Иммунофизиологические механизмы поддержания гомеостаза организма в условиях воздействия стрессорных факторов среды обитания 03. 00. 13 Физиология
|
|
Скачать 0.79 Mb.
|
^
^ гадюки обыкновенной – Vipera berus L., сем. Viperidae; гюрзы среднеазиатской – Vipera lebetina L., сем. Viperidae; эфы песчаной – Echis carinatus Schneid., сем. Viperidae; гадюки Никольского – Vipera nikolskii Vedmederja, Grubant et Rudaeva сем. Viperidae; кобры среднеазиатской – Naja oxiana Eichw., сем. Elapidae, полученные из Института экологии Волжского бассейна РАН и НПФ «Биоком» (г.Тольятти). Яды амфибий (Amphibia): зеленой жабы – Bufo viridis Laur., сем. Bufonidae; яды паукообразных(Arachnida): кавказского скорпиона – Buthus caucasicus Nordm., сем. Buthidae; яды насекомых (Insecta): пчелы медоносной – Apis mellifera L., сем. Apidae; колорадского жука – Leptinotarsa decemlineata Say., сем.Chrysomelidae, полученные в экспедициях сотрудниками кафедры физиологии и биохимии человека и животных ННГУ. Образцы ядов готовились непосредственно перед опытом и вводились в дозах кратных ЛД50. ЛД50 определяли для каждого образца яда на лабораторных животных методом пробит-анализа по Литчфилду и Уилкоксону (Беленький, 1963). ^ Для получения иммунных сывороток белым лабораторным мышам (20 особей, массой 18-20 г, содержащихся на обычном рационе вивария), трехкратно подкожно вводили стерильный раствор яда гюрзы среднеазиатской (3,0 мкг/мышь) в течение 3 месяцев с интервалом в 3 недели. Иммунизацию мышей гемолимфой колорадского жука проводили двумя способами: однократно, внутрибрюшинно в дозах 0,5-5,5 мг/кг с забором крови (методом декапитации) на 7, 15 и 24 сутки первичного иммунного ответа и трехкратно, подкожно, по 3 мкг/мышь с интервалом в три недели. После окончания иммунизации, в полученных сыворотках, выявляли специфические антитела одним из вариантов твердофазного иммуноферментного анализа (ПАП-методом) (Новиков, Андреев, 1987). Сорбцию антигенов яда гюрзы (в концентрации 1,0 мг/мл, по 150 мкл в натрий фосфатном буфере, рН 7,3 0,1) проводили в лунках полистероловой планшеты с последующей инкубацией при +40С в течение 24 ч. Для постановки сандвич-варианта иммуноферментного анализа (Коллинз, 1991) использовали коммерческий препарат моновалентной противозмеиной сыворотки «Антигюрза» (Ташкентский НИИ вакцин и сывороток), кроличьи антитела к иммуноглобулинам лошади и антикроличий конъюгат с пероксидазой хрена. Липосомы. Из очищенного фосфатидилхолина (10% лецитин-стандарт) получали липосомы, в которые включали нативный яд Vipera lebetina (0,04 ЛД50) двумя способами: методом обращения фаз (Szoka, Papahadjopoulos, 1978); либо диспергированием (Bangham, Standish, Watkins,1965). Формирование липосом и процент включения яда оценивали флуоресцентным методом, используя в качестве метки флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ, «Serva») и кальцеин («Serva»). Полноту удаления несвязанного ФИТЦ-меченного яда контролировали центрифугированием в градиенте плотности фиколла (ультрацентрифуга “Beckman”35 тыс.об./мин, 170С, 1 ч). Из каждой пробирки отбирали по 10-11 фракций и определяли интенсивность флуоресценции до и после добавления детергента (Тритон Х-100) и, соответственно, процент связывания яда с фосфолипидными липосомами. ^ Аллерген приготовлен из нативного яда пчел медоносных – Apis mellifera L., стабилизированного сывороточным человеческим альбумином (0,03 мкг/мл) и лиофилизированного. В работе использовали четыре лабораторно-экспериментальные серии аллергена (1000 мкг белка яда). Сухой препарат растворяли в 1 мл разводящей альбуминовой жидкости, содержащей 0,3 % раствора альбумина человека в жидкости Эванса-Кока. Безвредность и острую токсичность проверяли на мышах (50 особей), массой 16-18 г. Хроническую токсичность, специфические иммуногенные свойства – на морских свинках, массой 200-250 г, содержащихся на обычном рационе вивария. ^ Экспериментальная модель in vivo первичного иммунного ответа. Экспериментальной моделью первичного иммунного ответа на тимусзависимый антиген являлась иммунизация мышей линии СВА и (СВА х С57Bl) F1 – гибридов 10% взвесью эритроцитов барана (ЭБ). На 5, 7 и 10 сутки иммунного ответа, в селезенке мышей определяли число антителообразующих клеток (АОК) методом локального гемолиза (Jerne, Nordin, 1963; Cunnigham, 1965). Антитела в сыворотке крови иммунизированных животных. Титр антител (до 30 суток иммунного ответа) в сыворотке крови мышей определяли реакцией гемагглютинации (Кэбот, Мейер, 1968). Результаты выражали через log2Т, где Т - наибольшее разведение сыворотки, дающее положительную реакцию (++). ^ Экспериментальная модель гиперчувствительности замедленного типа. Для индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) in vivo применяли метод Tamura et al. (1983) с дополнениями (Подоплелов, Крылов, Медуницын, 1985). При воспроизведении реакции использовали разные антигены: тимусзависимый – эритроциты барана (Collins, Morrison, 1976) или растворимые белковые – яичный альбумин (ЯА), метилированный бычий сывороточный альбумин (МБСА, “Serva”, Германия) (Земсков и др., 1988). Для индукции реакции ГЗТ к белковому антигену применяли метод сенсибилизации животных МБСА (250 мкг/0,1 мл) с использованием в качестве адъюванта красителя синего Эванса (ЭС, “Serva”, Германия), для оценки супрессорного действия или без применения адъюванта – для оценки стимулирующего действия. Местную реакцию на введение разрешающей инъекции антигена (25 мкг) оценивали через 24ч по разнице массы опытной и контрольной конечностей каждой мыши. В опыты были включены группы мышей, которым делали только разрешающую инъекцию антигена (отрицательный контроль) и животные, получавшие как сенсибилизирующую, так и разрешающую инъекцию антигена (положительный контроль). ^ характеристик аллергена проводили методом пассивной кожной анафилаксии (ПКА) (Ovary, Benacerraf, Block, 1963). Для сенсибилизации использовали аллерген из яда пчел (по 0,1 мл в подушечки четырех лап). Сыворотку крови получали на 28-30 день внутрисердечным забором. Разведения сыворотки (1:2 – 1:1024) вводили интактным морским свинкам-альбиносам. Через 24 ч животные получали разрешающую инъекцию в объеме 0,2 мл на 100 г массы тела. Затем животных забивали и проводили учет реакции по внутренней стороне снятой шкурки. Анафилактогенные свойства. Животным, на 30-40 день после сенсибилизации аллергеном из яда пчел, вводили разрешающую дозу пчелиного яда. Анафилактический индекс определяли по Вейглу (Weigle et al., 1960). ^ Фагоцитирующую активность клеток крови изучали с помощью люминолзависимой хемилюминесценции (Добротина и др., 1991). Измерения проводили на биохемилюминометре БХЛ-06, производства НИЦ «Биоавтоматика» г. Нижний Новгород. В качестве наблюдаемых параметров использовали интенсивность и светосумму хемилюминесценции сигнала (в мВ). Перекисное окисление липидов (ПОЛ). Оценку интенсивности процесса ПОЛ эритроцитов донорской крови проводили с помощью системы сульфат железо-перекись водорода (Владимиров, Арчаков, 1982). Змеиные яды использовали в концентрациях 50 и 100 мкг/мл; пчелиный яд в концентрации 1,0 и 2,5 мкг/мл. ^ Стабильность развития. В качестве объекта был использованы фоновые виды зеленых лягушек рода Rana. Стабильность развития оценивали по интегральному показателю флуктуирующей асимметрии (Захаров, 1978; Захаров, Чубинишвили, 2001). Определение пола и возраста лягушек проводили по стандартной методике (Шляхтин, Голикова, 1986). При учете асимметрии меристических признаков (bij) в альтернативной форме, когда при наличии асимметричного признака bij = 1, и когда признак симметричен bij=0 (Захаров и др., 2000), долю асимметричных признаков вычисляли по формуле (Гелашвили и др., 2001):  , где n- количество признаков, j=1,..n, m- количество особей в выборке, i=1,..m., bij – асимметричные меристические признаки. Степень отклонения качества среды от нормы определяли по нарушению стабильности развития (по величине ФА) земноводных и оценивали по пятибалльной шкале (Методические рекомендации.., 2003).Лейкограмма периферической крови. Определение содержания в крови лейкоцитов и количественную оценку основных популяций ядросодержащих клеток периферической крови амфибий проводили общепринятым способом (Меньшиков и др., 1987). Иммунограмма периферической крови и лимфоидных органов (тимуса и селезенки). Для определения содержания Т-лимфоцитов (Т-РОЛ%) использовали метод розеткообразования с эритроцитами курицы. В-лимфоциты (В-РОЛ%) определяли в тесте розеткообразования с эритроцитами барана, нагруженными антителами к иммуноглобулинам лягушки (Исаева, Вязов, 1996). Определение содержания нулевых клеток проводили по формуле: нулевые клетки, % = 100% – (В-РОЛ% + Т-РОЛ%). Фагоцитарная активность. Фагоцитарную активность лейкоцитов оценивали по способности поглощать клетки пекарских дрожжей (Иммунологические..,1988). ^ Полученные экспериментальные данные обрабатывали с использованием параметрических (критерий Стьюдента, в том числе с поправкой Бонферрони, дисперсионный однофакторный анализ, критерий Ньюмена-Кейлса) и непараметрических (коэффициент ранговой корреляции Спирмана, критерий Крускала-Уоллеса, критерий Манна-Уитни, критерий Фридмана) методов математической статистики. За величину уровня статистической значимости принимали р=0,05. ^ Для интегральной характеристики качества окружающей среды применяли обобщенную функцию желательности (Адлер и др., 1976; Максимов, 1980; Kaitala, Maximov,1986; Носов, Булгаков, Максимов, 1997; Гелашвили, Чупрунов, Иудин, 2004). ^ Согласно токсинологической классификации, ядовитые животные могут быть разделены на две большие группы: первично-ядовитые и вторично-ядовитые (Павловский, 1950; Орлов, Гелашвили, 1985). К первично-ядовитым животным относятся организмы, вырабатывающие ядовитый секрет в специальных железах или имеющие ядовитые продукты метаболизма в тканях и органах. Ядовитость этих животных является видовым признаком и встречается у всех особей данного вида. Вторично-ядовитые – аккумулируют экзогенные яды в своем теле и проявляют токсичность только при попадании внутрь другого организма. Первично-ядовитые по способам выработки яда и его применения делятся на активно- и пассивно-ядовитых. Активно-ядовитые животные, имеющие специализированный ядовитый аппарат, снабженный ранящим устройством, позволяющим им вводить яд в тело жертвы минуя пищеварительный тракт, называются вооруженными. Другая группа активно-ядовитых животных, ядовитые аппараты которых лишены ранящего приспособления, относятся к невооруженным. Яды этих животных выполняют в основном, защитные функции, т.е. являются отпугивающими веществами. У пассивно-ядовитых животных ядовитые метаболиты вырабатываются в организме, накапливаются в различных органах и тканях и эффективны при попадании с пищей. Первой стадией исследования иммунотропных свойств физиологически активных веществ является оценка их иммуногенной активности. В данной серии экспериментов исследовали белковые яды змей: гадюки обыкновенной – Vipera berus L. и гюрзы среднеазиатской – Vipera lebetina L., класс Reptilia, сем.Viperidae, а также, гемолимфу колорадского жука – Leptinotarsa decemlineata Say., класс Insecta, сем. Chrysomelidae.  Рис.1. Уровень накопления антител, специфичных к гемолимфе колорадского жука, в сыворотке крови животных при однократной (1) и трехкратной (2) иммунизации. ^ – величина светопропускания (длина волны = 492нм). Использование иммуноферментного анализа (ПАП-метод) (Новиков, Андреев, 1987), позволило выявить иммуногенные свойства практически не изученного в иммунологическом аспекте белкового зоотоксина – гемолимфы колорадского жука. Действие гемолимфы было дозозависимым: титр антител в сыворотке крови иммунизированных животных после трехкратной иммунизации, превышал аналогичный показатель после однократной иммунизации (рис. 1). При оценке активности сывороток животных, иммунизированных ядом гюрзы среднеазиатской, также были выявлены специфичные к яду антитела. Данная система позволяла оценить иммуногенную активность близких по химическому составу змеиных ядов сем.Viperidae (рис.2). Титры антител в сыворотках крови экспериментальных животных при иммунизации ядами змей, относящихся к одному семейству, статистически значимо различались между собой, что показывает возможность применения ПАП - метода для оценки видовой принадлежности змеиных ядов.  Рис. 2. Оценка иммуногенной активности змеиных ядов методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого препарата моновалентной сыворотки «Антигюрза». ^ - значение оптической плотности растворов (отн. единицы) при λ = 492 нм. Другим методическим приемом, вносящим ясность в идентификацию животных ядов, является использование гемокоагуляционных тестов (Руководство по…, 1980; Баркаган, 1977, 1985). Воспроизведение классической методики при работе с ядами змей сем. Viperidae не позволяет различить зоотоксины, т.к. границы доверительных интервалов значений индексов коагулянтности ядов перекрываются. Так, значение индекса коагулянтности для яда гюрзы среднеазиатской составляет – (62,74 80,89), а для гадюки обыкновенной – (60,91 74,25). Таблица 2 |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям