Механизмы дизрегуляции кооперации эозинофилов и иммуноцитов при больших эозинофилиях крови 14. 00. 16 патологическая физиология 03. 00. 25 гистология, цитология, клеточная биология
|
|
Скачать 0.64 Mb.
|
|
На правах рукописи Литвинова Лариса Сергеевна МЕХАНИЗМЫ ДИЗРЕГУЛЯЦИИ КООПЕРАЦИИ ЭОЗИНОФИЛОВ И ИММУНОЦИТОВ ПРИ БОЛЬШИХ ЭОЗИНОФИЛИЯХ КРОВИ 14.00.16 – патологическая физиология 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Томск – 2007 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» ^ доктор медицинских наук, Рязанцева профессор Наталья Владимировна доктор медицинских наук, академик РАМН, профессор, Новицкий Заслуженный деятель науки РФ Вячеслав Викторович ^ доктор медицинских наук, профессор Степовая Елена Алексеевна, профессор биохимии и молекулярной биологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Дыгай Александр Михайлович, заместитель директора по НИР ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Шкурупий Вячеслав Алексеевич, директор ГУ НЦ клинической и экспериментальной медицины СО РАМН ^ ГУ Российский НИИ гематологии и трансфузиологии, г. Санкт-Петербург Защита состоится «___» __________2007 г. в ______часов на заседании диссертационного совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете (643050, г. Томск, ул. Московский тракт, 2) С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета Автореферат разослан «___» __________ 2007 г. У  ченый секретарьдиссертационного совета Суханова Г.А. ^ Актуальность проблемы. Гиперэозинофильная реакция крови сопровождает течение многочисленной группы нозологических форм и синдромов, имеющих разные механизмы развития, прогноз и исход [Коровина Н.А. и соавт., 2002; Чучалин А.Г., 2003; Ольшанская Ю.В. и соавт., 2005]. Явление пролонгированного пребывания эозинофильных клеток в периферической крови привлекает интерес многих исследователей в связи с ключевой ролью этих клеток в реализации патогенеза аллергических заболеваний и паразитарных инвазий, где они выступают в роли эффекторных клеток и факторов защиты, предотвращая генерализацию иммунного ответа и обеспечивая эффективную элиминацию инфектогенов паразитарной природы [Джальчинова В. Б., Чистяков Г. М., 1999; Озерецковская Н.Н., 2000; Hamelmann E., Gelfand E.W., 2001; Коровина Н.А. и соавт., 2002; Семенкова Е.Н. и соавт., 2004; Das A.M. et al., 2005]. В современной литературе появляется множество работ, свидетельствующих об участии эозинофильных гранулоцитов в реализации противоопухолевого иммунитета как звена неспецифической резистентности врожденного иммунитета [Гриншпун Г.Д., Виноградова Ю.Е., 1983; Мокеева Р.А. и соавт., 2000; Воробьев А.И., 2003; Чучалин А.Г., 2003; Семенкова Е.Н. и соавт., 2004; Caruso R.A. et al., 2004; Ольшанская Ю.В. и соавт., 2005; Абдулкадыров К.М., 2006]. Накопленные к настоящему времени в мировой литературе многочисленные сведения, касающиеся особенностей эозинофильного гомеостаза в норме и при реализации патологического процесса, свидетельствуют, что, с одной стороны, эозинофил является одной из наиболее агрессивных эффекторных клеток воспаления, а с другой, - выступает как важный фактор поддержания тканевого и иммунологического гомеостаза, принимая участие в регуляции функций иммунокомпетентных клеток, процессах фагоцитоза, клеточной репарации, свертывания крови и др. [Джальчинова В.Б., Чистяков Г.М., 1999; Воробьев А.И. и соавт., 2000; Dvorak A.M., Weller P.F., 2000; Волкова М.А., 2001; Чучалин А.Г., 2003; Ешану В.С., 2004]. Рассмотрение вопроса о переосмыслении физиологической роли эозинофилов продиктовано прежде всего фактическими данными о взаимодействии эозинофильных гранулоцитов с иммунокомпетентными клетками макроорганизма. В настоящее время одним из наиболее развивающихся направлений биомедицинских исследований становится изучение молекулярных механизмов нарушений кооперативных взаимодействий эффекторных клеток в патогенезе различных заболеваний. Очевидно, что межклеточная кооперация, осуществляя ключевую роль в регуляции гомеостаза клеток, определяет направление их дифференцировки, а также реализацию многих эффекторных клеточных функций [Ярилин А.А., 1999; Иванов А.А. и соавт., 2005]. Важную роль в становлении и стабилизации контактов между взаимодействующими клетками макроорганизма играет цитокин-рецепторная сеть. Посредством цитокинов, синтезируемых и секретируемых клеткой, осуществляются лиганд-рецепторные взаимодействия за счет связывания растворимых веществ с аффинным рецептором на клеточной поверхности [Ярилин А.А., 2001; Кетлинский С.А., 2002; Симбирцев А.С., 2002, 2004]. Существующая между клетками иммунной системы и эозинофилами взаимонаправленность эффектов обусловлена как иммуномодулирующим действием иммунокомпетентных клеток, так и способностью лейкоцитов эозинофильного ряда активировать иммуноциты и вызывать поляризацию иммунного ответа в ту или иную сторону за счет секреции иммунорегуляторных молекул [Gulbenkian A.R. et al., 1992; Беклемишев И.Д., 1998; Минеев В.Н. и соавт., 2000; Намазова Л.С. и соавт., 2000; Nagase H. et al., 2001; Воробьев А.И., 2002; Lampinen M. et al., 2004; Бережная Н.М. и соавт., 2005]. В свою очередь дизрегуляция функционирования компонентов, составляющих основу межклеточной кооперации, может обусловливать нарушение процессов созревания, активации и реализации программированной гибели эозинофильных гранулоцитов и приводить к длительному пребыванию последних в периферической крови. В целом, исследования последних лет показали, что, несмотря на повышенный интерес исследователей к этой проблеме и большое количество экспериментальных и клинических работ, в настоящее время механизмы и целесообразность развития эозинофилии крови при патологических процессах разного генеза изучены недостаточно, а имеющиеся в современной литературе данные носят весьма неоднозначный характер и касаются, в основном, лишь клинической стороны вопроса. Цель исследования: установить механизмы нарушения кооперативного взаимодействия иммуноцитов и эозинофилов при заболеваниях, сопровождающихся развитием эозинофилии крови. Задачи исследования: 1. Дать комплексную оценку морфофункциональных свойств эозинофильных гранулоцитов периферической крови у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови и у больных описторхозом, ассоциированных с эозинофилией крови. 2. Оценить роль дисбаланса эозинофилспецифичных цитокинов (IL-3, IL-4, IL-5, GM-CSF и эотаксина), регулирующих процессы пролиферации, дифференцировки и активации эозинофильных клеток, в механизмах нарушения межклеточной кооперации при заболеваниях, сопровождающихся формированием эозинофилии крови (лимфопролиферативные заболевания системы крови и описторхоз). 3. Выявить механизмы нарушения цитокинопосредованной кооперации эозинофилов и иммуноцитов при заболеваниях, осложненных формированием эозинофилии крови (лимфопролиферативные заболевания системы крови и описторхоз). 4. Оценить роль нарушений апоптотической гибели эозинофилов в механизмах развития большой эозинофилии крови при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови и гельминтозе, обусловленном O.felineus. 5. Установить общие закономерности и особенности реализации механизмов кооперации эозинофилов и иммуноцитов при формировании большой эозинофилии крови при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови и описторхозе. Научная новизна. Впервые с привлечением широкого комплекса современных гематологических, иммунологических и молекулярно-биологических методов исследования представлены фундаментальные механизмы формирования эозинофильной реакции крови при патологических процессах разного генеза с позиций нарушения кооперативного взаимодействия иммуноцитов и эозинофилов. Впервые обосновано, что у пациентов с гемобластозами (лимфогранулематоз, множественная миелома и неходжкинске лимфомы) и у больных описторхозом (острая и хроническая формы), сопровождающихся гиперэозинофилией крови, нарушен морфофункциональный статус эозинофильных гранулоцитов (изменены морфометрические характеристики ядра и цитоплазмы, увеличены содержание внутриклеточных катионных протеинов и активность пероксидазы, усилена фагоцитарная активность, клетки имеют признаки дегрануляции и цитолиза). Показано, что при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови и гельминтозе, обусловленном паразитированием O.felineus, ассоциированных с развитием эозинофильной реакции крови, интенсификация процессов, опосредующих реализацию кислороднезависимых и кислородзависимых механизмов микробицидности, приводит к формированию высокого цитотоксического потенциала эозинофильных гранулоцитов, что может обусловливать негативное влияние длительной гиперэозинофилии крови на течение основной патологии. Впервые установлено, что механизмы развития эозинофилии, осложняющей течение лимфопролиферативных заболеваний системы крови и описторхоза, сопряжены с изменением кооперативного взаимодействия эозинофильных гранулоцитов и мононуклеарных клеток. Данное положение подтверждается фактом обнаружения повышенной продукции мононуклеарами эозинофилспецифичных медиаторов (IL-3, IL-5, IL-4 и GM-CSF) и увеличением уровня эотаксина в сыворотке крови с возрастанием на эозинофилах презентации мембранноассоциированных рецепторов к IL-3, IL-5 и эотаксину. Получены новые данные, свидетельствующие о снижении резервной способности эозинофильных гранулоцитов презентировать рецепторы к IL-3 и IL-5 при инкубации клеток in vitro с рекомбинантными формами одноименных цитокинов. Установлен факт угнетения апоптоза эозинофилов при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови и описторхозной инфекции. Приоритетными являются данные о роли нарушений цитокинопосредованной программированной гибели эозинофилов в патогенезе больших эозинофилий крови. Результаты экспериментальных исследований in vitro свидетельствуют, что при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови на фоне низких значений базального апоптоза эозинофильных клеток, дополнительное воздействие на них рекомбинантных форм цитокинов, регулирующих гомеостаз эозинофильных гранулоцитов (IL-3, IL-5 и эотаксина), не оказывает влияния на их программированную гибель, что свидетельствует о неадекватности восприятия эозинофилами антиапоптотических сигналов при данной патологии. У пациентов с гельминтозом, обусловленном паразитированием O.felineus, напротив, в эксперименте in vitro продемонстрирована повышенная чувствительность эозинофильных клеток к антиапоптозному действию IL-3, IL-5 и эотаксина. Наряду с этим in vitro в условиях дефицита ростовых факторов показана повышенная чувствительность эозинофилов, полученных у пациентов с большими эозинофилиями крови, к действию проапоптотических факторов. Теоретическая и практическая значимость. Впервые установлены закономерности нарушения кооперации эозинофилов и иммуноцитов в механизмах развития больших эозинофилий крови при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови и описторхозной инвазии. Определена важная роль в этом процессе ключевых цитокинов (IL-3, IL-4, IL-5, GM-CSF и эотаксина), регулирующих гомеостаз эозинофильных гранулоцитов и их рецепторов (IL-3, IL-5, ССR3), нарушений лиганд-рецепторного взаимодействия и цитокинопосредованной регуляции апоптоза эозинофильных гранулоцитов. Продемонстрирован факт выраженного нарушения морфофункционального статуса эозинофильных гранулоцитов при нозологиях, сопряженных с формированием эозинофилии. Положения исследования могут служить основанием для формирования стратегии изучения молекулярных и клеточных механизмов развития синдрома гиперэозинофилии при различных заболеваниях. Полученные фундаментальные знания могут быть положены в основу разработки технологии коррекции дизрегуляции кооперативного взаимодействия эозинофилов и иммунокомпетентных клеток при патологических процессах разного генеза, ассоциированных с формированием эозинофилии крови, с целью проведения патогенетически обоснованной терапии иммунных нарушений и своевременной профилактики осложнений, возникающих при длительной гиперэозинофилии. Положения, выносимые на защиту: 1. При злокачественных заболеваниях системы крови (лимфогранулематоз, множественная миелома и неходжинские лимфомы) и описторхозе (острая и хроническая формы), ассоциированных с гиперэозинофильной реакцией крови, гранулоциты эозинофильного ряда претерпевают однотипные нарушения морфофункциональных свойств, обусловливающих формирование их высокого микробицидного потенциала. 2. Патогенез больших эозинофилий крови, сопровождающих течение лимфопролиферативных заболеваний системы крови и описторхоза, сопряжен с нарушением цитокинопосредованной кооперации эозинофилов и мононуклеарных лейкоцитов. 3. Механизмы нарушения кооперации эозинофилов и мононуклеарных клеток при эозинофилии, сопровождающей течение лимфопролиферативных заболеваний системы крови и описторхозной инвазии, опосредованы повышением продукции мононуклеарными клетками ключевых в регуляции гомеостаза эозинофильных клеток цитокинов (IL-3, IL-5, GM-CSF и эотаксина) и нарушением баланса экспрессии эозинофилами комплементарных им рецепторов (IL-3R, IL-5R и ССR3). 4. Существенный вклад в формирование гиперэозинофильной реакции крови при лимфопролиферативных заболеваниях системы крови и описторхозе вносит нарушение реализации цитокинопосредованной апоптотической гибели эозинофилов. Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на Международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2005), I Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Сочи, 2005), 5-й научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006), VIII Конгрессе «Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении» (Москва, 2006), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Социально-экологические проблемы природопользования в Центральной Сибири" (Красноярск, 2006), XII Межгородской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2006), Российском медицинском форуме-2006 «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006), Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора Н.Н. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006), VIII Всероссийской научно-практическая конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2007), XI-м Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007), XIII-ой межгородской научной конференции молодых ученых “Актуальные проблемы патофизиологии - 2007» (Санкт-Петербург, 2007). В работе приводятся результаты исследований, поддержанных Советом при Президенте РФ для ведущих научных школ РФ по проблеме «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток крови при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153.2006.7), а также результаты научно-исследовательских работ «Роль нарушений межклеточной кооперации в механизмах формирования больших эозинофилий крови» 2005-РИ-19.0/002/010 (Государственный контракт № 02.442.11.7056 от 26.10.2005) и «Молекулярные и клеточные основы управления реактивностью системы крови при актуальных заболеваниях инфекционной природы» 2006-РИ–112.0/001/384 (Государственный контракт № 02.445.11.7419 от 09.06.2006 г.), выполненных в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы». Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 печатные работы, из них 9 статей в ведущих рецензируемых журналах и изданиях, определенных ВАК РФ, одна монография в соавторстве, 13 статей и тезисов в материалах конференций, конгрессов и съездов. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 275 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 24 рисунками и 43 таблицами. Библиографический указатель включает 452 источника (167- отечественных и 285 - иностранных). ^ В основу настоящей работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 246 человек (115 мужчин и 131 женщин в возрасте от 18 до 60 лет, средний возраст – 34±3 лет). 130 больных (59 мужчин и 71 женщина в возрасте от 18 до 60 лет) страдали злокачественными заболеваниями системы крови (из них 97 пациентов с первичным обращением в стационар по поводу лимфопролиферативных заболеваний системы крови и 33 пациента, находящихся на диспансерном учете и ранее получавших от 2 до 6 курсов полихимиотерапии (не менее чем 1-3 года назад)). Все пациенты с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови были обследованы до назначения терапии при поступлении в отделение гематологии Томской областной клинической больницы (главный врач – Заслуженный врач РФ Б.Т. Серых). У 116 человек (56 мужчин и 60 женщин в возрасте от 18 до 60 лет) был верифицирован диагноз описторхоза. Набор этого клинического материала проводился в инфекционном отделении госпитальных клиник ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (главный врач – Заслуженный врач РФ к.м.н. В.М. Шевелев, заведующая отделением – к.м.н., доцент Н.С. Бужак). Включение больных в исследование осуществлялось при непосредственном участии заведующей отделением гематологии В.Ю. Гранкиной, врача-гематолога Е.Н. Кнутаревой, заведующего кафедрой инфекционных болезней ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д.м.н., профессора А.В. Лепехина и врача-ординатора клиники инфекционных болезней ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава к.м.н. Н.П. Чернышовой. В контрольную группу были включены 40 здоровых доноров с аналогичными характеристиками по полу и возрасту (22 мужчины и 18 женщин в возрасте от 18 до 60 лет, средний возраст – 28±4 лет). Клинически и анамнестически у всех обследованных лиц были исключены обострение хронических воспалительных процессов, наследственные и психические болезни, инфекционная патология, а также злоупотребление алкоголем и наркотическая зависимость. Все больные со злокачественными заболеваниями системы крови, ассоциированными с эозинофилией, были разделены на три группы. Первую группу составили 25 пациентов с лимфогранулематозом (по МКБ-10 рубрика С81): из них 9 - со смешанно-клеточным вариантом заболевания (С81.2), 10 - с нодулярным склерозом (С81.1), 6 – с лимфоидным преобладанием (С81.0). Среди больных лимфогранулематозом, согласно классификации, принятой в 1971 г. в Ann Arbor, выделяли пациентов со II Бб стадией процесса (2 человека), III Аб стадией (10 пациентов) и III Бб стадией (13 больных). Верификация диагноза проводилась на основании данных морфологического и иммунофенотипического исследований гистологических препаратов (наличие в опухолевом очаге типичных многоядерных клеток Березовского-Штернберга с фенотипом CD15, CD30). Во вторую группу обследованных были включены 30 пациентов с множественной миеломой (по МКБ-10 рубрика С90.0): их них 28 человек – с диффузно-очаговой формой миеломных инфильтратов, 2 – с диффузной формой миеломных инфильтратов. Диагноз миеломной болезни устанавливался на основании обнаружения плазмоклеточной инфильтрации костного мозга (число плазмоцитов более 10%) и моноклональной Ig-патии (сывороточный М-компонент или белок Бенс-Джонса в моче), подтвержденных методами иммунохимического анализа сывороточных и мочевых иммуноглобулинов с привлечением метода иммунофиксации. Третью группу обследованных составили 38 больных неходжкинскими лимфомами (рубрики С82 и С83 по МКБ-10): 20 человек с лимфомой из периферических (зрелых) клеток (12 – со зрелоклеточной лимфомой, 2 - с пролимфоцитарной, 2 - с лимфоцитарной, 4 - с В-мелкоклеточной), 4 - с В-крупноклеточной, 14 – с фолликулярной. При этом у 16 пациентов с неходжкинскими лимфомами отмечали III Аб стадию процесса, у 22 - III Бб стадию. При диагностике неходжкинских лимфом обязательной являлась гистологическая оценка субстрата опухоли, дополненная иммунологическим и цитогенетическим методами исследования. Группу сравнения составили 37 пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови (из них: 13 больных лимфогранулематозом, 11 – множественной миеломой, 13 – неходжкинскими лимфомами), не сопровождавшимися эозинофилией с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту. Все обследованные пациенты c описторхозом были разделены на две группы. В первую группу были включены 46 лиц, страдающих острым описторхозом (по МКБ-10 рубрика В66), подавляющее большинство которых составили новоселы Томской области (40 человек): из них 29 заразились описторхозом при проживании в эпидемическом очаге до 1 года. Верификация диагноза острого описторхоза основывалась на данных эпидемиологического анамнеза (пребывание больного в местности, не благополучной по описторхозу; употребление необезвреженной рыбы семейства карповых); остром начале болезни, сопровождавшемся высокой температурой, аллергическими явлениями, болями в эпигастральной области и правом подреберье; характерных изменениях периферической крови (эозинофилия (>15%), лейкоцитоз). Обязательным для постановки диагноза острого описторхоза у обследованных пациентов являлось обнаружение IgM-антител к антигенам O.felineus в сыворотке крови c применением иммуноферментного анализа. Согласно классификации описторхоза М.Э. Винникова и соавт. [1969, 1971] и Н.Н. Озерецковской [2000], были выделены следующие клинические группы: 1) пациенты с тифоподобным вариантом течения инфекции – 16 человек; 3) пациенты с гепато-холангитическим вариантом течения – 20 человек; 4) пациенты с гастроэнтерологическим вариантом течения – 10 человек. Анализ клинической картины у пациентов с тифоподобным вариантом течения острого описторхоза показал, что наиболее часто у пациентов выявлялся токсико-аллергический синдром (83%). Больные предъявляли жалобы на общую слабость, головную боль, ознобы, повышенное потоотделение, боли в суставах и мышцах. При осмотре выявлялась легкая субиктеричность, экзантема. Диспепсический синдром (непереносимость жирной пищи, тошнота, горечь во рту, изжога, метеоризм) встречался у 36% пациентов. В большинстве случаев гепато- и спленомегалия, выявленные физикально, подтверждались результатами ультразвукового исследования. В свою очередь у лиц с гепато-холангитическим вариантом течения острого описторхоза преобладали симптомы, обусловленные поражением гепато-биллиарной системы (у 92%): боли в области правого подреберья, желтуха различной степени выраженности, значительное увеличение печени (выступает на 4 см и более из под края реберной дуги). Симптомы Ортнера, Кера, Мюсси – положительные. Астеновегетативный синдром выявлялся у 32% пациентов. Гастроэнтероколитический вариант острой фазы описторхоза характеризовался жалобами на частый жидкий стул (79%), болями в животе (84%), метеоризмом (54%); тошнота и рвота были отмечены у 47%. Вторую группу обследованных составили 50 больных хроническим описторхозом с выраженной клинической картиной (реинвазия, суперинвазия) (по МКБ-10 рубрика В-66). Верификацию диагноза проводили на основании данных клинико-эпидемиологического, инструментального и лабораторного исследований. Анамнестически у всех пациентов данной категории был определен примерный срок инвазии, оценивались жалобы, характер течения заболевания и объективные признаки. Проводился широкий спектр лабораторных исследований, включавший общий и биохимический анализ крови, иммуноферментный анализ, оценку иммунного статуса, дуоденальное зондирование и копроовоскопию. У обследованных пациентов с хроническим описторхозом в 95% случаев заболевание было выявлено впервые, у 5% больных в анамнезе - курс дегельминтизации бильтрицидом. В соответствии с классификацией, предложенной Н.Н. Озерецковской [2000], были выделены следующие клинические группы: 1) больные с гепатохолангитическим вариантом течения хронического описторхоза - 30 пациентов; 2) больные холангиохолециститом – 16 человек; 3) больные гепатопанкреатитом - 4 человека. Анализ клинической картины у больных хроническим описторхозом показал, что наиболее часто выявлялись синдромы гастро-дуоденальной диспепсии (тошнота, чувство давления в эпигастральной области, изжога, отрыжка, снижение или полное отсутствие аппетита) – у 49%, ангиохолецистита – у 68%, панкреатический – у 36%. Кроме того, у 30% больных на коже периодически появлялись высыпания; у 12% возникали приступы удушья по типу бронхиальной астмы; синдром холестаза (желтушное окрашивание кожи и склер, зуд, билирубинемия) обнаруживался у 15 %; артралгический синдром регистрировался у 27% больных. Группу сравнения составили 20 пациентов с хроническим описторхозом без эозинофилии крови с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту. Распределение здоровых доноров и обследованных пациентов по группам в соответствии с использованными методами исследования представлено в таблице. Материалом исследования являлась венозная кровь обследованных лиц, взятая утром до приема пищи (кровь стабилизировали гепарином - 25 Ед/мл). Определение общего количества лейкоцитов периферической крови и подсчет их отдельных морфологических форм проводили стандартными гематологическими методами [Меньшиков В.В., 1987]. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови по CD-маркерам (CD3+, CD4+, CD8+, CD22+) проводили иммуноцитохимическим методом [Тотолян А.Н. и соавт., 2002]. Результаты выражали в процентных и абсолютных значениях. Мононуклеары выделяли в стерильных условиях из цельной венозной крови методом градиентного центрифугирования с использованием Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) (ρ=1,077 г/см3). Выделенные клетки культивировали в течение 18 ч при температуре 37º и 5% СО2 в полной культуральной среде (90% RPMI-1640 («Вектор-Бест», Новосибирск), 10% инактивированная эмбриональная телячья сыворотка («Биолот», Санкт-Петербург), 0,3 мг/мл L-глутамина) без митогена или с добавлением 10 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) («Difco», Германия) для активации лимфоцитов [Хаитов Р.М. и соавт., 1995]. Затем проводили оценку содержания цитокинов (IL-3, IL-4, IL-5 и GM-CSF) в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов и эотаксина в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа согласно инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем («Procon», Россия; «Biosource», Бельгия). Учет результатов иммуноферментного анализа проводили с применением фотометра для микропланшетов «Multiscan EX» («ThermoLabSystems», Финляндия) при длине волны 450 нм. Выделение эозинофильных гранулоцитов проводили с использованием пятиступенчатого градиента Percoll («Amersham Biosciences AB», Швеция) (1,070, 1,081, 1,090, 1,095 и 1,105) [Gartner I., 1980]. Выделенные клетки культивировали в течение 18 ч при температуре 37ºC и 5% СО2 в 96-луночных иммунологических планшетах в полной культуральной среде (90% RPMI-1640, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 0,3 мг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 2мМ/мл HEPES («Flow», GB)). Затем проводили оценку морфофункционального статуса эозинофильных гранулоцитов с использованием цитохимических методов исследования. Содержание неферментных катионных протеинов в эозинофилах периферической крови определяли цитохимическим методом М.Г. Шубича
Распределение здоровых доноров и пациентов с заболеваниями, ассоциированными с эозинофилией периферической крови, в соответствии с использованными методами исследования [Меньшиков В.В., 1987] (рис. 1а). Оценивали активность пероксидазы в эозинофильных гранулоцитах методом Грэхема-Кнолля [Хейхоу Ф.Г.Дж., Кваглино Д., 1983] (рис. 1б). Морфологическое исследование эозинофильных гранулоцитов проводили в условиях их инкубации с антигеном O.felineus по методу Е.С. Нишевой и соавт. [1995]. Фагоцитарную активность эозинофилов периферической крови оценивали методом J.S. Steward et al. в модификации Б.С. Нагоева [Меньшиков В.В., 1987] (рис. 1в). Исследование морфометрических характеристик эозинофильных гранулоцитов осуществляли с помощью метода компьютерной морфометрии [Автандилов Г.Г., 1990; Ильинских Н.Н. и соавт., 2005] с использованием программы «ImageJ» (проект, реализованный национальным институтом здоровья США) (Автор - Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA) (рис. 2). a    )  б)  в)  Рис. 1. Содержание внутриклеточных эозинофильных катионных протеинов (а) и пероксидазы (б) в эозинофилах периферической крови. Диформазан-позитивные эозинофилы (в) В рамках диссертационной работы проводили оценку состояния рецепторного аппарата эозинофилов, полученных у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, сопровождающихся синдромом эозинофилии, а также у здоровых доноров, in vitro без стимуляции и в условиях инкубации эозинофильных клеток с рекомбинантными формами цитокинов. Для этого выделенные эозинофилы периферической крови культивировали в отсутствии стимуляции или с добавлением рекомбинантного (r) IL-3 («Biosource», Бельгия), r-IL-5 («Biosource», Бельгия) или r-эотаксина («Biosource», Бельгия) в концентрации 10-8 г/мл. Клетки инкубировали в течение 18 ч при температуре 37º и 5% СО2. Оценку презентации мембраносвязанных форм рецепторов к IL-3, IL-5 и эотаксину на эозинофилах крови проводили методом проточной лазерной двухцветной цитометрии с использованием моноклональных антител к цитокиновым рецепторам, меченных флуоресцентными метками. Регистрацию презентации цитокиновых рецепторов на эозинофилах проводили согласно протоколу фирмы производителя («R&D Systems», США). Анализ образцов клеточных суспензий проводили на проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», Франция) с применением автоматического программного обеспечения и методов сбора и анализа данных с высоким разрешением (1024 канала) (рис. 3). Регистрация апоптоза была основана на определении экспрессии на поверхности клеток фосфатидилсерина. Для его обнаружения использовался FITC-меченный аннексин V, который обладает сродством к фосфатидилсерину [Van England et al., 1998]. Выделенные в стерильных условиях эозинофилы периферической крови культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах в объеме 200 мкл. В лунки вносили суспензию клеток (2*105 на лунку), а также полную культуральную среду, состоящую из 90% RPMI-1640 («Вектор-Бест», Новосибирск), 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», Санкт-Петербург), инактивированной при 560С в течение 30 мин, 0,3 мг/мл L-глутамина. Клетки инкубировали в течение 18 ч при температуре 37ºС и 5% СО2. После отмывания клетки суспензировали (1*106 в 1 мл) в аннексиновом буфере, содержащем аннексин V, меченный FITC, и через 15 мин подвергали проточной цитофлуориметрии как описано выше. В гейте эозинофильных клеток анализировали наличие зеленой флуоресценции FITC на одномерной гистограмме (рис. 3). а) б) в) г) д)          Рис. 2. Данные компьютерной морфометрии: a) выбор объекта для морфометрического исследования, б) выделение площади эозинофильной клетки, в) выделение ядра эозинофила, г) выделение гетерохроматиновых областей ядра эозинофила, д) выделение эухроматиновых участков ядра эозинофила с использованием метода кластерного анализа. Окраска азур II-эозином, увеличение 900  Рис. 3. Гистограмма распределения эозинофилов по интенсивности флуоресценции в FL1-канале. Оценка содержания IL-5R+-клеток, меченных FITC, в гейте эозинофильных гранулоцитов а – принцип автоматического выделения гейта эозинофилов по показателям малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеивания; б – одномерная гистограмма интенсивности флуоресценции в гейте эозинофильных клеток по FL1-каналу (слева от оси – несветящиеся клетки, справа FITC-позитивные эозинофилы). В рамках диссертационной работы проводили оценку реализации апоптоза эозинофилов периферической крови у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями системы крови и у лиц, страдающих описторхозом, сопровождавшимися эозинофилией крови, а также у здоровых доноров in vitro в условиях инкубации эозинофильных клеток в среде, лишенной ростовых факторов и с рекомбинантными формами эозинофилспецифичных цитокинов (IL-3, IL-5 и эотаксин). Для этого в лунки планшета вносили суспензию выделенных эозинофилов крови (2*105 на лунку), а также чистую среду RPMI-1640 без эмбриональной телячьей сыворотки, т.е. в отсутствии ростовых факторов, или полную культуральную среду с добавлением рекомбинантных (r) IL-3 (r-IL-3) («Biosource», Бельгия), r-IL-5 («Biosource», Бельгия) и r-eotaxin («Biosource», Бельгия) в концентрации 10-8 г/мл. Клетки инкубировали в течение 18 ч при температуре 37 ºС и 5% СО2. Затем с помощью FITC-меченного аннексина V методом проточной лазерной цитометрии регистрировали апоптоз как указано выше (рис. 3). Оценку полученных результатов проводили методами статистического описания и проверки статистических гипотез. При анализе имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (критерий Шапиро-Вилка). Для нормально распределенных выборок вычисляли средневыборочные характеристики: среднее арифметическое (Х), среднее квадратичное отклонение (σ), ошибка среднего (m). Для выборок, распределение которых отличалось от нормального, рассчитывали медиану (Ме), первый и третий квартили (Q1, Q3). При соответствии нормальному закону распределения признака в исследованных выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали критерий Kruskal-Wallis. С целью попарного сравнения показателей в исследованных группах применяли критерий Манна Уитни для независимых групп. Различие двух сравниваемых величин считали достоверным при уровне значимости р<0,05. С целью обнаружения связи между исследованными показателями проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r). Методом множественной регрессии был рассчитан коэффициент β, определяющий степень зависимости между исследованными показателями [Гланц С., 1999; Боровиков В.П., 2001]. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям