Методическое пособие для практических врачей Волгоград, 2004 г
|
|
Скачать 146.29 Kb.
|
|
Волгоградский государственный медицинский университет кафедра госпитальной терапии Клинико-диагностическое значение исследования активности супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы у больных системной красной волчанкой и системной склеродермией Методическое пособие для практических врачей Волгоград, 2004 г. В предлагаемом методическом пособии показано клиническое и диагностическое значение исследования активности основных ферментов антиоксидантной системы: супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы у больных системной красной волчанкой и системной склеродермией. Подробно описаны методы исследования активности энзимов, рассмотрены изменения ферментных показателей в зависимости от клинических вариантов заболеваний, даны практические рекомендации по использованию разработанных диагностических тестов в клинической практике. Составители: д.м.н, профессор И.А. Зборовская к.м.н. М.В. Мякишев ^ Введение…………………………..…………………………………………………..5 Методы исследования………………………………………………………………..6 Определение активности эритроцитарной и плазматической супероксиддисмутазы……………………………..…………….6 Определение фракций эритроцитарной супероксиддисмутазы…………………………………………………….………….8 Определение активности эритроцитарной и плазматической глутатионпероксидазы…………………………………………..9 Определение активности эритроцитарной и плазматической глутатионредуктазы…………………………………………....10 Показатели активности СОД, ГП, ГР и содержание изоферментов СОД в плазме и эритроцитах больных СКВ И ССД с различными клиническими вариантами заболевания…………………………………………………………....11 Практические рекомендации…………………………………………………….....12 Заключение………………………………………………………………………….13 Литература…………………………………………………………………………..13 СОКРАЩЕНИЯ АФК – активные формы кислорода СОД – супероксиддисмутаза ГП – глутатионпероксидаза ГР – глутатионредуктаза СКВ – системная красная волчанка ССД – системная склеродермия НАД – никотинамидадениндинуклеотид НАДФ – никотинамидадениндинуклеотидфосфат ROH – гидроокись липидов ROOH – гидроперекиси липидов GSH – восстановленная форма глутатиона GSSG – окисленная форма глутатиона ПААГ – полиакриламидный гель ТЕМЕД – тетраметилэтилендиамид НСТ – нитросиний тетразолий ЭДТА – этилендиаминтетраацетат ФМС – феназинметасульфат ПСА – персульфат аммония МБА – метиленбисакриламид ГПТБ – гидроперекись трет-бутила ВВЕДЕНИЕ Интерес к вопросам диагностики и лечения системной красной волчанки (СКВ) и системной склеродермии (ССД) в последние годы значительно возрос в связи с увеличением их удельного веса в структуре заболеваемости, а также высокой временной и стойкой нетрудоспособностью, определяющей большую социальную значимость этой патологии. Эпидемиология СКВ и ССД изучена недостаточно, и показатели распространенности этих болезней отличаются большой вариабельностью. Однако очевидно, что эти заболевания уже нельзя отнести к редким, как это считалось ранее. Полиморфизм клинических проявлений СКВ и ССД, атипичные и стертые формы этих заболеваний нередко затрудняют правильную постановку диагноза и своевременное назначение адекватной терапии, что значительно ухудшает прогноз. Поэтому качество и точность диагностики в немалой степени зависят от чувствительности лабораторных тестов, имеющихся в распоряжении врача. В то же время, существующие иммунологические и биохимические методы исследования не всегда позволяют выявлять минимальные проявления активности патологического процесса, определить периоды клинической ремиссии, объективно контролировать эффективность лечения. Инициация и поддержание хронического воспалительного процесса осуществляется посредством многочисленных химических медиаторов, среди которых большое значение придается активным формам кислорода (АФК), к которым, в частности, относятся: супероксидный анион, гидроксильный радикал, перекись водорода. Образование АФК происходит, в основном, в нейтрофилах и макрофагах в процессе фагоцитоза. Установлено участие АФК в нарушениях обмена соединительной ткани. Так, АФК активно воздействуют на метаболизм коллагена, участвуя в деградации гиалуроновой кислоты, тормозят синтез протеогликанов. Воздействуя на эндотелиоциты сосудистой стенки путем запуска липопероксидации мембран, АФК приводят к изменению проницаемости сосудов, повреждению сосудистого коллагена и формированию артерио-капиллярного фиброза. Предполагается также, что неконтролируемая липопероксидация, изменяя фосфолипидный состав мембран, нарушает чувствительность клеток к иммунным раздражителям и влияет на процессы клеточного ответа иммунокомпетентных клеток. Защита от повреждающего действия АФК в организме осуществляется совместным действием ряда факторов, ограничивающих их действие – антиоксидантной системой, включающей, в том числе ферментативные реакции утилизации реактивных метаболитов кислорода. Возникновение нарушений в этой системе может привести к разбалансировке процессов оксидации-антиоксидации, увеличению продукции АФК, и проявлению их токсического эффекта на структурные элементы тканей. Наибольшее значение в процессах энзимной инактивации АФК придается реакциям, катализируемым супероксиддисмутазой (СОД), глутатионпероксидазой (ГП), глутатионредуктазой (ГР). Биологическое значение этих ферментов и обусловило интерес к их изучению с позиций возможности определения активности СОД, ГП, ГР в качестве дополнительных, вспомогательных тестов для ранней диагностики и уточнения степени активности патологического процесса, дифференциальной диагностики, объективизации контроля эффективности лечения при СКВ и ССД. ^ Настоящее методическое пособие составлено на основании исследования активности СОД в эритроцитах и плазме, ее изоформ в эритроцитах, активности ГП и ГР в эритроцитах и плазме у 62 больных СКВ, 31 больного ССД и 30 здоровых людей (контрольная группа). Исследования, проведенные в контрольной группе, достоверных статистических различий между энзимными показателями различных возрастных групп не выявили. Существенных различий в зависимости от пола также обнаружено не было. У всех больных, наряду с комплексным клинико-инструментальным обследованием, ферментные исследования проводили трижды: при поступлении в стационар, через две недели после начала лечения и перед выпиской, в стадии начинающейся клинической ремиссии. ^ СОД осуществляет катализ реакции рекомбинации супероксидных анионов (О-2). В результате реакции образуется перекись водорода (Н2О2) и кислород (О2). СОД 2О2- + 2Н+ _______________________ Н2 О2 + О2 Определение активности эритроцитарной СОД проводилось в супернатантах гемолизатов эритроцитов, приготовленных по методу Nishikimi N. et al. (1972). Эритроцитарную массу отделяли от плазмы крови центрифугированием, дважды отмывали физиологическим раствором (0,9% NаCl). К 0, 1 мл отмытых эритроцитов добавляли 0,9 мл трис-HCl буфера 0,005 М, рН 7,4, 0,25 мл этилового спирта, 0,15 мл хлороформа. После помешивания стеклянной палочкой в течении 15 мин. при Т=+4С, центрифугировали 15 мин. при 3000 об/мин. Супернатант плазмы готовили путем добавления к 1 мл плазмы 300 мг КН2РО4 (безводный), 0,25 мл этилового спирта и 0,15 мл хлороформа. Помешивали стеклянной палочкой при Т=+4С в течение 15 мин. и центрифугировали при 3000 об/мин. в течении 15 мин. Активность СОД в полученных супернатантах определяли по методике, описанной Е. Е. Дубининой и соавт. (1983). Для определения фракционного состава эритроцитарной СОД использовали супернатант гемолизата, приготовленный по методике, описанной выше. ^ активности энзима основан на реакции восстановления формазанов из солей тетразолия в слабощелочной среде. Об активности СОД судили по степени торможения восстановления НСТ в присутствии НАДН и ФМС. Оборудование: Спектрофотометр СФ-26 с набором кювет, лабораторная центрифуга, термостат, лабораторная посуда. ^ ЭДТА, НСТ, ФМС, НАДН, фосфатный буфер 0,15 М, рН 7,8; трис-ЭДТА буфер 1М, рН 8,0. Инкубационная смесь: реагент N1 – 1 мкМ ЭДТА, 0,407 мМ НСТ, 1,8 мкМ ФМС в 0,15 М фосфатном буфере, рН 7, 8; реагент N2 – 1 мМ НАДН в 1М трис-ЭДТА, рН 8,0 буфере. ^ контрольная проба – 3 мл 0,15 М фосфатного буфера, рН 7, 8; стандартная проба – 1 мл 0, 15 М фосфатного буфера, рН 7, 8, 2 мл реагента N1; опытная проба - 1 мл 0, 15 М фосфатного буфера, рН 7, 8, 0, 05 мл супернатанта гемолизата эритроцитов или плазмы. Общий объем каждой пробы – 3 мл. После перемешивания пробы помещаются в кюветы с l = 1,0 см. На спектрофотометре СФ-26 при длине волны 540 нм измеряются экстинции в обеих пробах против контрольной пробы. Затем добавляется 0,1 мл реагента N2, содержимое кюветы перемешивается и после инкубации в течении 10 мин при Т=37,0 С производится повторное измерение экстинциий опытной и контрольной проб. Активность СОД выражается в условных единицах. За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для снижения оптической плотности в процессе восстановления НСТ в опытной пробе на 50%. При расчетах использовали формулы: E0 – E10 T% T = ────── х 100% A = ─────── E10 100% - T% - где Т% - процент блокирования, Е0 – разница между конечной и начальной экстинциями реакционной смеси в отсутствие СОД (стандартная проба), Е10 - разница между конечной и начальной экстинциями исследуемой пробы (опытная проба), А – активность фермента. Активность энзима определяли в пересчете на 1 мл эритроцитарной взвеси и на 1 мл плазмы. ^ Разделение изоферментов СОД проводили методом диск-электрофореза по Дэвису (73) в модификации Е. Е. Дубининой Е. Е. и соавт.(1983) в пластинах ПААГ. ^ основан на разделении фракций при электрофорезе в ПААГ и последующим их выявлением с использованием фотохимической системы рибофлавин-свет-ТЕМЕД-О. Оборудование: Аппарат для вертикального гель-электрофореза "АВГЭ-1" производства "CHIJU KALUR" (Эстония), блок питания "ПЭФА-1", денситометр "CHROMOSCAN" (Великобритания), лабораторная посуда. ^ трис, акриламид, МБА, ПСА, НСТ, ЭДТА, ТЕМЕД, рибофлавин, сахароза, глицерин, бромфеноловый синий, 0,1 н HCl, 1 н HCl, трис-глициновый буфер 0,005 М, рН 8, 3, трис-HCl буфер 0, 05 М, рН 7, 8. Формировались гелевые пластины длиной 11,5 см (10 см разделяющего геля и 1, 5 см концентрирующего геля) и толщиной 2 мм. Для приготовления разделяющего геля (10%) использовали растворы следующего состава: раствор N1: трис – 36,6 г, 0,1 н HCl – 48,0 мл (рН 8,9); раствор N2: акриламид – 28,0 г, МБА – 0,735 г; раствор N3: ПСА – 0,14 г. В состав концентрирующего геля входили: раствор N4: трис – 598 г, 48 мл 1 н HCl; раствор N5: акриламид – 10,0 г, МБА – 2,5 г; раствор N6: рибофлавин – 4,0 мг; раствор N7: сахароза – 40,0 г. Перечисленные составы даны из расчета на 100 мл водного раствора. Соотношения для приготовления разделяющего геля: раствор N1 – 1 часть, раствор N2 – 2,8 частей, раствор N3 – 4 части, вода – 0,2 части. Соотношения для приготовления концентрирующего геля: раствор N4 – 1 часть, раствор N5 – 2 части, раствор N6 – 1 часть, раствор N7 – 4 части. Для полимеризации использовалась лампа дневного света. ^ В сформированные ячейки вносили супернатант в количестве 50 мкл с добавлением глицерина в качестве уплотнителя (25% на одну пробу). Затем заполняли камеры трис-глициновым буфером 0,005 М, рН 8, 3 и проводили электрофорез при силе тока 10 мА до момента достижения реперным красителем (бромфеноловый синий) границы разделяющего геля. Последующий основной электрофорез проводили при силе тока 30 мА и напряжении 200 В в течении 1 ч. 20 мин. После электрофореза пластина ПААГ помещалась в инкубационную среду следующего состава: НСТ – 2,4 мМ, ЭДТА – 0,1 мМ, ТЕМЕД – 28 мМ, рибофлавин – 0,028 мМ, трис-HCl буфер 0,05 М, рН 7,8. Инкубация проводилась в темноте в течении 30 мин. После инкубации пластина освещалась лампой дневного света в течение 5 - 15 мин и в результате фотохимической реакции приобретала темно-фиолетовую окраску, кроме зон, содержащих фракции СОД, которые оставались неокрашенными, либо имели значительно менее яркую окраску. Обработка результатов электрофореза выполнялась на денситометре "CHROMOSCAN" при длине волны сканнера 492 нм. При подсчете сумма всех фракций принималась за 100%, каждая фракция выражалась в процентном отношении к общей сумме. Использование аппарата АВГЭ-1 и денситометра CHROMOSCAN позволяет произвести одновременное определение содержания изоэнзимов СОД в 13 биологических пробах ^ Активность ГП определяли по методу B. Paglia, W. Walentine (1967). ГП катализирует реакции восстановления перекиси водорода (Н2О2) и гидроперекисей липидов (ROOH) в присутствии восстановленного глутатиона (GSH), который является необходимым компонентом для проявления каталитической активности фермента. В результате реакции образуются окисленная форма глутатиона (GSSG) и вода. ГП 2GSH + Н2О2 _______________ GSSG + 2Н2O ГП 2GSH + ROOH _________ GSSG + ROH + H2O ^ определения активности ГП основан на измерении скорости окисления GSH в присутствии энзима и НАДФН спектрофотометрически по изменению оптической плотности среды в процессе реакции. 1 мкМ НАДФН соответствует 1 мкМ GSH. Оборудование: спектрофотометр СФ-26 с набором кювет, термостат, лабораторная посуда. ^ ЭДТА, НАДФН, GSH, ГПТБ, фосфатный буфер 0,5 М, рН 7,4. Инкубационная смесь: 1мМ ЭДТА, 0,12 мМ НАДФН, 0,85 мМ GSH, 0,2 мМ ГПТБ, фосфатный буфер 0,5 М, рН 7,4. Инкубация при Т=37 С в течении 10 мин. ^ после инкубации к смеси добавляется биологический материал (0,2 мл плазмы или гемолизата эритроцитов в разведении 1:200, конечный объем реакционной смеси – 3 мл) и на спектрофотометре при длине волны 340 нм в кварцевых кюветах l = 1,0 см в течении 3 мин каждую минуту измеряется экстинция против контроля (3 мл фосфатного буфера 0,5 М, рН 7,4). При расчете активности фермента учитывали рекомендации В. С. Асатиани (1969). Расчет проводили по формуле: Е/мин х 3 х 60 _______________________ = Е/мин х 144 6,22 х 0,2 - где 3 – объем инкубационной смеси (мл), 60 - время реакции (мин), 6,22 (см/мкМ) – коэффициент экстинции НАДФН при 340 нм, 0,2 – объем биологического материала (мл) в опытной пробе. Единица активности ГП - это количество фермента, которое при Т=37С за 60 мин окисляет 1 мкМ GSH. При определении активности в гемолизатах эритроцитов учитывали разведение 1: 200. ^ ГР катализирует реакцию восстановления окисленного глутатиона (GSSG) в присутствии НАДФН с образованием восстановленного глутатиона (GSH) и НАДФ. ^ ______________ 2GSH + 2НАДФ Принцип определения активности ГР основан на измерении скорости изменения оптической плотности среды в ходе реакции восстановления GSSG в присутствии энзима и НАДФН. 1 мкМ НАДФН соответствует 1 мкМ GSSG. Оборудование: спектрофотометр СФ-26, термостат, лабораторная посуда. ^ : ЭДТА, НАДФН, GSSG, фосфатный буфер 0,05 М, рН 7,4. Инкубационная смесь: 1 мМ ЭДТА, 0,15 мМ НАДФН, 1мМ GSSG, фосфатный буфер 0,05 М, рН 7,4. Инкубация при T=37 С в течении 10 мин. ^ После инкубации в пробирку добавляется 0,2 мл плазмы или гемолизата эритроцитов (разведение 1: 200). Конечный объем реакционной смеси – 3 мл. Спектрофотометрическое измерение и расчет активности ГР выполняется аналогично определению активности ГП, описанной выше. Единица активности ГР – это количество фермента, которое при Т=37С за 60 мин восстанавливает 1 мкМ GSSG. ^ и содержание изоферментов СОД в плазме и эритроцитах больных СКВ и ССД с различными клиническими вариантами заболевания
^
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Определение активности СОД, ГП, ГР и изоферментов СОД в крови больных СКВ и ССД может быть рекомендовано для использования в качестве дополнительных, вспомогательных тестов в комплексной диагностике активности патологического процесса при этих заболеваниях, дифференциальной диагностике и объективизации контроля эффективности терапии. ЛИТЕРАТУРА
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
 |
Учебное пособие для студентов 6 курса, врачей-интернов и практических врачей Волгоград, 2002 г |
|
Методическое пособие для врачей. М., 2004. 39 с. 2 |
|
Пособие для практических врачей Минск 2004 |
|
Пособие для практических врачей Минск 2004 |
|
Пособие для практических врачей Минск 2004 |
|
Учебно-методическое пособие минск Белмапо 2006 Методическое пособие предназначено для врачей-стоматологов государственных и частных лечебных учреждений.... |
|
Учебно-методическое пособие минск Белмапо 2006 Методическое пособие предназначено для врачей-стоматологов государственных и частных лечебных учреждений.... |
|
Учебно-методическое пособие для студентов лечебного и педиатрического факультетов, интернов, клинических |
|
Учебно-методическое пособие для студентов лечебного и педиатрического факультетов, интернов, клинических |
|
Методическое пособие для преподавателей Волгоград, 2009 удк 161. 1/. 4: 378. 4 |
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям