Иммунофизиологические механизмы поддержания гомеостаза организма в условиях воздействия стрессорных факторов среды обитания 03. 00. 13 Физиология
|
|
Скачать 0.79 Mb.
|
|
Решить задачу можно, если, во-первых, определять абсолютное время свертывания стандартизированного образца цитратной плазмы и, во-вторых, использовать в качестве субстрата последовательно два образца плазмы: богатой и бедной тромбоцитами. В первом случае установлено, что абсолютное время свертывания под действием яда гадюки почти в 2 раза превышает время свертывания цитратной плазмы под действием яда гюрзы (табл. 2). Исходя из известной зависимости гемокоагуляционной активности яда змей от наличия в плазме тромбоцитарных факторов и фосфолипидных мембранных матриц (кефалина) (Баркаган и др., 1988; Баркаган и др., 1995), дальнейшее определение строится на вычислении отношения времени свертывания плазмы, бедной тромбоцитами к времени свертыванию плазмы, богатой тромбоцитарными факторами под действием каждого яда. Для яда гадюки это отношение 1,5 (1,141,86) было статистически значимо выше, чем для яда гюрзы 1,08 (0,79 1,38), р=0,037. Полученные данные позволяют успешно применять модифицированный метод коагулазной активности в целях идентификации и дифференцировки зоотоксинов. * * * Таким образом, впервые выявлена иммуногенная активность гемолимфы колорадского жука и создана методическая база для определения близких по химическому составу змеиных ядов, являющихся основой для разработки новых лекарственных средств с широким спектром физиологической активности. Выявление закономерностей функционирования иммунной системы организма-реципиента под действием ядов животных, относящихся к разным токсинологическим группам, предполагает необходимость изучения особенностей проявления гуморальных и клеточных форм иммунного реагирования. Решению этой задачи посвящены следующие главы работы. Глава 4. ГУМОРАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПОДДЕРЖАНИЯ ГОМЕОСТАЗА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ЗООТОКСИНОВ ^ Эволюционно возникшая и развившаяся иммунная форма защиты организма представлена многообразием клеточных и молекулярных участников, среди которых выделяют две взаимосвязанные формы иммунного реагирования: В – (гуморальная) и Т – (клеточная). Ни одна из систем не работает автономно, комплексно они создают мощный заслон от любого чужеродного в антигенном отношении материала, с которым может столкнуться организм в течение онтогенеза. Настоящая глава посвящена оценке характера действия зоотоксинов на специфические гуморальные реакции. Модельной экспериментальной системой in vivo гуморального ответа являлся метод локального гемолиза (Jerne, Nordin, 1963; Cunnigham, 1965). Данная модель позволяет изучить зависимость влияния зоотоксинов на динамику первичного иммунного ответа от дозы и времени введения. ^ Яд пчелы медоносной (Apis mellifera L.). Установлено, что нативный пчелиный яд в зависимости от дозы вызывал разнонаправленные изменения в реакциях гуморального иммунитета. В малых дозах (0,02 ЛД50) пчелиный яд обладал стимулирующим действием на иммуногенез. В широком диапазоне более высоких концентраций (ЛД10 – ЛД50) яд пчел угнетал процесс накопления антителообразующих клеток (АОК) в селезенке (рис.3) и выработку антиэритроцитарных антител в сыворотке крови мышей. Действие яда было сильнее выражено при его инъекции до введения эритроцитов барана (ЭБ).  Рис.3. Влияние пчелиного яда на процесс накопления АОК в селезенке мышей на 5 сутки первичного иммунного ответа при совместном введении с антигеном. По оси ординат – число АОК в % к контролю, принятого за 100%. Кроме нативного яда, в реакциях гуморального иммунитета были исследованы иммунотропные свойства очищенного аллергена из пчелиного яда. У всех сенсибилизированных свинок при внутривенном введении разрешающей дозы аллергена из яда пчел развивался анафилактический шок различной степени выраженности (от 1,5 до 3,0 баллов). Установлено, что анафилактогенная активность аллергена (2,38±0,41) не уступала аналогичным свойствам нативного яда пчел (2,33±0,42, р=0,870). Проявление анафилактической реакции было строго специфичным. Высокие иммуногенные свойства аллергена из яда пчел проявлялись и в реакции пассивной кожной анафилаксии. Титр специфических кожно-сенсибилизирующих антител в сыворотках крови морских свинок, сенсибилизированных аллергеном из яда пчел (200 мкг белка яда), составлял 1:512 – 1:1024. Наличие анафилактогенных и иммуногенных свойств соответствует требованиям, предъявляемым к аллергенным препаратам, которые могут быть использованы при диагностике и лечении аллергических заболеваний, вызванных ужалениями пчел. Яд скорпиона кавказского (Buthus caucasicus Nordm.). При изучении действия яда скорпиона на реакции гуморального иммунитета было установлено, что он обладал модулирующим действием на формирование первичного иммунного ответа к Т-зависимому антигену. Для яда скорпиона была характерна дозовая зависимость. Наименьшая из исследованных доз яда (0,04ЛД50) не вызывала изменений количества АОК и количества выработки антиэритроцитарных антител в сыворотке крови. Увеличение дозы яда в интервале значений (0,09ЛД50 – 0,4ЛД50), приводило к стимуляции иммуногенеза, что находило отражение в увеличении числа АОК селезенки. Наибольшая из исследованных доз яда (0,6 ЛД50) проявляла супрессорное действие (рис.4). Выявлено, что яд скорпиона не влиял на иммунокомпетентные клетки, находящиеся в фазе G0 клеточного цикла, а активно действовал на процессы, развивающиеся вслед за антигенным стимулом, и пролиферативную стадию иммунного ответа. Таким образом, установлено дозозависимое действие яда скорпиона на первичный иммунный ответ.  Рис.4. Влияние яда скорпиона кавказского на процесс накопления АОК в селезенке мышей на 5 сутки первичного иммунного ответа при одновременном введении с антигеном (ЭБ). По оси ординат – число АОК в % к контролю, принятого за 100%. Яд среднеазиатской гюрзы (Vipera lebetina L.). Наименьшая из исследованных доз яда (0,01ЛД50) не вызывала изменений в реакциях гуморального иммунитета. Увеличение дозы вводимого яда (0,1ЛД50) приводило к подавлению синтеза антителообразующих клеток (АОК)(рис.5). Более чувствительны к действию яда незрелые лимфоидные клетки. Яд гюрзы не вызывал изменения в выработке антиэритроцитарных антител в сыворотки крови мышей в динамике первичного иммунного ответа.  Рис.5. Влияние яда гюрзы среднеазиатской на процесс накопления АОК в селезенке мышей на 5 сутки первичного иммунного ответа при совместном введении с антигеном. По оси ординат – число АОК в % к контролю, принятого за 100%. Для снижения токсичности яда гюрзы и возможности дальнейшего изучения иммуногенных свойств зоотоксина мы получили его липосомальную форму. Использование липосом, как носителя яда, обеспечивает более высокий иммунный ответ на включенный или распределенный на их поверхности антиген (Липосомы.., 1983; Марголис,1986; Baneryi, Alving,1990) и снижает токсичность змеиных ядов (New et al., 1985; Freitas et al.,1989; Radvanyi et al., 1989). Установлено, что более эффективно захватывали яд липосомы, изготовленные методом обращения фаз (70,0±3,0 % нативного яда). Для контроля распределения яда липосомы нагружали кальцеином в концентрации самотушения (40 мкмоль) и исследовали возбуждение флуоресценции в присутствии или отсутствии детергента. Показана преимущественная локализации антигенов яда во внутреннем пространстве замкнутых фосфолипидных липосом. Рассчитанная методом пробит–анализа по Литчфилду и Уилкоксону (Беленький, 1963) средняя смертельная доза (ЛД50) нативного яда составила 2,22 (1,07 ÷ 3,37) мг/кг, а липосомальной формы – 6,9 мг/кг, что свидетельствовало о снижении более чем в три раза токсичности нативного яда при его включении в липосомы. Включение яда в токсической дозе (1,0 ЛД50) в липосомы не вызывало летальности мышей, при этом титры специфических антител в сыворотках крови этих животных уже на 7 сутки иммунного ответа (8,38±0,38, р<0,001) были гораздо выше по сравнению с титрами антисывороток животных, иммунизированных свободным ядом (4,11±0,10), либо липосомами, содержащими яд в дозе 0,04 ЛД50 (4,21±0,13) (рис.6).  Рис.6. Уровень накопления антител, специфичных к яду гюрзы среднеазиатской (Vipera lebetina), на седьмые сутки после иммунизации животных свободным ядом (0,04 ЛД50) и ядом, включенным в липосомы. По оси ординат – величина оптической плотности растворов (отн.единицы) при длине волны 492 нм. Таким образом, установлено снижение первичного иммунного ответа в условиях введения яда гюрзы (Vipera lebetina L.). Уменьшение антителообразования более выражено в индуктивный период антителогенеза. Внутрибрюшинное введение токсической дозы яда, инкапсулированной в липосомы не вызывало гибели животных. Липосомальная форма яда вызывала стимуляцию выработки специфических антител, что свидетельствовало о перспективах ее применения для производства антисывороток и защитной иммунизации против яда среднеазиатской гюрзы. ^ Однократное внутрибрюшинное введение яда в дозе 0,01ЛД50 в различные сроки по отношению к началу иммунизации, вызывало ярко выраженный стимулирующий эффект. Более высокий уровень иммунокомпетентных клеток отмечен нами при инъекции яда до антигена. Яд жабы в дозах 0,08ЛД50 – 0,25ЛД50 оказывал подавляющее действие на число АОК. Заметим, что степень снижения уровня АОК определялась не столько концентрацией введенного токсина, сколько зависела от срока его введения (рис.7). Таким образом, на модели первичного иммунного ответа для яда жабы зеленой установлена зависимость «доза–эффект» и «время–эффект».  Рис. 7. Влияние яда жабы зеленой на процесс накопления АОК в селезенке мышей на 5 сутки первичного иммунного ответа. По оси ординат – число АОК в % к контролю, принятого за 100%. ^ Гемолимфа колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata Say.). Иммунотропные эффекты гемолимфы колорадского жука обуславливались как величиной введенной дозы, так и временем исследования. Совместное введение гемолимфы (в дозах 0,07ЛД50–0,4ЛД50) с тимусзависимым антигеном приводило к более интенсивной ответной иммунной реакции, чем при введении только эритроцитов барана. Пик стимуляции соответствовал дозе 0,07ЛД50, которая вызывала почти трехкратное увеличение количества АОК по сравнению с контролем (рис.8). Дальнейшее увеличение дозы гемолимфы вызывало угнетение процессов антителообразования. Наиболее значительная супрессия наблюдалась при введении гемолимфы до иммунизации. Оценка титров антиэритроцитарных антител в сыворотке крови мышей подтвердила выявленные эффекты гемолимфы. Таким образом, установлено дозозависимое действие гемолимфы колорадского жука в отношении гуморальной формы иммунного реагирования, выражающиеся в стимуляции при введении малых доз и угнетении в больших дозах.  Рис. 8. Влияние гемолимфы колорадского жука на процесс накопления антителообразующих клеток в селезенке мышей на 4-5 сутки первичного иммунного ответа при совместном введении с антигеном. По оси ординат – число АОК на 106 клеток селезенки. * * * Несмотря на определенную специфичность действия зоотоксинов на формирование гуморального иммунного ответа, отчетливо выявлены общие закономерности, обусловленные токсинологическим статусом организма-продуцента. Низкие дозы активно- и пассивно-ядовитых животных (гюрза среднеазиатская, пчела медоносная, скорпион кавказский, жаба зеленая, колорадский жук) стимулируют, высокие, напротив, угнетают формирование гуморальных иммунных реакций. Яды активно-ядовитых животных, меняя амплитуду иммунного ответа, не извращают его динамику. Стимуляция гуморальных реакций ядом пассивно-ядовитых животных (колорадский жук) обеспечивается, по-видимому, включением в процесс антителообразования большего числа клеток-предшественников, что вызывает смещение пика максимума выработки антиэритроцитарных антител к более поздним срокам и меняет динамику иммунного ответа (рис.9).  Рис.9. Динамика выработки антиэритроцитарных антител в сыворотке мышей при введении зоотоксинов разных токсинологических групп По оси абсцисс – сутки первичного иммунного ответа. По оси ординат – величина титров антител (log2 АТ). Глава 5. КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПОДДЕРЖАНИЯ ГОМЕОСТАЗА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ЗООТОКСИНОВ (^ Результаты, полученные на модели гуморального иммунного ответа, позволяли полагать, что механизм иммунотропной активности зоотоксинов обуславливался и изменением функциональной активности Т-клеток. Поэтому на следующем этапе, был изучен характер действия зоотоксинов на экспериментальной модели одной из форм клеточного иммунного ответа: реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) (Подоплелов, Крылов, Медуницын, 1985). Данная методика является классическим способом воспроизведения реакции (Tamura et al., 1983), не предполагает гистологического подтверждения и позволяет оценить адъювантные и супрессорные свойства антигенов. ^ Яд пчелы медоносной (Apis mellifera L). Установлено, что пчелиный яд не препятствовал процессу формирования клеточных иммунных реакций в модели ГЗТ. Наименьшая из исследованных доз (0,01ЛД50) стимулировала формирование реакции. Стимулирующие свойства яда проявлялись как при воспроизведении реакции ГЗТ с адъювантом (оценка супрессорных свойств), так и без него (оценка стимулирующих свойств). Эффекты суммации адъювантных свойств яда и красителя отсутствовали. Выраженность реакции ГЗТ при использовании пчелиного яда в дозе (0,1ЛД50) была незначительной. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии стимулирующих эффектов при использовании пчелиного яда в большой дозе. Змеиные яды. Для анализа были взяты ядовитые секреты змей сем. Viperidae: гадюки обыкновенной – (Vipera berus L.), гюрзы среднеазиатской – (Vipera lebetina L.), эфы песчаной – (Echis carinatus Schneid.), гадюки Никольского – (Vipera nikolskii Vedmederja, Grubant et Rudaeva); а также липосомальная форма яда гюрзы среднеазиатской. Яд гюрзы (0,1ЛД50) оказывал супрессорное действие на воспроизведение реакции ГЗТ к обоим антигенам. Так, при сенсибилизации животных ЭБ индекс реакции (ИР) составлял 3,57±0,90% (р=0,119), т.е. статистически значимо не отличался от показателя у интактных животных (5,88±1,06%). Аналогичные результаты получены при моделировании реакции ГЗТ к МБСА. В этих опытах ИР составлял 5,03±0,90%, р<0,001 (18,15% от значения «положительного» контроля) и не отличался от «отрицательного» контроля (р=0,833), что свидетельствовало о полном подавлении реакции ГЗТ. Снижение дозы яда (0,01ЛД50) приводило к формированию клеточных иммунных реакций. Эта доза яда обладала четким адъювантным эффектом в обеих моделях реакции ГЗТ к МБСА и ЭБ и стимулирующей активностью в отношении специализированных популяций Т-клеток, участвующих в формировании клеточного звена иммуногенеза. Адъювантные свойства яда гюрзы были сравнимы с действием красителя, эффекты суммации отсутствовали. Яды гадюки обыкновенной (0,25ЛД50) и гадюки Никольского (0,1ЛД50) полностью блокировали развитие клеточных реакций. Яд эфы песчаной (0,04ЛД50) оказывал адъювантное действие в отношении реакции, вызванной МБСА с ЭС. Эффекты суммации адъювантных свойств яда и ЭС отсутствовали. Яд гюрзы среднеазиатской (0,04ЛД50) в форме липосомального препарата значительно стимулировал формирование клеточных иммунных реакций, что, по-видимому, было обусловлено синергизмом действия компонентов липосомальной формы яда и активацией Т-клеток и макрофагов, принимающих участие в иммунном ответе на антигенный стимул. Таким образом, змеиные яды в реакциях клеточного иммунитета давали дозозависимый иммунотропный эффект. Большие дозы подавляли, а малые оказывали адъювантное действие и не препятствовали формированию полноценной реакции ГЗТ. Наблюдаемые эффекты следует рассматривать как результат совместного действия мембранно-активных компонентов яда (Орлов, Гелашвили, 1985) на эффекторные и регуляторные клетки, обеспечивающие реализацию клеточных иммунных реакций. * * * Установлено, что исследованные яды активно-ядовитых животных вызывали изменения антиген-специфических реакций замедленного типа, осуществляемых иммунными Т-клетками. Специфичность действия определялась величиной вводимой дозы (рис.10). При этом пчелиный яд в отличие от яда гюрзы в сопоставимых дозах (0,1 ЛД50) не оказывал подавляющего действия в модельной реакции ГЗТ для оценки супрессорных свойств.  Рис.10. Действие зоотоксинов вооруженных активно-ядовитых животных на воспроизведение реакции ГЗТ, сенсибилизация мышей МБСА без СЭ (оценка супрессорного действия). По оси ординат – Индекс реакции, в %. ^ На модели реакции клеточного иммунитета оценивали иммунотропные свойства очищенного препарата секрета кожных желез жаб (Крылов и др., 1980), любезно предоставленного заведующим кафедрой физиологии и биохимии человека и животных ННГУ им. Н.И.Лобачевского профессором В.Н.Крыловым. Очищенный препарат яда жаб обладал способностью вызывать снижение формирования реакции ГЗТ. Степень подавления реакции зависела от дозы и срока введения препарата по отношению к антигенному воздействию. Статистически значимые различия в величине отека отмечены при введении препарата в дозе 0,05ЛД50, через 48 ч после сенсибилизации (38,40±3,13%, р<0,001) и в дозе 0,3ЛД50, через 24 ч после сенсибилизации (47,30±7,14%, р=0,02). Степень подавления реакции в этих группах была максимальной, и ИР практически не отличался от значения отрицательного контроля (39,66± 2,68%). Изменение интервала между введением антигена и очищенным препаратом яда жаб снижало выраженность реакции ГЗТ к соответствующему антигену (рис.11).  Рис. 11. Действие ядовитых секретов невооруженных активно-ядовитых животных на воспроизведение реакции гиперчувствительности замедленного типа (оценка супрессорных свойств). ^ – индекс реакции в % от показателя положительного контроля. Таким образом, препарат яда жаб обладал супрессорным действием на формирование иммунологически обусловленной воспалительной реакции. Учитывая, что биологически действующие начала яда жаб относятся к стероидным соединениям животного происхождения (Захаров,1960; Крылов, 1978; Орлов и др., 1980; Albuquerque, 1971) с мощными противоспалительными свойствами (Сейфулла, 1982; Тринус и др., 1987), можно полагать, что подавление реакции ГЗТ обусловлено антивоспалительным действием кардиотонического препарата. ^ Гемолимфа личинок колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata Say.). В диапазоне доз (0,07ЛД50 – 0,8ЛД50) белковый токсин пассивно-ядовитых животных (гемолимфа колорадского жука) стимулировала активность Т-лимфоцитов, оцениваемую по реакции ГЗТ. Адъювантные свойства гемолимфы проявляются в обоих вариантах экспериментальной воспалительной реакции (рис.12). Эффекты суммации и супрессорного действия гемолимфы не выявлены. * * * Таким образом, оценка иммунотропных свойств зоотоксинов в реакции ГЗТ позволила выявить закономерности изменения клеточных иммунных реакций на природные раздражители внешней среды. Яды первично-ядовитых животных белковой природы оказывали преимущественно стимулирующее действие на формирование экспериментальной воспалительной реакции. Ядовитые секреты вооруженных активно-ядовитых животных в малых дозах не препятствовали нормальному процессу формирования клеточной воспалительной реакции и оказывали адъювантное (стимулирующее) действие. Выраженность клеточных иммунных реакций уменьшалась при возрастании дозы, при этом яд пчелы, в отличие от яда гюрзы, не оказывал супрессорного действия. Ядовитый белковый секрет пассивно-ядовитых насекомых (гемолимфа колорадского жука), не обладал избирательностью действия в отношении клеточных иммунных реакций, но и не препятствовал нормальному процессу формирования реакции ГЗТ. Ядовитый секрет стероидной природы невооруженных активно-ядовитых животных подавлял иммунологически обусловленную клеточную воспалительную реакцию.  Рис. 12. Действие гемолимфы колорадского жука на воспроизведение реакции гиперчувствительности замедленного типа.^ – индекс реакции в % от показателя положительного контроля. А – сенсибилизация мышей антигеном с адъювантом (оценка супрессорных свойств). Б – сенсибилизация мышей антигеном без адъюванта (оценка адъювантных свойств). ^ Важным звеном в реализации патофизиологических реакций является нарушение структурных и функциональных свойств мембран лимфоидных клеток. Одной из наиболее важных причин дезинтеграции клеток является активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Повышение интенсивности ПОЛ приводит к нарушениям матричной и барьерной функции мембран, изменению активности ферментных систем, ослаблению белок-липидных взаимодействий и, как следствие этого, к структурной дезорганизации клеток (Абрамова, Оксегендлер, 1985; Владимиров, Арчаков, 1989). В тоже время имеются лишь фрагментарные данные о влиянии ядов, в частности, яда гюрзы, на процессы ПОЛ, активность ферментов антиоксидантной системы эритроцитов и генерации кислородных радикалов (Орлов, Вальцева, 1977; Корягин, Уткина, Лашина, 1991). Кроме того, изучено воздействие малых доз зоотоксинов (ядов пчелы жабы и саламандры) на активность свободнорадикальных процессов (Корягин, 2007). На первых базовых моделях, было установлено дозозависимое иммунотропное действие большинства ядов белковой природы активно-ядовитых животных. Поэтому, исследование изменений интенсивности процессов ПОЛ и фагоцитарной активности клеток крови проводили в условиях воздействия ядами вооруженных активно-ядовитых животных. Был использован яд пчелы медоносной – Apis mellifera L. и змеиные яды: гюрзы среднеазиатской – Vipera lebetina L., сем. Viperidae; эфы песчаной – Echis carinatus Schneid., сем.Viperidae; кобры среднеазиатской – Naja oxiana Eichw., сем. Elapidae.  Рис. 13. Интенсивность хемилюминесцентного ответа фагоцитарных клеток крови при действии змеиными ядами. ^ – интенсивность хемилюминесценции (мВ). Хемилюминесцентная (ХЛ) кривая фагоцитирующих клеток периферической крови контрольных проб имела относительно пологую фазу роста и характеризовалась тремя пиками активности: собственным (5-7 мин), опсоническим (12-15 мин) и суммарным (19-20мин). Максимальная хемилюминесценция клеток крови контроля составляла 0,179 мВ на 19 мин фагоцитарного ответа. Светосумма ХЛ сигнала у контрольного образца равнялась 88,41 мВ. Иной характер имели кривые ХЛ-ответа опытных проб (рис.13). Показано, что яд эфы практически сразу же после внесения в пробу резко угнетал процесс фагоцитоза. Светосумма ХЛ ответа под действием яда эфы значительно уменьшалась и составляла 43,68 мВ. Яд гюрзы, напротив, вызывал значительное усиление фагоцитарной активности, превышая более чем в два раза значение контроля (0,179 мВ) до 0,395 мВ на 9 мин фагоцитоза. В динамике развития фагоцитоза, как известно, выделяют несколько стадий (Маянский А.М., Маянский Д.М., 1989). Можно полагать, что активация процесса фагоцитоза ядом гюрзы происходила за счет более быстрого включения иммуноглобулинов, обладающих опсонизирующей активностью для нейтрофилов. Напротив, яд эфы снижал резервные возможности активированных клеток. Супрессорное действие яда эфы проявлялось в начальной внеклеточной фазе фагоцитоза и препятствовало контакту модельных антигенов с рецепторами нейтрофилов и активации мембранных механизмов клеток. Оценка действия змеиных ядов на ПОЛ эритроцитарных мембран свидетельствовала о разной степени нарушений в системе окислительного метаболизма эритроцитов (табл. 3). Яд эфы, в обеих концентрациях, не оказывал существенного влияния на кинетику ХЛ-ответа и не вызывал изменения интенсивности свечения по сравнению с контрольным образцом. Интенсивность сигнала при инкубации эритроцитов с ядом гюрзы (100 мкг) снижалась на 13% по сравнению с контролем. Яд кобры (100 мкг) приводил к значительному увеличению интенсивности ХЛ до 175 % по отношению к контролю. Пчелиный яд, характеризующийся высокой гемолитической Таблица 3 ^
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям