Эффекты взаимодействия микрочастиц цеолита с кожей: морфофункциональные показатели иммунной системы. 14. 00. 36 аллергология и иммунология
|
|
Скачать 248.35 Kb.
|
|
На правах рукописи Вязовая Елена Алексеевна Эффекты взаимодействия микрочастиц цеолита с кожей: морфофункциональные показатели иммунной системы. 14.00.36 - аллергология и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Новосибирск - 2008 Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения российской академии медицинских наук. Научный руководитель: Доктор медицинских наук Орловская Ирина Анатольевна ^ Доктор медицинских наук, профессор Останин Александр Анатольевич ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН Доктор медицинских наук, профессор Шурлыгина Анна Вениаминовна ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН ^ ФГУ «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Министерства здравоохранения и социального развития», г. Москва. Защита состоится «___________»________________________ 2008 г. в _____часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 при ГУ НИ Институте клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН (630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14) Автореферат разослан «______» ________ 2008 г. Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук О.Т. Кудаева ^ Актуальность исследования Кожа – самый крупный орган млекопитающих, она непосредственно контактирует с внешней средой и постоянно испытывает антигенную нагрузку, выполняя роль органа иммуногенеза. Функционирование кожи как иммунного органа подтверждается присутствием резидентных и рециркулирующих клеток костномозгового происхождения (резидентных гистиоцитов, клеток Лангерганса (КЛ), Т- и В-лимфоцитов, тучных клеток и гранулоцитов) и её взаимосвязью с другими иммунными органами [Зимина и др., 1994]. Воздействие на резидентные и циркулирующие иммунокомпетентные клетки кожи при помощи транскутанной иммунизации позволяет повысить иммунную защиту от ряда патогенных бактерий [Belyakov et al., 2004, Glenn and Alving, 2006], причём доставка антигенов и адьювантов через кожу с помощью корпускулярных носителей (липосом, частиц латекса, металлических наночастиц) позволяет значительно увеличить иммунный ответ по сравнению с традиционной внутримышечной иммунизацией. До недавнего времени считалось, что плотный роговой слой эпидермиса практически непроницаем для микро– и наночастиц, но в последнее время накапливаются данные о проникновении в нижние слои неповреждённого эпидермиса наночастиц различной природы [Reddy et al., 2006, Baroli et al., 2007]. При контакте антигена с кожей центральным событием в инициации иммунного ответа является миграция и созревание дендритных клеток кожи - эпидермальных клеток Лангерганса (ДК/КЛ) в ответ на локальный выброс провоспалительных цитокинов ФНО-α и ИЛ-1β [Хаитов, 2001, Cumberbatch et al., 2005, Larregina and Falo, 2005]. Благодаря своей уникальной способности к миграции КЛ/ДК переносят захваченный антиген из эпидермиса в лимфатический узел, где инициируется системная иммунная реакция [Partidos et al., 2004, Glenn and Alving, 2006]. Механизм траффика КЛ/ДК обусловлен экспрессией протеолитических ферментов – матричных металлопротеиназ (ММП): MMП-2 и ММП-9 [Shwarzenberger et al.,1996, Kobayashi et al.,1999, Ratzinger et al., 2002], чьё присутствие на клеточной поверхности позволяет клеткам мигрировать сквозь плотную базальную мембрану по направлению к дренирующему лимфатическому узлу. Одновременно генерируются сигналы, которые рекрутируют клетки- предшественники в кожу для восполнения КЛ-популяции [Jakob et al., 2001]. В условиях физиологической нормы (steady state) из эпидермиса мигрируют КЛ с фенотипом «незрелых» ДК с низкой экспрессией маркёров CD40 и CD86, обладающие свойствами индуцировать толерантность к собственным антигенам кожи и резидентной микрофлоре, населяющей роговой слой кожи [Bonifaz et al., 2002, Dhodapkar and Steinman, 2002, Stoitzner et al., 2005]. Вероятно, что постоянный траффик собственных антигенов в лимфоузел требуется для поддержания в коже «толерогенных условий» [Reddy, 2006, Yoshino et al., 2006]. Изучение процессов миграции и репопуляции КЛ в норме значительно затруднено из-за отсутствия подходящей экспериментальной модели [Larregina and Falo, 2005]. В процессе эволюции кожа адаптировалась к контакту с минеральными солями и пылевыми частицами, и, очевидно, накожные аппликации минеральных микро- и наночастиц имитируют контакт с природной средой, что происходит в рамках физиологической нормы. Поэтому накожная аппликация ЦМК может рассматриваться в качестве модели для изучения процессов миграции и репопуляции КЛ/ДК в норме. Таким образом, аппликативные воздействия ЦМК открывают новые возможности влияния на процессы миграции ДК кожи, и, опосредованно - на иммунный статус, системные иммунные реакции и процессы ремоделирования экстраклеточных элементов соединительной ткани. ^ Целью настоящего исследования является изучение влияния аппликативного воздействия цеолитсодержащей минеральной композиции (ЦМК) на развитие местных и системных иммунных реакций здоровой и повреждённой химическим аллергеном кожи, а также на возможную связь этих процессов с активностью протеолитических ферментов ММП, участвующих в ремоделировании структурных белков кожи. В соответствии с целью поставлены следующие задачи: 1. Исследовать действие ЦМК на здоровую кожу при длительном курсе аппликаций. 2. Изучить возможность проникновения микрочастиц цеолита сквозь роговой слой и базальную мембрану кожи. 3. Изучить трансдермальное воздействие ЦМК на формирование гуморального и клеточного иммунных ответов. 5. Провести сравнительную оценку влияния аппликаций гаптена ДНХБ и ЦМК на отдельные фазы контактной реакции. 4. Оценить влияние аппликаций ЦМК и гаптена ДНХБ на гемопоэтическую активность костного мозга. 6. Исследовать динамику активности экстраклеточных металлопротеиназ кожи в ответ на аппликативные воздействия ЦМК и ДНХБ. ^ Полученные в работе результаты свидетельствуют, что аппликации ЦМК вызывают разнонаправленную модуляцию миграции дендритных клеток в нормальной и повреждённой гаптеном коже, а также влияют на процесс костномозгового гемопоэза, что даёт возможность контролировать формирование местных и системных реакций иммунитета. Впервые продемонстрировано присутствие в цитоплазме ДК кожи микрочастиц кристаллического минерала - цеолита (ЦМК) после его аппликативного нанесения; при этом наблюдается значительное увеличение количества мигрирующих в лимфатический узел ДК, по сравнению с контролем. Впервые показано, что многократное кратковременное транскутанное воздействие ЦМК стимулирует гуморальный иммунный ответ. При данном способе воздействия ЦМК наблюдается также стимуляция процесса кроветворения в костном мозге мышей (достоверное повышение количества КОЕ-ГМ). Впервые показано, что аппликации ЦМК проявляют противовоспалительную активность при экспериментальном аллергическом контактном дерматите: наблюдается снижение миграции ДК и уменьшение отёка. Впервые показано, что воздействие аллергена с формированием АКД вызывает значительное увеличение количества костномозговых гранулоцитарно-макрофагальных (КОЕ-ГМ) и смешанных (КОЕ-ГЭММ) колоний, что может свидетельствовать о «включении» в костном мозге механизмов компенсаторного пополнения пула гранулоцитов/макрофагов. ЦМК в условиях АКД вызывает недостоверное снижение числа КОЕ-ГМ и достоверное - количества КОЕ-ГЭММ, по сравнению с воздействием аллергена. Впервые показано, что после многократных аппликаций ЦМК изменяется профиль ММП (выявлено отсутствие MMП-2, способной деградировать коллаген I типа). Суммарная активность ММП в кондиционированной среде кожи существенно возрастает под воздействием аллергена, а аппликации ЦМК вызывают достоверное снижение этого показателя. ^ Аппликативные воздействия цеолитовых микрочастиц открывают дополнительные возможности влияния на процессы миграции ДК кожи, и, опосредованно - на иммунный статус, системные иммунные реакции и процессы ремоделирования экстраклеточных элементов соединительной ткани, что в дальнейшем может найти применение в коррекции воспалительных процессов соединительной ткани. ^ 1. Аппликации ЦМК на интактную кожу повышают гуморальный и клеточный иммунный ответ. 2. При экспериментальном аллергическом контактном дерматите ЦМК обладает противовоспалительным и десенсибилизирующим эффектом, снижая миграцию дендритных клеток кожи и отёк. 3. Накожные аппликации ЦМК снижают в повреждённой контактным аллергеном коже активность ферментов, разрушающих белки внеклеточного матрикса. ^ Основные результаты работы доложены и обсуждены на: межрегиональной научно-практической конференции «Новые химические системы и процессы в медицине», Новосибирск, Россия, 21-22 декабря 2001г., IХ Международном съезде ФИТОФАРМ, Санкт-Петербург, Россия, 22-25 июня 2005 г., 3-й Международной конференции «Фундаментальные науки – медицине», Новосибирск, Россия, 2-8 сентября 2007 г. и на XII международном съезде - PHYTOPHARM -2008, St.-Petersburg, Russia, 2-4 July, 2008. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 1 патент и 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК для опубликования результатов соискателями учёной степени кандидата наук. ^ Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 7 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 126 страницах машинописного текста, включающего 5 таблиц и 33 рисунка. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 209 литературных источников, в том числе, 197 иностранных. ^ Животные Инбредные мыши линии Balb/c, и крысы линии Вистар были получены из Экспериментальной клиники животных (моделей) СО РАМН (Новосибирск). Всего в работе использовано 85 крыс весом 180-200 граммов и 250 мышей весом 18-20 граммов. Каждый эксперимент проводили не менее, чем в двух повторах, число животных в группах было не менее 5. ^ Аппликативные воздействия. ЦМК наносили в виде водной суспензии в объёмном соотношении ЦМК: вода, равном 2:1 мышам – на дорзальную поверхность обоих ушей, крысам - на выстриженный в межлопаточной области участок кожи площадью 4х4 см, время контакта нанесённого состава с кожей – 3 минуты. После завершения экспозиции кожу промывали теплой проточной водопроводной водой и вытирали полотенцем. Аппликации проводили ежедневно в 11 часов утра. Контролем служили животные, которым по той же схеме апплицировали водопроводную воду. В экспериментах на крысах аппликации проводили ежедневно в течение 3-х недель, после чего животных декапитировали под поверхностным эфирным наркозом и препарировали органы для гравиметрического анализа. С места нанесения аппликаций забирали образцы кожи для электронной микроскопии и микроэлементного анализа, а также забирали селезёнку, тимус, лёгкое и аксиллярные лимфатические узлы для гистологического исследования. ^ Для оценки гуморального иммунного ответа мышей иммунизировали внутривенно 0,5 мл 0,5% суспензии эритроцитов барана (ЭБ) на 8-ой день от начала аппликаций, после иммунизации аппликативные воздействия прекращали. Число АОК в селезёнке определяли методом локального гемолиза [Колесникова и др., 2006] на 4-е сутки после иммунизации. ^ Для оценки влияния аппликативных воздействий ЦМК на клеточное звено иммунитета использовали метод “величина отёка уха” на фоне контактного аллергена динитрохлорбензола (ДНХБ) [Garrigue et al., 1994]. 50 мл 1% раствора ДНХБ в растворителе ацетон:оливковое масло (4:1), либо 50 мкл растворителя (в группах животных «ЦМК» и «контроль») наносили на межлопаточную область мышей Balb/c, где предварительно была выстрижена шерсть на участке площадью 1,5×1,5 см, в течение 3-х дней. ЦМК в группе животных «ДНХБ+ЦМК» наносили на этот же участок кожи через 30 минут после нанесения аллергена, затем кожу животных всех групп в месте аппликаций промывали под струёй воды и вытирали полотенцем. На 5-ый день от начала аппликаций всем животным наносили 25 мкл 0,4% ДНХБ на обе поверхности левого уха (провокация), на правое наносили такое же количество растворителя. Через 24, 48 и 72 часа замеряли толщину обоих ушей с помощью электронного штангенциркуля, за величину отёка принимали разницу толщины левого и правого ушей для каждого животного. ^ Использовали модификацию MEST по методу [Rios et al., 2005]. 1% раствор гаптена ДНХБ апплицировали 2 дня по прежней схеме, а на 3-ий день, когда кожа на месте аппликаций (межлопаточная область спины) уже была воспалена, за 1 час до нанесения ДНХБ на воспалённый участок спины и на оба уха наносили суспензии цеолита, талька и мальтозы в насыщенном растворе NaCl, либо раствор NaCl без каких-либо добавок. Таким образом, гаптен апплицировали на 1, 2 и 3 дни на область спины, суспензии наносили на 3, 4 и 5 дни. На 6-е сутки проводили провокацию нанесением 25 мкл 1% раствора гаптена на обе поверхности левого уха и 25 мкл растворителя – на правое, замеры величины отёка проводили на пике реакции, через 48 часов от провокации. ^ Клеточный иммунитет оценивали по степени выраженности гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) [Yoshikai et al., 1979]. ^ . Исследуемые вещества: 1% раствор ДНХБ, суспензию ЦМК, растворитель (ацетон:оливковое масло) апплицировали на дорзальную поверхность обоих ушей в течение 3-х дней по классической схеме MEST[Garrigue et al., 1994], и на 5-ый день от начала аппликаций забирали костный мозг для исследования. Для определения числа коммитированных предшественников клетки костного мозга инкубировались в 24-луночных планшетах (50х103 клеток/лунку) в метилцеллюлозной среде М 3434. Гранулоцитарно-макрофагальные (КОЕ-ГМ) и эритроидные (БОЕ-Э+КОЕ-Э) колонии подсчитывались под инвертированным микроскопом после 14-дневной инкубации при температуре 37 0С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2. ^ Исследование функциональной активности макрофагов перитонеального экссудата крыс проводилось с помощью НСТ-теста [Rook et al., 1985], отражающего уровень окислительно-восстановительного метаболизма клеток. Культивирование клеток (1 x106 клеток/лунку), процедуру окраски и определение оптической плотности проводили в 96- луночных микропланшетах (Nunc), уровень функциональной активности оценивали по изменению оптической плотности при длине волны 620 нм. ^ Миграцию клеток из кожного эксплантата определяли по методу [Larsen et al., 1990]. После однократной аппликации мышам 25мкл 1% раствора ДНХБ на дорзальную поверхность обоих ушей через 17 часов готовили эксплантаты: животных забивали цервикальной дислокацией под эфирным наркозом, уши промывали 70% этанолом, отделяли дорзальную часть кожи уха и помещали дермальной стороной вниз в ячейку 24-луночного планшета с 1 мл полной культуральной среды МЕМ. Планшет инкубировали в течение 24 часов при 37 ºС во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2. Затем клетки собирали: отсасывали среду в центрифужные пробирки, вносили в каждую лунку по 100 мкл культуральной среды с 0,25% трипсином, инкубировали при 37 ºС, затем вносили по 200 мкл полной среды, смывали прилипшие клетки и объединяли с первой порцией клеток в центрифужных пробирках. Клетки концентрировали центрифугированием при 1500 об/мин, супернатант осторожно отсасывали и замораживали при -20ºС для дальнейшего определения в нём активности ММП. Количество клеток, мигрировавших из одного уха, подсчитывали в камере Горяева. ^ Для микроскопирования клеток, мигрировавших из кожного эксплантата, на дно ячеек планшета помещали стерильные покровные стёкла, которые по окончании культивирования забирали и фиксировали. Для световой микроскопии стёкла высушивали при комнатной температуре, затем фиксировали в 30% водном растворе ацетона в течение, окрашивали по Романовскому, и число клеток на единицу площади подсчитывали с помощью микронной сеточки. Для электронной микроскопии клетки фиксировали в 4% водном растворе глутарового альдегида не менее 2 часов при комнатной температуре, микроскопировали с помощью электронного микроскопа Zeiss Libra 120. Для лазерного сканирования на конфокальном микроскопе клетки фиксировали в 40% формалине в течение 15 минут, сканирование проводили с помощью лазерного сканирующего микроскопа LSM 510 Meta версии 3.5, Carl Zeiss. Органы для гистологического анализа фиксировали и окрашивали стандартными методами. ^ Готовили 0,1% раствор ФИТЦ в ацетоне [Sangaletti et al., 2005], смачивали им порошок цеолита в соотношении 1:2 (объём раствора: вес цеолита), тщательно перемешивали и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Из окрашенного цеолита готовили ЦМК и апплицировали обычным способом. ^ Образцы кожи высушивали до постоянного веса в термостате при 70 ºС, навеску кожи озоляли концентрированной азотной кислотой и проводили фазовый элементный анализ методом атомно-эмиссионной эмиссии в индуктивно-связанной плазме (АЭС-ИСП) [Томпсон и Уолш, 1988]. ^ Активность ММП в культуральных средах определяли твердофазным методом по деградации сорбированной желатины в 96-луночных планшетах для иммуноферментного анализа, проявление проводили с помощью окраски остаточного субстрата красителем Кумасси синий [Isaksen and Fagerhol , 2001]. Сорбцию микропланшетов (MaxiSorb, Nunc) проводили раствором желатины и хранили их в морозильной камере при -20 ºС до использования. Определение активности ММП проводили в присутствии активирующего раствора, содержащего ионы Ca++, Zn++, APMA (аминофенилацетата ртути) и консерванта NaN3 в течение 24 часов при 37 ºС. Каждую пробу вносили в 4 лунки, в 2 лунки добавляли ингибитор ММП – 20 мМ ЭДТА. По окончании инкубации планшеты промывали дистиллированной водой, и оставшийся субстрат окрашивали раствором Кумасси синего. Краску переводили в раствор и определяли оптическую плотность со светофильтром на 595 нм. Калибровочную кривую строили по активности коллагеназы из Сlostridium. ^ Образцы кожи для зимографии немедленно после изъятия замораживали при -20ºС, затем кожу в замороженном состоянии измельчали бритвенным лезвием и проводили экстракцию металлопротеиназ при +4º С в течение 18 часов, экстракты центрифугировали в течение 10 минут при 10000 об/мин и в супернатантах выявляли профиль желатиназ, разделяя белки в полиакриламидном геле, содержащем желатин [Machein and Conca, 1997]. ^ Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета статистических программ “Statgrafics, Vers 5.0”. Достоверность обнаруженных межгрупповых различий оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. ^ Характеристика морфологических изменений иммунокомпетентных органов, показателей периферической крови и активности ММП при многократных аппликациях ЦМК на интактную кожу Сравнительный анализ морфологических изменений и параметров иммунного статуса показал, что многократные ежедневные аппликации ЦМК, в отличие от контроля (аппликации воды) вызывают достоверное снижение весовых индексов селезёнки и тимуса только при длительной (20-минутной) экспозиции (табл.1), что свидетельствует о возможности кожно-резорбтивного действия ЦМК, и вовлечении иммунной системы в реакцию на аппликативные воздействия цеолитсодержащих минеральных композиций. Во всех дальнейших экспериментах время аппликации ЦМК составляло 3 минуты. Таблица 1. Изменение весовых индексов лимфоидных органов крыс линии Вистар при аппликациях минеральной композиции на кожу спины (мг/100 г веса тела)
*- достоверно по отношению к контрольной группе животных, р <0,05 Анализ периферической крови показал изменения количества некоторых форменных элементов: повышенное содержание лимфоцитов в циркуляции и изменения массы лимфоидных органов животных опытных групп позволяет предполагать иммуномодулирующий характер изучаемых аппликаторов; отмечено также стойкое снижение количества эозинофильных гранулоцитов во все изученные сроки забора материала в опытной группе (табл.2). Таблица 2. Динамика изменений в лейкоцитарной формуле периферической крови крыс в ответ на аппликативные воздействия ЦМК
* - достоверно по отношению к контрольной группе животных, р < 0,05 Повышение количества лимфоцитов на 7 и 22 дни согласуется с морфологическими изменениями, обнаруженными в лимфоидной ткани: увеличением объёма лимфоидной ткани селезенки, повышенным содержанием лимфоцитов в корковой зоне тимуса и увеличением числа лимфоидных фолликулов в лимфатических узлах кожи. Отмечена повышенная миграция макрофагов в дерму. Динамика изменений уровня окислительно-восстановительного метаболизма перитонеальных макрофагов подтверждает системный характер реакции фагоцитов на аппликативные воздействия (рис.1) Рисунок 1. Показатели НСТ-теста резидентных перитонеальных макрофагов крыс после аппликаций минеральных композиций на 3, 7 и 22 дни от начала воздействия (оптическая плотность при 620 нм).  *- достоверно по отношению к контрольной группе животных, р < 0,05 Возрастание толщины кожной складки на 20% и содержания минералов в области аппликативных воздействий, выявленное элементным анализом, позволяют предположить, что во время аппликаций происходит адсорбция и транспортировка микрочастиц и растворимых компонентов ЦМК клетками кожи. Анализ состава матричных металлопротеиназ кожи на 7-е сутки от начала аппликативных воздействий показал отсутствие ММП-2 в участке контакта кожи с ЦМК; этим объясняется накопление коллагена I типа и возрастание толщины кожной складки. Изучение влияния аппликаций ЦМК на системные иммунные реакции мышей Согласно полученным данным, аппликативные 3-минутные аппликации ЦМК мышам, на дорзальную поверхность ушей в течение 7 дней до иммунизации достоверно увеличивают число АОК в селезенках мышей по сравнению с контролем (рис. 2). Оценка интенсивности клеточного иммунного ответа в тех же условиях (предварительные аппликации ЦМК в течение 7 дней до иммунизации ЭБ) выявила умеренное, статистически недостоверное повышение реакции ГЗТ в опытной группе относительно контроля. Индекс реакции в контрольной группе мышей составляет 19,8% ± 3,6%, в опытной группе - 29,7% ± 5,7% Рисунок 2. Влияние аппликативного воздействия ЦМК и ее ингредиентов на гуморальный иммунный ответ у мышей Balb/c.  *- достоверно по отношению к контрольной группе животных, р <0,05 Исходя из полученных результатов можно констатировать, что многократные ежедневные аппликации ЦМК на неповреждённую кожу лабораторных животных увеличивают интенсивность клеточного и гуморального иммунных ответов, влияют на макрофагальные реакции и изменяют состав ММП кожи. Чтобы оценить возможность проникновения микрочастиц цеолита сквозь эпидермис и их захвата фагоцитами кожи, мы провели лазерное сканирование по объёму мигрирующих из кожного лоскута фагоцитов. Отмечена повышенная миграция лейкоцитов из кожного лоскута после аппликаций ЦМК, помеченного флуоресцирующим красителем (ФИТЦ). Внутри клеток обнаружены окрашенные частицы цеолита с размерами, превышающими 1 микрон. Таким образом, исходя из полученных результатов, можно сделать вывод о проникновении микрочастиц цеолита сквозь SC в экстраклеточный матрикс кожи, где их захватывают эпидермальные антигенпрезентирующие КЛ/ДК, что вызывает их мобилизацию к миграции из эпидермиса в дренирующие лимфатические узлы. Влияние аппликаций ЦМК на кожу, поврежденную контактным аллергеном Сравнительная оценка влияния аппликации гаптена ДНХБ и ЦМК на миграцию дендритных клеток кожи мышей Balb/c в модели аллергического контактного дерматита (MEST) выявила усиление миграции ДК под воздействием как ЦМК, так и аллергена; совместное последовательное нанесение аллергена и ЦМК вызывает снижение миграции ДК до уровня контроля (рис. 3). Рисунок 3. Влияние аппликаций гаптена и ЦМК на миграцию лейкоцитов из кожного эксплантата (афферентная фаза контактной реакции)  * - достоверно по сравнению с группой ЦМК, (р <0,05) ** - достоверно по сравнению с группой ДНХБ, (р <0,05) В тесте «отёк уха» (MEST) установлено, что ежедневные аппликации (в течение 3-х дней) ЦМК после воздействия гаптена ДНХБ на тот же участок кожи (межлопаточная область спины) достоверно снижают величину отёка в ответ на разрешающую дозу аллергена, опосредуемого цитотоксическими лимфоцитами (рис. 4). Рисунок 4. Величина отёка левого уха через 24 часа после провокации с помощью повторного нанесения гаптена (эфферентная фаза контактной реакции).  * - достоверно относительно контрольной группы (р < 0,05) ** - достоверно относительно группы ДНХБ (р < 0,05) Через 48 и 72 часа после провокации в группе животных «ДНХБ+ЦМК» наблюдается заметное снижение отёка, в то время как в группе «ДНХБ» этот показатель практически не меняется (рисунок 5). Рисунок 5. Влияние ЦМК на величину отёка левого уха мышей под воздействием разрешающей дозы аллергена ДНХБ через 24, 48 и 72 часа после провокации.  * - достоверно относительно контрольной группы (р < 0,05) ** - достоверно относительно группы ДНХБ (р < 0,05) Таким образом, аппликативное применение ЦМК оказывает противовоспалительное действие на фоне контактной реакции на гаптен ДНХБ как в индуктивной, так и в продуктивной фазах, уменьшают высоту и продолжительность локальной воспалительной реакции, опосредованной CD8+ Т-лимфоцитами. Аппликации ДНХБ вызывают значительные повреждения кожи: в результате цитотоксического действия Т-лифоцитов, направленного против кератиноцитов, эпидермис повреждается и образуется струп. Установлено, что при совместном нанесении гаптена и ЦМК заживление раны и отделение струпа наступает уже на 14-16 дни, в среднем на 5 дней раньше, чем в группе ДНХБ. С целью исследования влияния гаптена ДНХБ, ЦМК и их совместного применения на процессы дифференцировки стволовой клетки костного мозга (СКК) мы изучали колониеобразующую способность коммитированных гемопоэтических предшественников. Установлено, что воздействие аллергена стимулирует костномозговой гемопоэз, с увеличением числа гранулоцитарно-макрофагальных, эритроидных и смешанных колоний, что свидетельствует о генерализованной воспалительной реакции, с вовлечением гемопоэтических процессов. Аппликации ЦМК избирательно повышают количество КОЕ-ГМ, а совместное нанесение ДНХБ+ЦМК нивелирует повышенную аллергеном гемопоэтическую активность (табл.3). Таблица 3. Количество колоний гемопоэтических клеток на бедро в костном мозге мышей Balb/c при аппликациях ДНХБ и ДНХБ в сочетании с ЦМК на 6-е сутки от начала аппликаций.
* - достоверно относительно контрольной группы (р < 0,05) ** - достоверно относительно группы ДНХБ (р < 0,05) ~ - достоверно относительно интактной группы (р < 0,05 Для исследования влияния аппликаций ЦМК на процессы ремоделирования ЭКМ нормальной и повреждённой кожи мы определяли суммарную активность внеклеточных ММП в культуральных средах, полученных после 24-часовой инкубации кожных лоскутов. Установлено, что под влиянием ЦМК суммарная активность ММП в культуральной среде, полученной при культивировании кожного лоскута через 17 часов после аппликации не меняется, тогда как гаптен значительно повышает суммарную активность ММП (в 4,8 раз). Последовательное нанесение на этот же участок кожи ЦМК несколько снижает активность ММП, но сохраняется достоверно высокий уровень (в 3,3 раза выше контроля) (рис. 6). Рисунок 6. Суммарная активность ММП в культуральных средах эскплантатов кожи мышей. Эксплантаты получены через 17 часов после аппликативных воздействий.  * - достоверное отличие от контроля, (p<0,05). ** - достоверное отличие от группы ДНХБ, (p<0,05). Итак, аппликативные воздействия ЦМК влияют на процессы миграции КЛ/ДК из кожи в дренирующий лимфоузел, а также - на процесс костномозгового гемопоэза как у интактных животных, так и в условиях аллергической контактной реакции на гаптен. Наши исследования показали, что разнонаправленная модуляция миграционных процессов ДК с помощью микрочастиц цеолита (ЦМК) согласуется с обнаруженными изменениями местных и системных показателей иммунитета. Полученные в представленной работе результаты расширяют представления об иммунорегуляторном потенциале дендритных клеток кожи, демонстрируют возможность воздействий на течение аллергического контактного дерматита как на местном, так и на системном уровнях. Таким образом, аппликативные воздействия цеолитовых микрочастиц открывают дополнительные возможности влияния на процессы миграции ДК кожи, и, опосредованно - на иммунный статус, системные иммунные реакции и процессы ремоделирования экстраклеточных элементов соединительной ткани. Выводы
^ 1. Вязовая Е.А., Леснова Н.В., Болдырева Н.Н., 2002, Изучение элементного состава водной фазы цеолитсодержащих косметических композиций, Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Новые химические системы и процессы в медицине», 21-22 декабря, Новосибирск, 224-227. 2. Вязовая Е.А., Габуда С.П., Леснова Н.В., 2005, Изучение специфического воздействия аппликаций минеральных композиций на соединительную ткань лабораторных крыс, Материалы IХ Международного съезда ФИТОФАРМ, Санкт-Петербург, Россия, 22-25 июня, 583-587. 3. Габуда С.П., Гайдаш А.А., Вязовая Е.А., 2005, Структура коллагена и разупорядоченность водной подсистемы в фибриллярных белках по данным 2Н ЯМР, Биофизика, 50, (2), 231-235. 4. Вязовая Е.А., Орловская И.А., Козлов В.А., 2007, Влияние накожных аппликаций мелкодисперсной минеральной композиции на морфо-функциональные показатели иммунной системы, Иммунология, 28(6), 338-342. 5. Вязовая Е.А., Габуда С.П., Леснова Н.В. Косметическая биологически активная добавка и косметический литофитокомплекс на её основе, Роспатент, (19) RU (11) 2308937 (13) C1 A61K8/97 (2006.01) A61K 8/19 (2006.01) заявка № 2006101856/15 6. Вязовая Е.А., Орловская И. А., 2007, Влияние аппликаций мелкодисперсной цеолитсодержащей композиции на формирование иммунного ответа, 3-я Международная конференция «Фундаментальные науки – медицине», Новосибирск, Россия, 2-8 сентября, стр.111. 7. Vyazovaya. E. A., 2008, The anti-inflammatory effects of mineral zeolite-containing composition (MZC) on the mouse skin contact reactions, The XII International Congress PHYTOPHARM -2008, St.-Petersburg, Russia, 2-4 July, p.141. Список сокращений АКД - аллергический контактный дерматит ДК - дендритные клетки ИЛ - интерлейкин КЛ – клетки Лангерганса КОЕ – колониеобразующие единицы костного мозга ММП – матричные металлопротеиназы ПААГ – полиакриламидный гель УФ – ультрафиолетовое излучение ФИТЦ – флюоресцеина изотиоцианат ФНО – фактор некроза опухоли ЦМК – цеолитсодержащая минеральная композиция ЭБ - эритроциты барана ЭКМ – эстраклеточный матрикс МЕМ – модифицированная среда Игла MEST – mouse ear swelling test – тест «отёк уха» |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям