до явного контакта объектива с маслом. Затем объектив поднимают, не выводя из капли масла и глядя в окуляр для нахождения объекта исследования («поля зрения»). Четкое изображение препарата достигается регулировкой сначала макровинтом (для обнаружения объекта), а затем микровинтом для регулировки резкости изображения. ^ Исследование в темном поле Микроскоп в темном поле зрения отличаются от обычного микроскопа способом освещения препарата: применяется яркое боковое освещение, вследствие чего получается изображение светящегося объекта на темном фоне. При этом косые лучи не попадают в объектив и, следовательно, в глаз наблюдателя, в силу чего поле зрения оказывается совершенно неосвещенным (темное поле зрения). В глаз наблюдателя попадают только лучи, натолкнувшиеся на своем пути на исследуемый объект и отраженные от него. Боковое освещение в микроскопе можно получить, используя конденсор или объектив с затемненным центром или, более просто, вкладывая между линзами конденсора кружок черной бумаги с оставлением незначительной периферической части линз. Объекты, которые можно наблюдать при помощи метода косого освещения в темном поле зрения, измеряются 0,06- 0,04- 0,02ц, т. е за пределами видимости в обычном микроскопе. В то же время и более крупные объекты при использовании темным поле в ряде случаев оказываются в более благоприятных условиях для изучения, так как они лучше видны вследствие контраста между ними и темным полем зрения. Удобно пользоваться этим методом и для наблюдения подвижности микробов в живом состоянии. Люминесцентная микроскопия Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых объектов и красителей при освещении их ультрафиолетовыми лучами, синими или другими коротковолновыми лучами света. Различают собственную (первичную) люминесценцию и наведенную (вторичную). При первичной люминесценции исследуемый объект содержит вещества, способные флюоресцировать при освещении их ультрафиолетовыми лучами. Большая часть объектов не обладает собственной люминесценцией, поэтому при люминесцентной микроскопии пользуются обработкой объекта красителями. В качестве флюорохромов применяются акридиновый желтый, аурофосфин и др. Люминесцентные микроскопы — обычные микроскопы, которые снабжены источником ультрафиолетового света и набором светофильтров. Светофильтры необходимы для выделения части спектра, которая возбуждает люминесценцию, и, для отсечения уже прошедшего через объект возбуждающего ответа. Первый фильтр помещают перед источником света, а второй — в окуляре микроскопа. Расположенный в окуляре светофильтр пропускает только люминесцентное свечение препарата. Приготовление препарата для люминесцентной микроскопии не сложно: на предметном стекле каплю исследуемого материала смешивают с каплей раствора флюо-рохрома и покрывают покровным стеклом. Фазовоконтрастная микроскопия Фазовокотрастный микроскоп применяется для изучения неокрашенных препаратов, живых объектов, размножения микроорганизмов. Метод фазовоконтрастной микроскопии позволяет в прозрачном при обычной микроскопии препарате изучить внутреннее строение микроорганизма. При похождении пучка света через окрашенный препарат происходит изменение интенсивности света, меняется амплитуда световой волны. Такие изменения легко улавливаются человеческим глазом. Тот же пучок света, проходя через прозрачный неокрашенный препарат, не теряет своей интенсивности, меняется только скорость прохождения света через объект, меняется фаза колебания света. Такие колебания глаз не воспринимает. Метод фазовых контрастов может быть положительным (на светлом фоне темное изображение объекта) или отрицательным (на темном фоне светлое изображение). Электронная микроскопия В электронном микроскопе вместо световых лучей используется поток электронов, длина волны которых составляет 1/ 100000 длины света. Поэтому при электронной микроскопии можно рассматривать объекты, размер которых в 50-100 раз меньше видимых в обыкновенном микроскопе. Увеличение можно получить в 100000-200000 раз. Источником электронов является электронная пушка. Вылетевшие из нити электроны разгоняются высоким электрическим напряжением (50000 — 100000 v). Вышедший из электронной пушки пучок электронов попадает в конденсорную электромагнитную линзу, которая сводит их на рассматриваемый препарат, лежащий на пленки коллодия. После этого лучи попадают на объективную электронную линзу, собирающую расходящиеся лучи и дающую первое увеличение предмета. Второе увеличение изображение, даваемое проекционной линзой, принимается на флюоресцирующий экран. С помощью электронной микроскопии можно изучить — вирусы, бактерии, бактериофаги. Микробы, или микроорганизмы (бактерии, грибы, простейшие, вирусы), систематизированы по их сходству, различиям и взаимодействиям между собой. Этим занимается наука — систематика микроорганизмов. Таксономия (расположение, порядок) микроорганизмов положены их морфологические, физиологические, биохимические свойства. ^ Бактерии относятся к прокариотам, т. е. доядерные организмам, поскольку у них имеется примитивное ядро без оболочки, ядрышка, гистонов, а в цитоплазме отсутствуют высокоорганизованные органеллы (митохондрии, аппарат Гольджи, лизосомы и др. ) ^ -домен «Bacteria» — прокариоты, представленные настоящими бактериями;
^ Известны четыре основные формы бактерий:
^ представлены самой многочисленной и разнообразной группой бактерий. Классификация палочковидных форм принято именовать бациллами те палочки, которые способны образовывать споры, а палочки неспособные к спорообразованию, называются бактериями. Палочковидные формы различаются по величине, расположению — поодиночке, парами, цепочкой, беспорядочно и под углом. Очертанию концов — закругленные, обрубленные, утолщенные, заостренные. ^ спириллы и спирохеты имеющие вид штопорообразно извитых клеток. К патогенным спириллам относятся возбудитель садоку (болезнь укуса крыс). К извитым также относятся кампилобактерии, имеющие изгибы как у крыла летящей чайки. Спирохеты — тонкие, длинные, изогнутые (спиралевидной формы) бактерии, отличающиеся от спирилл подвижностью, обусловленной сгибательными изменениями клеток. Спирохеты представлены тремя родами патогенными для человека: Treponema, Borrelia, Leptospira. ^
^ огенные биологические агенты — патогенные для человека микроорганизмы (вирусы, бактерии, грибы, простейшие). В соответствии с типами микроорганизмов выделяют: бактериологические, вирусологические, микологические, протозоологические лаборатории. Регламентация условий работы с возбудителями инфекционных заболеваний произведена в соответствии со степенью опасности микроорганизмов для человека. Выделяют четыре группы возбудителей. Группа 1: возбудители особо опасных инфекций: чума, натуральная оспа, лихорадки Ласса, Эбола. Группа 2:возбудители высококонтагиозных бактериальных грибковых и вирусных инфекций: сибирская язва, холера, лихорадка, сыпной тиф, бешенство. Группа 3: возбудители бактериальных грибковых, вирусных и протозойных нозологических форм (коклюш, малярия, полиомиелит, лейшманиозы). Группа 4: возбудители бактериальных, вирусных, грибковых заболеваний (сенигнойной инфекции, амебиа-за, аспергиллеза). Микробиологические лаборатории работают с ПБА с возбудителями особо опасных инфекций (группа 1и 2). Особый режим максимально изолированные индивидуальным и общественным риском. Лаборатория работающая с ПБА (группа 3 и 4). Базовые основные лаборатории умеренным и низким индивидуальным риском. ^ Укажите один правильный ответ: 1. Микроб — это: а) Доклеточное живое существо; б) Организм определённого вида; в) Одноклеточное существо, невидимое невооружённым глазом; г) Инфекционная белковая частица; д) Одноклеточный организм. 2. Бактерия — это: а) Вирус; б) Одноклеточное существо определённого вида, относящееся к прокариотам; в) Одноклеточное существо определённого вида, относящееся к эукариотам; г) Организм определённого вида; д) Одноклеточный организм. 3. Бациллы — это: а) Кокки, образующие споры; б) Палочки, не образующие спор; в) Аэробные палочки, образующие споры; г) Палочки, образующие споры; д) Извитые формы. 4. Живой может считаться система, способная к: а) Обмену веществ с окружающей средой; б) Сохранению своей структурной организации; в) Умножению своих структурных компонентов; г) Воспроизведению и реализации генетической программы; д) Метаболизму. ^ Т е м а: Структура прокариотической клетки. Сложные способы окраски микроорганизмов Учебная цель: 1. Изучить отдельные структуры прокариотической клетки. 2. Освоить сложные методы окраски микробов. Студент должен знать:
Студент должен уметь:
Контрольные вопросы по теме занятия:
Самостоятельная работа студентов Освоение сложных методов окраски:
Методические рекомендации ^ Сложные способы окраски включают последовательное нанесение на препарат красителей, различающихся по химическому составу и цвету, протрав и дифференцирующих веществ. Это позволяет предварительно дифференцировать микробы (дифференциально-диагностические способы) и выявлять определенные структуры клеток (специальные способы). ^ Окраска по Граму является важным диагностическим признаком идентификации бактерий. В результате окраски по Граму все бактерии делятся на две группы; грампо-ложительные (синего цвета) и грамотрицательные (красного цвета). ^
^ Применяется для обнаружения некоторых микробов, богатых липидам (например возбудитель туберкулеза, лепры и др.)
4. Докрашивают метиленовым синим в течении 3-5 минут. 5. Препарат промывают водой. 6. Высушивают на воздухе или фильтровальной бумагой. Обесцвечивание кислотой приводит к потере красителя кислотоподатливыми микробами, и они окрашиваются в синий цвет. Кислотоустойчивые микробы остаются красными. ^ Клеточная стенка — прочная, упругая структура, придающая бактерии определённую форму и вместе с цитоплазматической мембраной «сдерживающая» высокое осмотическое давление в бактериальной клетке. Она участвует в процессе деления клетки и транспорте метаболитов, имеет рецепторы для бактериофагов, бактериоцинов и различных веществ. Наиболее толстая клеточная стенка у грамположительных бактерий. Так, если толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий около 15-20 нм, то у грамположительных она может достигать 50 нм и более. В клеточной стенки грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов, белков. Основным компонентом клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин, мукопептид), состоящий 40-90% массы клеточной стенки. С пептидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые кислоты молекулы, которых представляют цепи из 8-50 остатков глицерола рибитола, соединенных фосфатными мостиками. Форму и прочность бактериям придает жесткая волокнистая структура многослойного, с поперечными пептидными сшивками, пептидогликана. Способность грамположительных бактерий при окраске по Граму удерживать генциановый фиолетовый в комплексе с йодом (сине-фиолетовая окраска бактерий) связана со свойством многослойного пептидогликана взаимодействовать с красителем. Кроме этого, последующая обработка мазка бактерий спиртом вызывает сужение пор в пептидогликане и тем самым задерживает краситель в клеточной стенке. Грамотрицательные бактерии после воздействия спиртом утрачивают краситель, что обусловлено меньшим количеством пептидогликана (5-10%); они обесцвечиваются спиртом и при обработке фуксином или сафранином приобретают красный цвет. В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий входит наружная мембрана, связанная посредством липопротеина с подлежащим слоем пептидогликана. Наружная мембрана при электронной микроскопии имеет вид волонообразной трехслойной структуры, сходной с внутренней мембраной, которую называют цитоплазмой. Основным компонентом этих мембран является бимолекулярный (двойной) слой липидов. Наружная мембрана является мозаичной структурой. Представленной липополисахаридами, фосфолипидами, белками. Внутренний слой ее представлен фосфолипидами, а в наружном слое расположен липополисахарид (ЛПС). Липополисахарид закреплен в наружной мембране липидом А, обуславливающим токсичность ЛПС и отождествляемым поэтому с эндотоксином. Наружную мембрану пронизывают молекулы белка, называемые поринами, окаймляют гидрофильные поры, через которые проходят вода и мелкие гидрофильные молекулы. Между наружной и цитоплазматической мембраной находятся периплазматическое пространство, или периплазма, содержащая ферменты (протеазы, липазы, фосфатазы). При нарушении синтеза клеточной стенки под влиянием антибиотиков, лизоцима, образуются клетки с измененной часто шаровидной формы: протопласты полностью лишены клеточной стенки, сферопласты- бактерии частично сохранившиеся клеточной стенкой. После удаления ингибитора клеточной стенки такие изменения могут реверсировать, т. е. восстанавливать полноценную клеточную стенку. Бактерии сферо- или протопластного типа называются L-формами. ^ представляет собой трехслойную структуру толщиной 2,5 нм. Цитоплазматическая мембрана является динамической структурой с подвижными компонентами, поэтому ее представляют как мобильную текучую структуру. Состоит из двойного слоя липидов, главным образам фосфолипидов. Она окружает наружную часть цитоплазмы бактерий и участвует в регуляции осмотического давления, транспорте веществ энергетическом метаболизме клетке. При избыточном росте цитоплазматическая мембрана образует инвагинаты — впячивания в виде сложно закрученных мембранных структур, называемые мезосомами, участвуют в делении клетки. ЦПМ — участвует спорообразовании, обеспечивает энергией синтез клеточной стенки, в делении клетки. Цитоплазма занимает основной объем бактериальной клетки и состоит из растворимых белков, рибонуклеиновых кислот, включений, многочисленных гранул-рибосом, ответственных за синтез белков. В цитоплазме имеются различные включения в виде гранул гликогена, полисахаридов, полифосфатов (волютина). Она накапливается при избытке питательных веществ в окружающей среде и выполняют функцию запасных веществ для питания и энергетических потребностей. Нуклеоид эквивалент ядра у бактерий. Он расположен в центральной зоне бактерий в виде двунитевой ДНК, замкнутой в кольцо и плотно уложенной наподобие клубка. Ядро бактерий, в отличие от эукариот, не имеет ядерной оболочки, ядрышка и основных белков (гистонов). Кроме нуклеоида, представленного одной хромосомой, в бактериальной клетке имеются внехромосомные факторы наследственности — плазмиды, представляющие собой ковалентно замкнутые кольца ДНК. ^ 1. Если условно выбирать три главных функционально-структурных компонента бактерий, то это будут: а) Ядро, цитоплазма, оболочка; б) ДНК, цитоплазматическая мембрана, включения; в) Клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, ядро; г) Оболочка, цитоплазма, ДНК; д) Рибосомы, цитоплазма, ядро 2. В отличие от эукариотических клеток бактерии имеют: а) Гаплоидный набор хромосом; б) Диплоидный набор хромосом; в) Клеточный центр; г) Гистоновые белки. 3. Структурно цитоплазматическая мембрана бактерий отличается от мембран других живых существ тем, что: а) Является трёхслойной; б) В её состав входит холестерин; в) Способна формировать эндоплазматическую сеть; г) Способна формировать мезосому; д) Способна формировать веретено деления. 4. Жёсткость структуры бактериальной клетки обеспечивается: а) Капсулой; б) Клеточной стенкой; в) Цитоплазматической мембраной; г) Жгутиками; д) Пилями. 5. Форма бактерий определяется строением её: а) Пилей; б) Цитоплазматической мембраной; в) Клеточной стенкой; г) Всех трёх компонентов; д) Неизвестно науке. Укажите один правильный ответ: 1. Ригидность клеточной стенки у бактерий обусловлена наличием в её составе: а) Белков; б) Липидов; в) Тейхоевых кислот; г) Пептидогликана; д) Полисахаридов. 2. Постоянство формы бактерий зависит от наличия в их составе: а) Тейхоевых кислот; б) Липополисахаридов; в) Фимбрий; г) Пептидогликана; д) Капсулы. 3. При проведении окраски по Граму обработка спиртом: а) Предшествует окрашиванию раствором Люголя; б) Следует за окрашиванием генцианвиолетом; в) Следует за обработкой раствором Люголя; г) Следует за промыванием водой перед окрашиванием фуксином. 4. Разная окраска по Граму у бактерий обусловлена различиями в химическом составе и строении: а) Рибосом; б) Цитоплазматической мембраны; в) Цитоплазмы; г) Клеточной стенки; д) Включений. 5. Способ окраски по Цилю-Нильсену используется для обнаружения бактерий: а) Содержащих малое количество нуклеопротеидов в цитоплазме; б) Обладающих кислотоустойчивостью; в) Обладающих спиртоустойчивосгью; д) Содержащих малое количество липидов в клеточной стенке. 6. Способ окраски по Цилю-Нильсену применяют для выявления в материале бактерий: а) Стафилококков и стрептококков; б) Туберкулёзной палочки и палочки проказы; в) Дизентерийной палочки и сальмонелл; г) Бацилл сибирской язвы и клостридий газовой гангрены. 7. При окрашивании по способу Циля-Нильсена обработка серной кислотой: а) Предшествует окраске карболовым фуксином Циля; б) Следует непосредственно за окрашиванием карболовым фуксином Циля; в) Следует между промыванием водой и окрашиванием карболовым фуксином Циля; г) Следует за окрашиванием метиленовым синим. 8. Основными структурными компонентами мембраны являются: а) Липотейхоевые кислоты; б) Пептидогликан; в) Белки; г) Фосфолипиды; д) Гликоконъюгаты. 9. Жизнедеятельностью бактерий руководит: а) Ядро; б) Цитоплазматическая мембрана; в) Нуклеоид; г) Внешняя среда; д) Никто не руководит. ^ Т е м а: Структура прокариотической клетки Учебная цель: Изучить отдельные структуры прокариотической клетки. Студент должен знать: 1. Дополнительные структуры прокариотической клетки. 2. Способ выявления дополнительных структур. Студент должен уметь:
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям