Изучение структурных компонентов и физико-химических свойств гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей как источника антиоксидантных лекарственных средств 14. 04. 02 фармацевтическая химия, фармакогнозия
|
|
Скачать 402.6 Kb.
|
|
На правах рукописи Жданова Алина Валитовна ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНЫХ КОМПОНЕНТОВ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ НИЗКОМИНЕРАЛИЗОВАННЫХ ИЛОВЫХ СУЛЬФИДНЫХ ГРЯЗЕЙ КАК ИСТОЧНИКА АНТИОКСИДАНТНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Самара – 2011 Диссертационная работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации ^ доктор биологических наук, профессор Аввакумова Надежда Петровна Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор ^ доктор химических наук, профессор Халилов Леонард Мухибович Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Защита состоится « 2 » июня 2011 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 208.085.06 при ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К.Маркса, 165 Б. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «СамГМУ» Минздравсоцразвития России (г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171). Автореферат разослан «____»____________ 2011 г. Ученый секретарь  диссертационного совета,кандидат фармацевтических наук, доцент И.К. Петрухина ^ Актуальность темы. Живой организм, как открытая термодинамическая система, активно реагирует на негативные изменения биосферы, и вместе с тем, характеризуется высоким постоянством состава внутренней среды. Поддержание окислительно-восстановительного гомеостаза, как неотъемлемого свойства живых организмов, обеспечивается комплексом взаимосвязанных биохимических процессов. Нарушение функций редокс-систем тканей и органов является важным звеном патогенеза ряда заболеваний, к которым относятся сахарный диабет, гепатиты различной этиологии [Мехтиев С.Н., 2008], патологии сердечно-сосудистой системы [Барсель В.А., 1998; Решетова Г.Г., 2004; Tang M., 1996], множество онкологических [Бурлакова Е.Б., 1979, Fukushima M, 2001] и аутоиммунных заболеваний, в том числе, ревматоидный полиартрит, склеродермия и другие [Маянский Д.Н., 1991; Меньщикова Е.Б., 2008]. Сказанное обуславливает активный поиск средств лечения окислительно-восстановительных нарушений и коррекции свободнорадикального статуса организма. С этой целью широко используются синтетические антиоксидантные препараты, такие как ионол [Репин В.С, 1998], пробукол (фенбутол) [Оковитый С.В., 2005; Burkitt M.J., 1996], диметилсульфоксид, мексидол [Воронина, 2000] и другие, применение которых ограничено рядом противопоказаний. Причинно-следственные отношения между терапевтическим эффектом и побочными действиями синтетических препаратов остаются недостаточно изученными. Иногда токсическое действие лекарственных средств на организм становится источником серьезных патологий. Вместе с тем, далеко не полностью исчерпаны возможности по разработке и внедрению в фармацевтическую практику терапевтических препаратов на основе природных соединений. Приоритетной задачей фармации в настоящее время является создание инновационных лекарственных субстанций на основе отечественного природного сырья для производства современных конкурентоспособных фармацевтических препаратов. Перспективными с этой точки зрения являются гуминовые вещества, которые предполагают реализацию терапевтического эффекта на субклеточном и молекулярном уровне. Актуально фармацевтическое использование гуминовых веществ пелоидов, формирующихся в восстановительных условиях при участии сульфатредуцирующих микроорганизмов, что отражается на их структуре и химических свойствах, которые определяют биологическую активность соединений. Гуминовые вещества обладают широким спектром терапевтического действия, что подтверждается экспериментальными исследованиями последних лет. Специфические органические вещества обладают адаптогенным [Бузлама А. В., 2010], антитоксическим [Агапов А. И., Аввакумова Н.П., 1999], противомикробным [Жернов Ю.В., 2010], диуретическим [Дубищев А.В., 2010], противовоспалительным [Агапов А.И. 1999; Аввакумова Н.П., 2002; Катунина Е.Е., 2007] действием, а также являются универсальной матрицей, позволяющей ввести в организм человека необходимые микроэлементы в активной форме [Аввакумова Н.П., 2002; Кривопалова М.А., 2010]. Отсутствие в информационных источниках сведений о влиянии гуминовых веществ пелоидов на окислительно-восстановительные процессы обуславливает актуальность и новизну проведенного исследования. ^ Целью настоящей работы является исследование зависимости антиоксидантных свойств гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей от их структурной организации. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
^ Получены новые сведения о структурных компонентах фульвовых, гиматомелановых, гуминовых кислот с использованием ИК, ЯМР, ЭПР-спектроскопии. Установлены особенности молекулярной структуры гуминовых веществ пелоидов. Впервые уточнена и детализирована природа парамагнитных центров в молекулах гуминовых веществ пелоидов, свидетельствующая об их высокой реакционной способности. Установлены соотношения электронодонорных и электроноакцепторных свойств гуминовых веществ пелоидов. Получены новые данные о влиянии гуминовых веществ пелоидов на динамику окислительного стресса в эксперименте. Выявлена антиоксидантная активность фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов, раскрывающая перспективность их использования в фармацевтической практике. Впервые предложен способ количественного определения гуминовых веществ пелоидов методом амперометрии, который может быть использован для стандартизации лекарственных субстанций. ^ Данные об антиоксидантной активности гуминовых субстанций являются основой при выработке алгоритма по рациональной пелоидотерапии с позиций доказательной медицины. Совокупность сведений о составе, структурной организации, а также количественные характеристики антиоксидантной активности и биодоступности гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей являются необходимой базой для создания стандартизированных субстанций и лекарственных препаратов с целью дальнейшего использования в медицинской и фармацевтической практике. Внедрение результатов работы позволит создать новый для России класс лекарственных средств сочетанного действия на основе экологически чистых природных веществ с доступной сырьевой базой. Преимуществами применения пелоидопрепаратов, по сравнению с нативным грязелечением, является уменьшение противопоказаний и возможность использования лечебного фактора вне курортных зон. По результатам исследований оформлено рационализаторское предложение: - удостоверение на рационализаторское предложение № 122 от 1 февраля 2011г. «Средство природного происхождения для лечения инфицированных ран на основе хелатокомплекса гуминовых кислот пелоидов с ионами серебра». Результаты диссертационного исследования внедрены:
Основные положения, выносимые на защиту:
^ Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на «XII конгрессе «Экология и здоровье человека» (г. Самара, 2007), межрегиональной научно-практической конференции по вопросам восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии, посвященной 175-летию ФГУ «Санаторий «Сергиевские минеральные воды» (г. Самара, 2008), XVI и XVIII Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (г. Пенза 2009, 2010), IV Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (г. Москва, 2008), VII Всероссийской конференции с Молодежной научной школой «Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009» (г. Уфа, 2009), региональной конференции «Молодые ученые - медицине», «Аспирантские чтения, 2009» (г. Самара, 2009), V Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» (г. Санкт-Петербург, 2010). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы, из них 6 работ – в ведущих рецензируемых журналах ВАК. ^ Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (государственная регистрация № 01200809998). ^ Диссертационная работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 33 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), трех глав (глава 3,4,5), отражающих результаты собственных исследований, заключения, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 209 источников, из которых 65 – на иностранных языках. Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту. Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований в области гуминовых веществ, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению состава, свойств и применения специфических органических соединений. В главе 2 представлена характеристика объектов и методов исследования. Приведены методики элементного, фотоколориметрического, спектроскопического, хемилюминесцентного, мано- и амперометрического, биохимического и гистологического изучения гуминовых веществ пелоидов. В главах 3-5 экспериментальной части приводятся результаты собственных исследований элементного состава, компонентов молекулярной структуры, антиоксидантной активности в условиях «in vivo» и «in vitro» фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов. Полученные результаты обработаны статистически и представлены в виде таблиц, формул и рисунков, приведенных в тексте диссертации. В заключении проведен сравнительный анализ полученных данных, установлены особенности молекулярной структуры и закономерности изменения антиоксидантных свойств в генетическом ряду гуминовых веществ пелоидов. ^ Объектом нашего исследования явились гуминовые вещества, выделенные из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей ФГУ «Санаторий «Сергиевские минеральные воды» ФМБА России, Самарская область. Фракции фульвовых (ФК), гиматомелановых (ГМК), гуминовых (ГК) и гумусовых кислот (ГсК) были получены из пелоидов по авторским методикам, разработанным на кафедре общей, бионеорганической и биоорганической химии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России» (патенты РФ № 2043107 от 20.07.1992; № 2122414 от 27.11.98). Идентификация и изучение структурных компонентов гуминовых веществ пелоидов. Идентификацию гуминовых веществ осуществляли по общепринятым критериям: элементному составу, коэффициентам цветности: Е4/Е6, характеристическим полосам поглощения ИК– спектров. Полученные результаты сравнивали с литературными данными. Определение элементного состава гуминовых веществ, а именно, содержание углерода, водорода, азота, серы и кислорода проводили на анализаторе фирмы «Carlo Erba EA-1108» при температуре 10100С в постоянном потоке гелия. Согласно результатам элементного анализа содержание углерода находится в интервале 28,6-59,5% (масс.), водорода 3,7-6,2 % (масс.), кислорода 31,3–58,9% (масс.). Таблица 1 ^
Содержание азота колеблется в диапазоне 1,8-5,6% (масс.), серы 1,08 –4,2% (масс.). Полученные результаты соответствуют критериям элементного состава гуминовых веществ, принятым международным гуминовым обществом (IHSS). На основании результатов элементного анализа были рассчитаны величины степени бензоидности и окисленности, а также атомные соотношения Н/С и О/С (табл.1). Максимальная степень бензоидности характерна для гуминовых и минимальна для фульвовых кислот. Это коррелирует со значениями коэффициентов цветности (табл.1), значения которых обратно пропорциональны степени ароматизации фракций. Величина Н/С, указывающая на соотношение ароматических и алифатических компонентов, свидетельствует о том, что в фульвовых кислотах превалируют алифатические, а в гуминовых кислотах – ароматические составляющие. Степень окисленности, показывающая относительное соотношение кислорода, водорода и углерода, указывает (табл.1) на ярко выраженный окисленный характер фульвокислот и достигает значения +0,50. Группа гиматомелановых кислот характеризуется явным преобладанием восстановительных свойств (степень окисленности равна -0,26). Для гуминовых кислот характерно значение степени окисленности близкое к нулю, что свидетельствует об их высокой окислительно-восстановительной буферности. Качественное сравнение относительной интенсивности полос ИК – спектров, снятых спектрометре Spectrum 100 (Perkin Elmer) в диапазоне 400-4200 см-1, позволяет утверждать, что в фульвовых кислотах преобладают алифатические цепочки с большим количеством спиртовых групп, а гуминовые кислоты содержат сопряженные ароматические структуры со значительным содержанием карбоксильных групп (рис.1).  а) б) в) г) ^ г) гумусовых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей Гиматомелановые кислоты, по сравнению с гуминовыми и фульвовыми, по результатам ИК-спектроскопического исследования можно отнести к наиболее ненасыщенной фракции, содержащей значительное количество непредельных фрагментов алифатического и ароматического характера. Анализ относительной интенсивности полос позволяет предположить превалирование кислотных свойств в фульвовых и гиматомелановых кислотах по сравнению с гуминовыми и гумусовыми кислотами. Гуминовые вещества пелоидов характеризуются присутствием в молекулярной структуре ароматического углеродного скелета с различными функциональными группами, среди которых преобладают карбоксильные, гидроксильные, метоксильные и алкильные. Помимо ароматической части, в гуминовых веществах присутствуют алифатические фрагменты различной степени выраженности, обогащенные полисахаридными группам. Спектры ЯМР 1Н и ЯМР 13С регистрировали на спектрометре Bruker Avance-400 (400,13 мГц и 100,62 мГц ) в растворе D2O с числом накоплений N=128 и 30000 соответственно, цифровое разрешение 0,2 Гц/т. Таблица 2 ^ (0,1 М раствор NaOD в D2О)
Регистрация спектра ЯМР 1Н в растворителе NaOD в D2О позволяет провести дифференцированную оценку трех типов атомов водорода: карбоксильных групп (в области от 2,5 м.д. до 4,0 м.д.), ароматических (в области от 6,5 до 8,0 м.д.) и алифатических фрагментов (в области от 0,5 до 2,5м.д.). Анализ спектров ЯМР 1Н и ЯМР 13С (табл.2) показал, что в фульвовых кислотах преобладают разветвленные алифатические цепочки с большим количеством спиртовых групп. Молекулярная структура гуминовых кислот представляет собой ароматический каркас, в котором боковые алифатические заместители включают карбоксильные и спиртовые группы. Установлено, что гиматомелановые кислоты по своей молекулярной структуре имеют существенные отличия от структур других фракций, прежде всего, присутствием не менее четырех типов карбонильных атомов углерода различной природы: хиноидной, сложноэфирной, еноловой, кетонной. Указанная особенность молекулярного строения гиматомелановых кислот определяет наиболее выраженную степень сопряжения структурных фрагментов, и их можно, по-видимому, условно отнести к наиболее ненасыщенной фракции пелоидов. Спектры электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) в виде первой производной сигнала поглощения получали на спектрометре "Bruker EMX plus Х" (~9.75 ГГц). Спектры ЭПР исследуемых фракций имеют приблизительно одинаковый вид (рис.2). В спектрах идентифицируется одна интенсивная широкая линия с g=2,003 (табл.3), свидетельствующая о явном присутствии свободных радикалов в структуре гуминовых веществ. Концентрация парамагнитных центров рассчитывалась по известной концентрации спинов угольного пека, которая составляет 3,66·1015 спин/г.  б)   Рис. 2. ЭПР спектры а) фульвовых б) гиматомелановых в) гуминовых кислот пелоидов Анализ концентраций парамагнитных центров (табл.3) показывает, что минимальное число свободных радикалов содержат молекулы фульвовых кислот пелоидов. Концентрация парамагнитных центров в гиматомелановых кислотах повышается в 6 раз и достигает максимального значения в гуминовых кислотах, возрастая в 34 раза. Концентрация свободных радикалов в гумусовых кислотах принимает промежуточное значение равное 15·1016 спин/г. Таблица 3 ^ в гуминовых веществах пелоидов
Концентрация парамагнитных центров возрастает в ряду фульвовых – гиматомелановых – гуминовых кислот и изменяется симбатно степени ароматичности фракций, рассчитанной на основании результатов элементного анализа. ^ определяли с использованием манометрического, амперометрического и хемилюминесцентного методов. Манометрическое определение антиоксидантной активности проводили на модельной реакции радикально-цепного инициированного окисления 1,4-диоксана в стандартных условиях при температуре 348 К и скорости инициирования Vi= 1·10-7 моль/л•с в кинетическом режиме окисления [Денисов Е.Т, 1997]; в качестве инициатора окислительных процессов выбран азодиизобутиронитрил (АИБН) с использованием модифицированной установки типа Варбурга. Скорость окисления V0 определяли по тангенсу угла наклона кинетической кривой поглощения кислорода (рис.3). Ингибированное окисление 1,4-диоксана проводили в присутствии ионола и фракций гуминовых веществ пелоидов. В этом случае скорость ингибирования V0 определяли по начальному участку кинетической кривой.     Рис. 3. Зависимость начальной скорости окисления 1,4-диоксана (1) и параметра ингибирования F (2) от концентрации гуминовых веществ Из полученных данных следует, что наибольшей антиоксидантной активностью обладают гиматомелановые кислоты: при концентрации 0,2 г/л степень торможения составляет 54% , а при концентрации 2 г/л степень торможения достигает максимального значения – 97% (рис.3). Гуминовые кислоты обладают как антиоксидантными, так и прооксидантными свойствами в интервале концентраций от 1 до 30 г/л и от 30 до 70 г/л соответственно. Максимальная степень торможения окислительного процесса составляет 80,8%. Гумусовые кислоты характеризуются схожими с гуминовыми кислотами антиоксидантными свойствами, но в меньшей степени замедляют процессы ингибированного окисления. Это связано, по-видимому, с более сложной, стохастической структурой, в которой функциональные группы находятся внутри глобулярной макромолекулы, что затрудняет их участие в общей цепи сопряжения. Фульвовые кислоты обладают менее выраженными антиоксидантными свойствами, так как в их структуре преобладают карбоксильные и спиртовые группы, которые, по-видимому, менее активно взаимодействуют с радикалами и обрывая цепь окисления. Зависимость параметра ингибирования F от концентрации фракций гуминовых веществ определяли в координатах уравнения:  ,где  – начальная скорость поглощения кислорода при окислении 1,4-диоксана в отсутствии ингибитора; – начальная скорость поглощения кислорода при окислении 1,4-диоксана в присутствии ингибитора;[AO] – концентрация добавки АО;  – константа скорости обрыва цепи окисления на АО; – константа скорости квадратичного обрыва цепи на пероксильных радикалах субстрата =6,67•107 л/моль•с; Vi=1•10-7 моль/л•c [Денисов Е.Т., 1997; Denisov E.T., 2005].Между параметром ингибирования и концентрацией исследуемых кислот в интервале 0,25-30 г/л наблюдается линейная зависимость и, следовательно, предложенное уравнение удовлетворительно выполняется для всех изученных веществ (коэффициент корреляции > 0,95). Величина  была определена по тангенсу угла наклона зависимости параметра ингибирования F от концентрации гуминовых веществ для каждого образца (рис.3). На основании полученных данных была рассчитана эфффективная константа скорости ингибирования, которая имеет наибольшее значение для гиматомелановых кислот и составляет 8,5 л/г·с. Гуминовые кислоты по эффективной константе скорости ингибирования окислительного процесса уступают гиматомелановым в 2,8, гумусовые кислоты - в 5,0 и фульвовые кислоты - в 6,5 раза, и составляют 3,0 л/г·с, 1,7 л/г·с, 1,3 л/г·с соответственно.Таким образом, гиматомелановые кислоты характеризуются наибольшими значениями манометрических показателей, что указывает на их высокую антиоксидантную активность. Для прямого количественного измерения содержания антиоксидантов в биологических объектах использовали амперометрическое определение, которое проводили на приборе «Цвет Яуза АА-01». Условную массовую концентрацию антиоксидантов измеряли, используя градуировочный график зависимости выходного сигнала силы тока (нА) от концентрации кверцетина, который использовался в качестве стандарта. Максимальное количество антиоксидантов содержится в гиматомелановых кислотах и изменяется от 0,2*10-3 мг/мл при концентрации 0,001% до 73,5*10-3 мг/мл при концентрации 1,0%. В гуминовых кислотах содержание антиоксидантов меньше, чем в гиматомелановых кислотах 2 раза, в гумусовых кислотах - в 3,3 раза, в фульвовых кислотах - в 10 раз (табл.4). Таблица 4 ^ антиоксидантов (ССА) амперометрическим методом
Проведенные исследования показали, что суммарное содержание антиоксидантов прямолинейно зависит от концентрации гуминовых веществ, что позволяет использовать амперометрию для количественного определения гуминовых веществ пелоидов (табл. 5). Нами разработана методика, которая может служить одним из способов стандартизации гуминовых веществ пелоидов. Массовую концентрацию антиоксидантов в гуминовых веществах измеряли, используя градуировочный график зависимости выходного сигнала силы тока (нА) от концентрации гуминовых веществ. Таблица 5 ^ суммарного содержания антиоксидантов в гуминовых веществах пелоидов
Для построения градуировочного графика гуминовых веществ последовательно регистрировали сигналы стандартных растворов в порядке возрастания их концентрации. Для исключения случайных результатов и усреднения данных выполняли пять последовательных измерений для каждого из пяти градуировочных растворов. Предлагаемая методика валидирована по основным критериям, она линейна и воспроизводима. В ходе проведенных исследований показана возможность применения жидкостного хроматографа «Цвет Яуза АА-01» для определения суммарного содержания антиоксидантов в субстанциях гуминовых веществ. Исследование антиоксидантной активности методом Fe2+-индуцированной хемилюминесценции проводили по методике Ю.А. Владимирова. Свечение индуцировали добавлением 1 мл 0,05М раствора железа (II) сульфата, ускоряющего процессы окисления. Определяли спонтанное свечение, амплитуды быстрой и медленной вспышки, светосумму свечения (табл.6). Величины показателей выражали в условных единицах. Таблица 6 ^ фракций гуминовых веществ пелоидов
Наиболее выраженной способностью гасить свободнорадикальные процессы обладают гиматомелановые кислоты, значения светосуммы которых в 3-4 раза меньше, чем в фульвовых кислотах и приблизительно в 1,5 раза меньше, чем в гумусовых кислотах. В фульвовых кислотах амплитуда быстрой вспышки возросла при концентрации 0,01% в 6,5 раз, а при концентрации 1% - в 2,5 раза по сравнению с гиматомелановыми. Следовательно, общая антиоксидантная активность, определенная по способности соединений тормозить реакции свободнорадикального окисления ионов железа, повышается в ряду: фульвовые, гумусовые, гуминовые, гиматомелановые кислоты. Биологическую доступность гуминовых веществ пелоидов определяли фотоэлектроколориметрическим методом диализа через биологические мембраны животного происхождения. По результатам эксперимента рассчитана степень диализа, которая имеет при физиологической кислотности (рН 7,4) максимальное значение у фульвокислот (0,5), а минимальное - у гуминовых кислот (0,2). Гиматомелановые кислоты характеризуются промежуточным значением степени диализа равным 0,35. Введение диметилсульфоксида и ионов металлов повышает биодоступность всех фракций гуминовых веществ, что, по-видимому, обусловлено изменением макромолекулярных конформационных форм. Проведенные исследования доказывают высокую биологическую доступность гуминовых веществ, несмотря на высокое значение их молекулярных масс. Про- и антиоксидантные свойства гуминовых веществ пелоидов условиях in vivo. Эксперимент выполнен на беспородных крысах самцах половозрелого возраста. При проведении опытов неуклонно соблюдали положения Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным [Касаткина Т.Б., 2000]. Животные содержались на стандартном лабораторном рационе в условиях свободного доступа к пище и воде. Экспериментальные исследования проведены в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г «Об утверждении правил лабораторной практики», Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2005г.).Оценка антиоксидантной активности исследуемых соединений проведена в модели острой интоксикации при парентеральном и пероральном введении отдельных фракций гуминовых веществ в дозе 1 мг/кг массы, хемилюминесцентным методом на приборе «Хемилюминометр – ХЛ-003». Контролем служила группа интактных животных. Острую интоксикацию вызывали однократным внутрижелудочным введением отечественной смеси полихлорированных бифенилов (ПХБ) «Совол» в оливковом масле в дозе 600 мг/кг (0,1 LD50). Данная группа животных составила группу сравнения. Полихлорированные бифенилы значительно активизируют процессы свободнорадикального окисления (СРО). Все показатели СРО достоверно изменялись по сравнению с контрольной группой (рис.4): светосумма, отражающая скорость расходования свободных радикалов за счет их взаимодействия с антиоксидантами, увеличилась на 60%; амплитуда быстрой вспышки, характеризующая содержание гидроперекисей, увеличилась на 11%; латентный период времени, определяющий скорость окисление липидов понизился на 33%. Введение растворов компонентов гуминовых веществ сопровождалось статистически значимыми изменениями изучаемых параметров. В сравнении с животными, подвергшимися интоксикации «Соволом», у них наблюдалось снижение спонтанной светимости на 30,31% под действием гиматомелановых и на 52,38% –фульвовых кислот.  а) б)   Рис 4. Значения параметров хемилюминесценции плазмы крови на а) 3 сутки и б) 10 сутки исследования Латентный период увеличился при введении крысам гиматомелановых и гуминовых кислот на 74% и 83% соответственно. Спонтанная светимость снизилась в 2-3 раза под действием гиматомелановых и гуминовых кислот пелоидов. Значения светосуммы также имели тенденцию к понижению. Таким образом, наибольшей способностью угнетать свободнорадикальное окисление модельной системы, а значит, более высокой антиоксидантной активностью обладают гуминовые и гиматомелановые кислоты. Данные Fe2+– индуцированной хемилюминесценции подтверждали результатами определения ТБК-реагирующих продуктов.  ^ Максимальная концентрация продуктов тиобарбитуровой кислоты на третьи сутки в группе сравнения указывает на интенсификацию процессов свободнорадикального окисления липидов, которое несколько снижается (на 10 сутки) вследствии включения антиоксидантных защитных систем организма (рис. 5). Применение компонентов гуминовых веществ вызывает понижение уровня ТБК-реагирующих продуктов по отношению к группе сравнения на 24% при использовании фульвовых, на 63,7% - гиматомелановых, на 43,0% - гуминовых и 46,8% - гумусовых кислот пелоидов. Влияние гуминовых веществ пелоидов на ферментативное звено антиоксидантных систем исследовали по активности супероксиддисмутазы (СОД), каталазы и глутатионперокидазы (ГПО) до и после интоксикации бифенилами (табл.7). ^ восстановительных ферментов в модели окислительного стресса
Введение «Совола» достоверно снижает активность всех антиоксидантных ферментов. При лечении экспериментальных животных растворами гуминовых веществ пелоидов уже к 3-им суткам наблюдалось повышение активности глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы и каталазы, которая достигало нормативных значений. Таким образом, определение количественных характеристик хемилюминесценции, ТБК-реагирующих продуктов и показателей основных антиоксидантных ферментов плазмы крови подтвердило, что свободнорадикальное окисление поддается коррекции при введении гуминовых веществ пелоидов. Объективным критерием оценки антиоксидантной активности являются гистологические исследования. Гистологическая картина свидетельствует о том, что при моделировании окислительного стресса у крыс в печени развиваются выраженные патологические изменения, такие как гибель эпителиоцитов, нарушение радиального расположения печеночных балок и разрыв анастомозов между ними, изменение формы и размеров гепатоцитов. Часть гепатоцитов лишена ядер или находится в состоянии гидропической и баллонной дистрофии и характеризуется отсутствием гликогена в гепатоцитах печеночных долек. На десятые сутки в центральных зонах печеночных долек формируются очаги некроза с усилением венозного застоя (рис.6).   
Под влиянием фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот на 3 сутки происходит уменьшение патологических изменений: синусоиды гемокапилляров умеренно расширены, причем степень расширения уменьшается от центра к периферии, в стенках сосудов и желчных протоков дистрофические изменения носят очаговый характер, большинство гепатоцитов имеют нормальную форму, размеры и структуру (рис.7). На 10 сутки в клетках обнаруживается гликоген, очаги некроза отсутствуют, структура стенки междольковых артерий и желчных протоков в триадах практически не отличается от структуры ткани печени крыс контрольной группы (рис. 8). Таким образом, для коррекции метаболических нарушений при острой интоксикации использованы антиоксидантные препараты группы гуминовых веществ. Экспериментальные данные, полученные различными физико-химическими и химическими методами подтверждают антиоксидантную активность гуминовых веществ пелоидов, которая возрастает в ряду фульвовых, гумусовых, гуминовых, гиматомелановых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей. ВЫВОДЫ:
^
Автор выражает глубокую признательность д.х.н., член-корреспонденту РАН, профессору Джемилеву У.М., д.ф-м.н., с.н.с., профессору Лебедеву Ю.А, д.х.н., профессору Герчикову А.Я., д.х.н., профессору Яшину Я.И., д.м.н., профессору Камилову Ф.Х., к.м.н., доценту Россинской В.В. за консультации при проведении экспериментов. Формат 60х84. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Бумага офсетная. Печать оперативная. Заказ___. Отпечатано в типографии ООО «Офорт». 443070, Самара, ул. Революционная, д. 70, литера П. Тел. 372-06-56, 372-06-57. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям