Исследования по разработке и стандартизации комбинированного антимикробного и регенерирующего препарата на основе лекарственного растительного сырья 14. 04. 02 фармацевтическая химия, фармакогнозия
|
|
Скачать 392.44 Kb.
|
|
На правах рукописи Шагалиева Наталья Рашидовна ИССЛЕДОВАНИЯ ПО РАЗРАБОТКЕ И СТАНДАРТИЗАЦИИ КОМБИНИРОВАННОГО АНТИМИКРОБНОГО И РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Самара – 2012 Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации ^ доктор фармацевтических наук, доцент Авдеева Елена Владимировна Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор ^ доктор химических наук, профессор Онучак Людмила Артемовна Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Защита состоится «___» ___________ 2012 г. в ___ часов на заседании Диссертационного совета Д 208.085.06 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К.Маркса, 165 Б. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171). Автореферат разослан «____»____________ 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук, доцент И.К. Петрухина ^ Актуальность темы. Инфекционно-воспалительные заболевания пародонта являются распространенным явлением среди широких слоев населения. По данным ВОЗ, воспалительными заболеваниями пародонта страдает до 95% взрослого населения земного шара и до 80% детей. В этой связи создание препаратов для стоматологической практики, предназначенных для лечения таких широко распространенных заболеваний пародонта, как гингивит, стоматит, глоссит является весьма актуальным направлением. Среди современных лекарственных средств (ЛС) указанной направленности преобладают лекарственные препараты (ЛП) синтетического происхождения, обладающие наряду с выраженным антимикробным действием и рядом недостатков, такими как высокая сенсибилизирующая активность, постепенное развитие резистентности патогенной и сапрофитной микрофлоры и другими побочными эффектами. С этой точки зрения, лекарственные препараты на основе лекарственного растительного сырья (ЛРС) обладают преимуществами: эффективностью, безопасностью, мягкостью и широтой терапевтического действия, минимальным риском развития аллергизирующего эффекта и возникновения резистентности у микроорганизмов (Киселева Т.Л. и др., 2008; 2010; Куркин В.А., 2007; 2009; Самылина И.А. и др., 2003; 2010). В то же время, ассортимент используемых в настоящее время лекарственных средств растительного происхождения является явно недостаточным и представлен, либо отечественными препаратами («Хлорофиллипт», «Ротокан», «Сальвин», «Настойка календулы», «Настойка эвкалипта» и др.), для которых не характерно комплексное воздействие на обсуждаемую группу заболеваний, либо импортными дорогостоящими комплексными препаратами («Стоматофит», «Мараславин», «Дентинокс», «Калгель», «Элюгель» и др.), не лишенными определенных недостатков. К таковым следует отнести следующие: отсутствие всего необходимого для эффективного лечения спектра фармакологической активности; вышеперечисленные ЛС не содержат оптимальный состав биологически активных соединений (БАС), сонаправленно действующих на патогенетические звенья заболевания и, соответственно, усиливающих целевой (например, антимикробный и противовоспалительный) эффект; способы получения, как правило, не являются оптимальными в плане экстракции, так как не позволяют исчерпывающе извлекать весь комплекс действующих веществ. В этой связи очевидна целесообразность разработки нового лекарственного препарата на основе направленной комбинации БАС нескольких видов ЛРС для обеспечения комплексного действия на инфекционно-воспалительный процесс в ротовой полости (в частности, заболеваний пародонта). ^ Целью настоящей работы являлась разработка и стандартизация нового комбинированного антимикробного и регенерирующего лекарственного препарата на основе лекарственного растительного сырья, предназначенного для применения в стоматологической практике. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1. Обоснование состава нового комбинированного лекарственного препарата «Дентос» на основе ЛРС. 2. Разработка способа получения лекарственного препарата «Дентос» (в форме сложной настойки). 3. Изучение параметров качества и обоснование подходов к решению вопросов стандартизации ЛП «Дентос» (сложная настойка). 4. Разработка методик качественного и количественного анализа для ЛП «Дентос» (сложная настойка). 5. Выбор оптимальной пролонгированной лекарственной формы (ЛФ) для разработанного лекарственного препарата и способа получения. 6. Адаптация методик анализа, разработанных для лекарственного препарата «Дентос» (сложная настойка), для стоматологического геля на его основе. 7. Изучение безопасности и специфической фармакологической активности (противовоспалительной, антимикробной, регенерирующей) нового лекарственного препарата «Дентос» в форме сложной настойки и в форме геля. 8. Изучение показателей качества нового лекарственного препарата «Дентос». 9. Разработка проекта фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на ЛП «Дентос». ^ Разработан состав нового оригинального комбинированного лекарственного препарата «Дентос», предназначенного для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний ротовой полости (получен Патент РФ на изобретение № 2428171 от 10.09.2011 г. «Состав лекарственной фитосубстанции с антимикробными и противовоспалительными свойствами «Дентос»; Заявка № 2009143215, приоритет изобретения 25.11.2009 г.). В пропись ЛП «Дентос» включены следующие виды ЛРС: листья эвкалипта (Eucaliptus viminalis Labill.), трава эхинацеи пурпурной (Echinacea purpurea (L.) Moench.), цветки календулы (Calendula officinalis L.), кора дуба (Quercus robur L.), а также масло гвоздичного дерева (Caryophyllus aromaticus L.). В концепции создания нового лекарственного препарата заложен комплексный подход воздействия БАС указанных видов ЛРС на разные звенья патогенеза и клинические проявления за счет присущего данным соединениям широкого спектра фармакологической активности: антимикробной (эуглобали эвкалипта, эвгенол – эфирное масло гвоздичного дерева); противовоспалительной (гидроксикоричные кислоты, представленные кофейной, цикориевой и хлорогеновой кислотами эхинацеи и календулы, полифенольные соединения дуба); регенерирующей активности (каротиноидный комплекс календулы и эфирные масла); местного иммуномодулирующего действия (цикориевая кислота и другие производные кофейной кислоты), вяжущего действия и обусловленного им местного анестезирующего и противовоспалительного эффектов (полифенольные соединения дуба и эвкалипта). Предложен способ получения ЛП «Дентос» (в форме сложной настойки), предназначенного для применения в варианте полоскания (в результате микробиологических исследований достаточным является разведение 5:50). Для получения данного экстракционного препарата предложен метод модифицированной дробной ремацерации, позволяющий достичь эффективности экстракции на уровне 80-85% для основных групп БАС. Кроме того, по результатам проведенных технологических и фармакологических исследований была выбрана пролонгированная лекарственная форма - гель на основе натрий-карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ) с 15%-ым содержанием настойки «Дентос». При решении проблемы стандартизации комплексного препарата «Дентос» (в форме сложной настойки и в форме геля) с учетом содержания в нем различных по физико-химическим свойствам фенольных (фенилпропаноиды, флавоноиды, дубильные вещества) и терпеноидных соединений (эфирные масла, эуглобали, каротиноиды), применен многоуровневый аналитический подход к оценке содержания основных групп БАС при их совместном присутствии. Для обоснования показателей качества нового ЛП «Дентос» нами предлагается комплексный подход, подразумевающий применение адекватного набора аналитических методов, который заключается в последовательном определении суммы окисляемых веществ перманганатометрическим методом (фенилпропаноиды, простые фенолы, флавоноиды, дубильные вещества, некоторые терпеноиды) и рассматривается нами как интегральный показатель содержания действующих БАС и каждой конкретной группы действующих веществ с учетом их совместного присутствия: суммы фенилпропаноидов, суммы флавоноидов, суммы эуглобалей. ^ В результате проведенных фитохимических, аналитических, технологических, микробиологических и доклинических фармакологических исследований разработаны состав, способ получения, показатели качества и методы их оценки, установлен спектр фармакологической активности для комплексного антимикробного и ранозаживляющего препарата «Дентос» (сложная настойка), а также лекарственной формы гель на его основе. Изучены нормы качества и предложены методики качественного и количественного анализа основных групп действующих веществ ЛП в форме сложной настойки и в форме геля, отвечающие принципам гармонизации и унификации, предъявляемым к современному фармацевтическому анализу. В частности, титриметрическим методом (перманганатометрия) определяется сумма окисляемых веществ, методом прямой спектрофотометрии определяется сумма фенилпропаноидов в пересчете на кофейную кислоту, в варианте дифференциальной спектрофотометрии определяется сумма флавоноидов в пересчете на рутин, методом прямой спектрофотометрии в пересчете на ГСО эвкалимина и ВЭЖХ-анализа (в обоих вариантах - с использованием пробоподготовки) определяется содержание основных, отвечающих за антимикробную активность соединений - фенолальдегидов эвкалипта (эувимали). Результаты проведенных исследований нашли отражение в проекте ФСП «Дентос» (сложная настойка), который представлен на экспертизу в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского назначения» Минздравсоцразвития РФ (входящий № 10395 от 30.08.11 г.). Целесообразность дальнейших исследований по внедрению новых ЛП в медицинскую практику подтверждена результатами микробиологических исследований (установлен достоверно значимый бактериостатический эффект в отношении St. aureus, Kl. pneumonia, Candida, E. coli, St. haemolyticus, Ps. Aeruginosa) и фармакологических исследований (доказана выраженная ранозаживляющая и противовоспалительная активность, сопоставимая с синтетическим препаратом «Хлоргексидин» и имеющая преимущества перед растительным препаратом «Стоматофит» - действует в меньшей концентрации и не вызывает таких побочных эффектов, как появление нагноения и спонтанной кровоточивости. Результаты диссертационных исследований используются в учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии и кафедре химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России, (акты внедрения СамГМУ от 10. 05. 2011 г. и 19.10.11 г.), в ГБОУ ВПО НГМУ Минздравсоцразвития России (акт внедрения НГМУ от 26.10.11 г.) а также планируется к внедрению «Дентос» в форме настойки на ЗАО «Самаралектравы, «Дентос» в форме геля в ООО «Самара-фит» (акты внедрения от 11.10.2011 г. и 20.10.2011 г.). Основные положения, выносимые на защиту: 1. Обоснование состава нового комбинированного лекарственного препарата «Дентос» по данным химического состава и спектра фармакологической активности изучаемых видов ЛРС. 2. Результаты исследований по разработке технологического способа получения лекарственного препарата «Дентос» в форме сложной настойки и в форме геля. 3. Результаты исследований по обоснованию подходов к стандартизации комбинированного лекарственного препарата «Дентос» (сложная настойка) и разработке методик его качественного и количественного анализа. 4. Результаты исследований по адаптации разработанных методик качественного и количественного анализа сложной настойки к разработанному на ее основе гелю. 5. Данные по изучению безопасности и специфической фармакологической активности (антимикробной, регенерирующей и противовоспалительной). ^ Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (№ Гос. регистрации 01200900658). ^ Материалы работы доложены и обсуждены на XIV и XVI Всероссийском конгрессе “Экология и здоровье человека” (г. Самара, 2009, 2011), конференции дипломированных специалистов Аспирантские чтения «Молодые ученые - медицине» (г. Самара, 2009, 2010, 2011), II Российском фитотерапевтическом съезде (г. Москва, 2010), научно-практической конференции «Актуальные вопросы стоматологии» (г. Самара, 2010), XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2011). Выполнение фрагментов диссертационного исследования профинансировано по линии программы «Участник Молодежного Научно-Инновационного Конкурса – 2009» («У.М.Н.И.К.»), «У.М.Н.И.К. на СТАРТ» (Всероссийский Форум «Селигер-2010»: Тверская обл., о. Селигер, 2010) (Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере); областного конкурса «Молодой ученый – 2011». Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 21 научных работах, из них 9 статей в журналах, рекомендуемых ВАК РФ. ^ Диссертационная работа изложена на 148 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц, 31 рисунок. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), обсуждения результатов собственных экспериментальных исследований (главы 3-6), общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 172 источника, из которых 37 - на иностранных языках. В Приложение вынесены акты внедрения, проект ФСП на ЛП «Дентос», патент РФ на изобретение, фрагмент лабораторного технологического регламента, протоколы исследования токсичности и специфической фармакологической активности. ^
зависимости «химический состав – фармакологический эффект» Основываясь на результатах многолетних фитохимических, аналитических, технологических и микробиологических исследований ЛРС и лекарственных препаратов, содержащих преимущественно БАС фенольной природы, проводимых на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии совместно с другими кафедрами медико-биологического профиля ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России, на основе систематизации литературного материала, а также собственных предварительных скрининговых исследований по определению выраженности и спектра антимикробной активности ряда видов ЛРС и их комбинаций, в пропись ЛП «Дентос» нами были включены пять компонентов. В состав отобранных видов ЛРС входят разнообразные группы БАС фенольной и терпеноидной природы. Это - эвкалипт прутовидный (Eucaliptus viminalis Labill., сем. Миртовые – Myrtaceae), эхинацея пурпурная (Echinacea purpurea (L.) Moench., сем Сложноцветные – Asteraceae), календула лекарственная (Calendula officinalis L., сем. Сложноцветные – Asteraceae), дуб обыкновенный (Quercus robur L., сем. Буковые – Fagaceae), гвоздичное дерево (Caryophyllus aromaticus L., сем. Миртовые – Myrtaceae). Выбор данного круга растений обусловлен комплексным подходом, который мы предлагаем для решения проблем, связанных с инфекционно-воспалительным процессом в слизистой оболочке ротовой полости. БАС вышеперечисленных растений оказывают сочетанное (в ряде случаев - синергетическое) воздействие на различные звенья патологического процесса, позволяя воздействовать как на причину возникновения заболевания (микробные агенты, снижение местного иммунитета), так и на последствия (отек, воспаление, разрыхление тканей слизистой, болевые ощущения). Данные виды лекарственных растений являются признанным источником для получения мягких и эффективных ЛП, обладающих антимикробным, противовоспалительным, иммуномодулирующим, ранозаживляющим, регенерирующим, вяжущим, антисептическим и дезодорирующим действиями. Спектр биологической и фармакологической активности основных групп БАС для указанных видов растений через призму зависимости «химический состав – фармакологический эффект» представлен в таблице 1. Высокая антимикробная активность, сравнимая с некоторыми антибиотиками, подтвержденная в ходе микробиологических экспериментов на базе кафедры общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии, проявляется за счет эуглобалей эвкалипта (эувималь-1), эвгенола – основного компонента эфирного масла гвоздичного дерева, традиционно применяемого в стоматологической практике и обладающего мощным антисептическими бактерицидным действием. Противовоспалительное действие, усиливающее антимикробный эффект, обусловлено содержанием гидроксикоричных кислот (представлены кофейной, цикориевой и хлорогеновой кислотами эхинацеи и календулы), а также полифенольными соединениями дуба, флавоноидным и полисахаридным комплексом эхинацеи и календулы, сапонинами календулы и др. Мощное регенерирующее и ранозаживляющее действие, характерное для каротиноидного комплекса календулы, основным компонентом которого является β-каротин, дополняет антимикробный и противоспалительный эффекты и способствует ускорению процессов заживления и восстановления поврежденных тканей слизистой ротовой полости. Таблица 1 ^ и обусловливающих его фармакологические эффекты
Основные эффекты (антимикробный, противовоспалительный и регенерирующий), в нашем случае они и являются целевыми, дополняются местным иммуномодулирующим действием (цикориевая кислота и другие производные кофейной кислоты, полисахаридный комплекс эхинацеи и календулы), что способствует восстановлению иммунитета на местном, локальном уровне. Вяжущее действие проявляется за счет полифенольного комплекса дуба – галловой, эллаговой кислот, катехина, входящими в состав гидролизуемых и конденсированных дубильных веществ, и обусловливает местный анестезирующий и противовоспалительный эффекты, усиливает местное анальгезирующее действие эвгенола и цинеола. Вышеперечисленные доводы нашли отражение в прописи состава ЛП «Дентос». ^ Листьев эвкалипта 80,0 Коры дуба 40,0 Цветков календулы 40,0 Травы эхинацеи пурпурной 40,0 Спирта этилового 70% до получения 1 литра настойки Эфирное масло гвоздики 1, 0 мл ЛП «Дентос» представляет собой по технологическому способу получения сложную настойку, получаемую методом модифицированной дробной ремацерации, с использованием 70% спирта этилового в качестве экстрагента.
Стандартизация многокомпонентных лекарственных препаратов является традиционно сложной задачей, особенно, когда речь идет об анализе сложного суммарного препарата растительного происхождения. Новый лекарственный препарат «Дентос» на основе ЛРС представляет собой сложную фитокомпозицию и сочетает в себе различные виды БАС: фенилпропаноиды, флавоноиды, дубильные вещества, каротиноиды, терпеноидный комплекс и др., относящихся к различным химическим классам веществ, и, соответственно, обладающих различными физико-химическими характеристиками. Вышеперечисленные факторы делают анализ данного лекарственного препарата достаточно наукоемкой проблемой, требующей комплексного многоуровневого подхода к решению вопросов стандартизации. Принципиальная схема предложенных нами аналитических подходов к стандартизации ЛП «Дентос» представлена на рис. 1.                             Рис. 1 а. Принципиальная схема качественного анализа разрабатываемого лекарственного препарата «Дентос»  ^ лекарственного препарата «Дентос» Качественный анализ предложено проводить с помощью пробирочных реакций на соединения фенольной природы с подтверждением природы соединений по характеру спектра поглощения в УФ-области. 2.1. Подлинность Качественные реакции. Из числа рассмотренных реакций (из-за наличия собственной окраски препарата, которая в некоторой степени маскирует аналитический эффект реакций, от целого ряда реакций пришлось отказаться) по четкости проявления и трактовке аналитического эффекта, воспроизводимости и чувствительности нами были отобраны три качественные реакции: цианидиновая реакция по Брианту (флавоноиды), реакция с раствором алюминия хлорида (III) (флавоноиды, фенольные соединения), реакция с железоаммонийными квасцами или хлоридом окисного железа (дубильные вещества преимущественно конденсированной природы). Характер УФ-спектра. Оценка характера УФ-спектра является одним из наиболее информативных методов анализа, поэтому он предлагается нами как для подтверждения подлинности лекарственного препарата (рис. 2), так и для количественного определения. На УФ-спектре раствора Б исследуемого препарата, приготовленного для количественного определения (см. раздел «Количественное определение»), обнаруживается максимум поглощения при 278 нм 3 нм и «плечо» при 327 нм 3 нм, которые связаны в коротковолновой области (278 нм) с вкладом в абсорбцию комплекса фенолальдегидов эвкалипта, флавоноидов календулы, эхинацеи и эвкалипта, дубильных веществ дуба и эвкалипта; «плечо» при 327 нм обусловлено содержанием фенилпропаноидов – гидроксикоричных кислот эхинацеи и календулы. Таким образом, характер электронного спектра в анализируемой области 200 – 380 нм обусловлен содержанием указанных групп действующих веществ препарата.  ^ По причине высокой сложности состава ЛП применение метода ТСХ-анализа для решения вопросов подлинности довольно проблематично, поскольку не позволяет достигнуть эффективного разделения анализируемых групп БАС. ^ В качестве числовых показателей качества целесообразно использовать следующие: определение суммы окисляемых веществ, суммы фенилпропаноидов в пересчете на кофейную кислоту, суммы флавоноидов в пересчете на рутин, суммы фенолальдегидов терпеноидов в пересчете на ГСО эвкалимина и содержание основного антимикробного компонента – эувималь-1. ^ , для данного лекарственного препарата рассматриваемое как интегральный показатель содержания комплекса фенольных БАС, осуществлялось по стандартной методике (ГФ XI). Содержание колебалось в диапазоне 0,71% - 0,87% , что позволяет рекомендовать в качестве нижнего предела данного показателя содержание не менее 0,70%. Методика количественного определения суммы окисляемых веществ. К 2 мл препарата прибавляют 500 мл воды, 25 мл раствора индигосульфокислоты и титруют при постоянном перемешивании 0,02 М раствором калия перманганата, приготовленным из фиксанала. В точке титрования наблюдается переход окраски от сине-зеленого до золотисто-желтого окрашивания. Параллельно проводят контрольный опыт. 1 мл 0,02 М раствора калия перманганата соответствует 0,004157 г дубильных веществ в пересчете на танин. Содержание окисляемых веществ (X) в процентах в пересчете на танин вычисляется по формуле:  , гдеV – объем титранта, израсходованного на титрование препарата; Vк – объем титранта, израсходованного на контрольный опыт; T – титр в пересчете на танин, г; Vп – объем препарата, взятого для анализа, мл. Таблица 2 ^
Для определения суммы фенилпропаноидов нами предложен метод прямой спектрофотометрии при 327 нм 3 нм (разведение 1:500) в пересчете на кофейную кислоту (удельный показатель E1%1см = 700). УФ-спектр этанольного раствора разрабатываемого лекарственного средства представлен на рис. 2 (в разделе Подлинность), где под цифрой 1 (λ = 278 нм) обозначен максимум светопоглощения, характерный для фенолальдегидов, под цифрой 2 (λ = 327 нм) - максимум, характерный для гидроксикоричных кислот. Методика количественного определения суммы фенилпропаноидов в пересчете на кофейную кислоту. 5 мл препарата помещают в мерную колбу емкостью 50 мл и доводят объем раствора 70% спиртом этиловым до метки; содержимое колбы тщательно перемешивают. Затем 2 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят 95% спиртом этиловым до метки и перемешивают. В качестве раствора сравнения используют 95% спирт этиловый. Измерение оптической плотности проводят при длине волны 327 нм. Расчетная формула имеет следующий вид:  , гдеD – оптическая плотность испытуемого раствора; Vк – объем колбы; Vп – объем препарата;  – удельный показатель светопоглощения кофейной кислоты при λ=327 нм (700).Таблица 3 ^ определения суммы фенилпропаноидов в лекарственном препарате «Дентос»
Проведенные опыты с добавками (кофейной кислоты) свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки разработанной методики. Значения анализируемого показателя колебались от 0,21% до 0,40%, что позволило рекомендовать в качестве нижнего предела содержание суммы фенилпропаноидов: не менее 0,2%. ^ предложено осуществлять методом прямой спектрофотометрии в пересчете на ГСО эвкалимина при 278 нм (рис. 3 и 4). Для исключения вклада в величину светопоглощения в этой области других веществ с учетом физико-химических характеристик изучаемых веществ нами предложен вариант пробоподготовки с использованием гексана. Методом ВЭЖХ и ТСХ установлено, что гексановые извлечения из лекарственного препарата содержат очищенную гамму фенолоальдегидов и β-каротин, тогда как в УФ-спектре исходного препарата, как упоминалось, свой вклад в обсуждаемой области также вносят комплекс фенольных соединений эвкалипта, флавоноидов календулы, полифенольный комплекс дуба и эвгенол. При этом важно подчеркнуть, что прямому спектрофотометрическому определению фенолальдегидов в гексановом извлечении присутствие β-каротина не мешает, поскольку его максимум светопоглощения находится за пределами анализируемой области (450 нм).
Методика количественного определения суммы фенолальдегидов терпеноидов в пересчете на эвкалимин. Гексановые извлечения из лекарственного препарата получают при семикратной обработке по 5 мл гексана 5 мл исходного препарата с использованием делительной воронки. Полученные гексановые извлечения объединяют в мерную колбу емкостью 50 мл, доводят гексаном до метки, затем отбирают 2 мл и помещают в мерную колбу емкостью 25 мл и доводят гексаном до метки (разведение 1:125). В качестве раствора сравнения используют гексан. Измерение оптической плотности проводят при длине волны 278 нм. Расчетная формула имеет следующий вид:  , гдеD – оптическая плотность испытуемого раствора; Vк – объем колбы; Vп – объем препарата;  – удельный показатель светопоглощения эвкалимина при λ=278 нм (417).Таблица 4 ^
Значения анализируемого показателя – суммы фенолальдегидов терпеноидов – колебались в диапазоне от 0,11% до 1,18%, что позволило рекомендовать в качестве нижнего предела содержание: не менее 0,10%. Для определения суммы флавоноидов применялась широко используемая методика дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на рутин. УФ-спектры спиртовых растворов ГСО рутина и нового комплексного фитопрепарата представлены на рисунках 5, 6 и 7. Выбор аналитического метода количественного определения флавоноидов основан на том, что спектрофотометрия дает оценку всего флавоноидного комплекса (что согласуется и с трактовкой их суммарного вклада в фармакологическую активность), а ВЭЖХ с учетом присутствия более 20 флавоноидов в составе «Дентоса» на этапе выполнения НИР и последующего практического воплощения требует использования соответствующего количества веществ-стандартов, использования нескольких хроматографических систем, режимов элюирования и сложных последующих расчетов. Все это и некоторая вариабельность содержания флавоноидов в используемых видах ЛРС делает использование ВЭЖХ для определения флавоноидов проблематичным.  Рис. 5. Электронный спектр спиртовых растворов ГСО рутина: исходного раствора (1) и в присутствии AlCl3 (2)  Рис. 6. Электронный спектр раствора рутина (дифференциальный вариант)  ^ исходный раствор (1), раствор в присутствии AlCl3 (2), дифференциальный спектр (3) Методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин. 5 мл препарата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора 70% спиртом этиловым до метки; содержимое колбы тщательно перемешивают (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 3% раствора хлорида алюминия в 95% спирте этиловом и доводят объем раствора 95% спиртом этиловым до метки (испытуемый раствор Б). В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл испытуемого раствора А, доведенного до метки 95% спиртом этиловым в мерной колбе, вместимостью 25 мл (раствор сравнения Б). Параллельно измеряют оптическую плотность испытуемого раствора Б рутина. Раствором сравнения служит раствор Б рутина, приготовленный аналогично испытуемому, но без добавления раствора алюминия хлорида. Измерение оптической плотности проводят при длине волны 412 нм через 40 мин после приготовления всех растворов. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в процентах (X) вычисляют по формуле:  , гдеD – оптическая плотность испытуемого раствора; D0 – оптическая плотность раствора ГСО рутина; m0 – масса ГСО рутина; Vп – объем препарата. Таблица 5 ^
В серии экспериментов установлено, что содержание суммы флавоноидов (в пересчете на рутин) в препарате колеблется в диапазоне: 0,21% – 0, 37%, что позволяет рекомендовать в качестве нижнего предела содержание: не менее 0,20%. Отсутствие систематической ошибки разработанной методики подтверждено опытами с добавками (рутин). Следует отметить, что расчетным путем можно определить количественное содержание дубильных веществ в ЛП «Дентос» путем вычитания из полученных значений содержания окисляемых веществ значений содержания суммы фенилпропаноидов, флавоноидов и фенолальдегидов, оцененных спектрофотометрически. В этом случае нижний предел содержания дубильных веществ составит: не менее 0,2%. Кроме того, нами изучена возможность использования метода ВЭЖХ-анализа для целей стандартизации «Дентос», являющегося суммарным многокомпонентным извлечением из пяти видов ЛРС. Как отмечалось, применение в нашем конкретном случае метода ВЭЖХ-анализа для оценки содержания групп БАС является затруднительным, но очевидны методологические преимущества метода для объективной оценки содержания ключевых компонентов – эувималей – основных соединений, отвечающих за антимикробную активность препарата (рис. 8, 9 и 10). Подвижная фаза ацетонитрил-вода (25:75) с добавлением 1 % ледяной уксусной кислоты  ^ в форме сложной настойки Подвижная фаза ацетонитрил-вода (25:75) с добавлением 1% ледяной уксусной кислоты  ^ в форме сложной настойки после пробоподготовки
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям