Характеристика иммунной и кроветворной систем у больных раком молочной железы на различных этапах противоопухолевой терапии 14. 00. 36 аллергология и иммунология
|
|
Скачать 407.07 Kb.
|
|
На правах рукописи СЕЛИХОВА Юлия Борисовна ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУННОЙ И КРОВЕТВОРНОЙ СИСТЕМ У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ НА РАЗЛИЧНЫХ ЭТАПАХ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ 14.00.36 – аллергология и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Новосибирск – 2008 Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт клинической иммунологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. ^ академик РАМН, Козлов Владимир Александрович профессор, доктор медицинских наук Официальные оппоненты: профессор, Климов Владимир Васильевич доктор медицинских наук ГУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию», г. Томск доктор медицинских наук Колесников Анатолий Петрович ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, г. Новосибирск ^ ГУ Научно-исследовательский институт онкологии Томского научного центра СО РАМН, г. Томск Защита диссертации состоится «____» _____________ 2008 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 при Государственном учреждении Научно-исследовательский институт клинической иммунологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630099, Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно-исследовательский институт клинической иммунологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630099, Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14). Автореферат разослан «____» _____________ 2008 г. Ученый секретарь О.Т. Кудаева диссертационного совета, доктор биологических наук ^ Актуальность темы. Экологическая и социально-экономическая обстановка в мире обусловила интенсивный рост частоты злокачественных новообразований. Основной причиной онкологической заболеваемости и смертности среди женщин является рак молочной железы (РМЖ). Наблюдается заметное «омоложение» РМЖ - в настоящее время молодые женщины (до 40лет) болеют вдвое чаще, чем 30 лет назад. Несмотря на значительные успехи в диагностике и лечении РМЖ, последние три десятилетия отмечается неуклонный рост заболеваемости этой патологией, преимущественно в развитых странах. Так, по данным ВОЗ каждый год в мире регистрируется около 1 млн новых случаев РМЖ, в странах СНГ – свыше 50 тысяч. Эта патология развивается у каждой восьмой женщины в США, и у каждой десятой женщины в странах Европы [Stewart B. et al., 2003; Зотов А.С. и др., 2005; Couzin J., 2005; Imai H. et al.,, 2007]. В большинстве случаев при РМЖ II-III стадий проводится комплексная противоопухолевая терапия [Летягин В.П., 2004; Зотов А.С. и др., 2005; Переводчикова Н.И., 2007]. Такой подход позволяет добиться ремиссии, продлить жизнь больных. Но объемные хирургические операции, лучевая терапия и цитостатическая химиотерапия (ХТ), приводят к дополнительным нарушениям функций исходно компрометированной иммунной системы. Возможности ХТ лимитируются выраженными побочными эффектами цитостатических препаратов и в первую очередь - токсическим действием в отношении систем крови и иммунитета. Во время противоопухолевого лечения у онкологических пациентов наблюдается иммунодепрессия, имеющая несколько составляющих: предшествующий онкогенезу дефект функции иммунного надзора, опухоль-индуцированная и ятрогенная супрессия иммунитета [Бережная Н.М. и др., 2000; Козлов В.А.и др., 2004; Новиков В.И. и др., 2006]. В этих условиях возрастает риск развития вторичных инфекций, аутоиммунных реакций, вторичных онкозаболеваний, а также рецидива/метастазирования опухоли за счет ослабления механизмов иммунного надзора. Вышесказанное обосновывает иммунотерапию как важную составляющую комплексного лечения злокачественных опухолей. Сегодня наилучшие результаты неспецифической иммунотерапии в онкологии достигнуты при применении препаратов цитокинов и их аналогов. В связи с чем, в попытке создать лекарственный комплекс из естественных для человека основных иммунорегуляторных пептидов, для иммунореабилитации была выбрана комбинация, включающая ронколейкин, тимоген и лейкинферон. Такое сочетание препаратов у больных РМЖ применяется впервые, хотя существуют данные об успешном изолированном применении каждого из них при этой патологии [Кузнецов В.П., 2000.; Чистяков С.С. и др. 1995; Молчанов О.Е., 2005; Попович А.М., 2002; Мирошник О.А., 2006]. Выявление механизмов и сроков развития нарушений иммуногемопоэза у больных РМЖ при проведении противоопухолевого лечения позволит проводить более успешный поиск и разработку новых походов по профилактике и коррекции иммунных нарушений с целью повышения эффективности традиционной терапии и улучшения качества жизни пациентов. ^ Изучить особенности нарушений иммунной и кроветворной систем, механизмы иммунной реконституции и возможности иммунореабилитации у больных РМЖ при проведении комплексной противоопухолевой терапии. ^
^ Впервые получены новые данные о динамике развития нарушений гемоиммунопоэза у больных РМЖ на разных этапах комплексного противоопухолевого лечения. Установлено, что уже до начала ХТ – после лучевой терапии и хирургического лечения – развиваются цитопения и иммунодепрессия, которые усугубляются в процессе проведения последующей ХТ. Впервые охарактеризовано влияние противоопухолевой терапии на цитокин-продуцирующую функцию клеток крови. Показано, что после радиотерапии/хирургического лечения у больных выявляется усиление продукции ростовых кроветворных факторов (G-CSF, IL-17) и хемокинов (MCP-1, MIP-1β), возрастание индуцированной продукции провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-12, IL-17) и снижение уровня IL-13. При этом ХТ приводит к дальнейшему усилению спонтанной продукции G-CSF и ослаблению продукции цитокинов/хемокинов с провоспалительной активностью (MIP-1β, IL-12, IL-17). Получены новые данные, косвенно свидетельствующие о включении механизмов гомеостатической пролиферации уже на ранних этапах противоопухолевого лечения, предшествующих ХТ. Установлена взаимосвязь частоты инфекционных осложнений ХТ с изменением продукции цитокинов. Показано, что иммунотерапия препаратом ДНК (деринат), проводимая одновременно с ХТ, сопровождается снижением содержания эритроцитов, нарастанием частоты инфекционных осложнений и не способствует улучшению показателей иммунитета в раннем восстановительном периоде. В то же время короткий курс комбинации иммуностимуляторов (ронколейкин, лейкинферон, тимоген) после окончания противоопухолевого лечения характеризуется противовоспалительным эффектом и улучшает показатели крови. ^ Проведенные исследования расширяют представления о характере и динамике нарушений кроветворения и иммунной системы в процессе проведения комплексного противоопухолевого лечения у больных РМЖ и являются обоснованием для назначения иммунокорригирующей терапии. При этом полученные результаты свидетельствуют, что иммунотерапия является эффективной, когда проводится в виде короткого курса комбинации иммуномодуляторов после завершения ХТ. В то же время часто назначаемый во время ХТ препарат ДНК не позволяет добиться коррекции иммунных дисфункций у больных РМЖ и приводит к углублению анемии и более частому развитию инфекционных осложнений. ^
^ Материалы диссертации были доложены и обсуждены на 1) врачебных научно-практических конференциях (Новосибирск, 2006г.); 2) научной отчетной сессии ГУ НИИ клинической иммунологии СОРАМН (Новосибирск, 2006г.); 3) V международном конгрессе по иммунопатологии (Москва, 2007г.); 4) научном семинаре ГУ НИИ клинической иммунологии СОРАМН (Новосибирск, 2008г.). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 1 статья - в журнале, рекомендованном ВАК для публикации результатов диссертационных работ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. ^ Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 118 страницах, включает 24 таблицы и 4 рисунка. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 194 литературных источника, в том числе 123 иностранных. ^ Материал и методы исследования Общая характеристика больных. Работа основана на результатах обследования 50 пациентов и 50 здоровых доноров. Все пациенты – женщины, больные РМЖ II и III стадий (T2-4 N 0-2 M0), проходившие стационарное обследование и лечение в МУЗ ГКБ №1 г.Новосибирска. Иммунологическое обследование и иммунотерапия проводились в иммунологическом отделении клиники ГУ НИИ КИ СОРАМН. Возраст пациентов - от 32 до 68 лет. Все пациенты получали стандартное комплексное противоопухолевое лечение: 1) предоперационную лучевую терапию, 22-26 сеансов; 2) через 1 месяц - хирургическое лечение (радикальная односторонняя мастэктомия по Маддену); 3) через 20 дней - ХТ по схеме АС (доксорубицин 60мг/м2 и циклофосфамид 600мг/м2, введение 1раз в 21день, всего 4 курса). Группу контроля составили здоровые доноры: у 50 человек (возраст от 20 до 65 лет) проводился общий анализ крови и оценка иммунограммы, у 13 человек (возраст от 32 до 67 лет) – определение продукции 9 цитокинов. Обследование пациентов проводилось в 3 этапа: 1) через 15-20 дней после хирургического лечения (до начала ХТ); на момент обследования у всех пациентов были удалены послеоперационные дренажи, и констатировалось заживление послеоперационного шва, n=50; 2) через 1 месяц после окончания ХТ, n=35; 3) через 3 месяца после окончания ХТ, n=35. У всех пациентов проводился общий анализ крови и оценка иммунного статуса (количество CD3+, CD4+, CD8+, СD16+ и CD19+ лимфоцитов; эффекторные функции лимфоцитов; функциональная активность фагоцитарных клеток). У части пациентов (1-й этап - n=13; 2-й этап - n=13; 3-й этап - n=14) оценивалась продукция 9 цитокинов - IL-1β, IL-5, IL-7, IL-12 (p 70), IL-13, IL-17, G-CSF, MCP-1, MIP-1β . 14 отобранных случайным образом пациентов через 1 месяц после окончания ХТ, после 2-го этапа обследования, получали 10-дневный курс иммунореабилитации. Период после окончания противоопухолевого лечения, когда достигается минимум опухолевой нагрузки в организме пациента, является наиболее благоприятным и безопасным для проведения иммунотерапии. Выбор препаратов основывался на литературных данных о стимулирующем влиянии каждого из них на гемопоэз, функциональную активность иммунокомпетентных клеток и противоопухолевый иммунитет. В иммунотерапии была использована комбинация из трех иммуностимуляторов (Ронколейкин 250тыс.ед. подкожно через день №5, Лейкинферон 1ампула/10000МЕ человеческого ИФН-α/ внутримышечно через день №5, Тимоген 1мл /100мкг/ внутримышечно 1 раз в день ежедневно №10). Ронколейкин – рекомбинантный IL-2, продуцируемый клетками пекарских дрожжей Saccharomyces cerviciae, в генетический аппарат которых встроен ген IL-2 человека. Лейкинферон – комплекс цитокинов (IFN-α, IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α, MIF и LIF), продуцируемых лейкоцитами крови здоровых доноров под воздействием вируса. Тимоген – синтетический аналог тимического пептида (глутамил-триптофана мононатриевая соль моногидрат). ^ Общий анализ периферической крови проводился на гемоанализаторе «HEMA-Screen 13» (Швейцария-Италия). ^ определяли с помощью проточного цитометра FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) в программе CellQuestPro (Becton Dickinson, USA), используя параметры светорассеяния, в соответствии с инструкциями производителя. Поверхностные маркеры лимфоцитов выявляли с помощью меченных моноклональных антител против CD3, CD4, CD8, СD16, CD19. ^ оценивали по показателю активации нейтрофилов (ПАН) и моноцитов (ПАМ), определяемым по продукции перекиси водорода клетками после инкубации с опсонизированным зимозаном (опыт) и раствором Хенкса (контроль). Результат оценивался на анализаторе (Multiskan MS, Labsystems, Финляндия) по интенсивности окрашивания пробы (учитывали оптическую плотность - ОП), которое происходило за счет окисления ортофенилдиамина (ОФД) в процессе катаболизма перекиси водорода. Стимуляцию продукции перекиси водорода выражали как ПАН в пробах с лейкоцитами и ПАМ в пробах с мононуклеарами в виде частного от деления ОП в опыте на ОП в контроле. Также активность гранулоцитов и моноцитов (фагоцитоз) оценивалась методом проточной цитометрии после инкубации выделенных клеток с латексом, нагруженным гамма-глобулином (Биопрепарат, Санкт-Петербург) и меченным ФИТЦ. По количеству поглощенных одной клеткой тест-частиц определялось количество фагоцитирующих клеток и интенсивность фагоцитоза. ^ [Лозовой В.П., Кожевников В.С., 1990] проводили с помощью трёх показателей, вычисляемых с использованием полученного в лунках количества клеток (использовали среднее значение результатов двух однотипных лунок – дублей): индекса миграции (ИМ), индекса ингибиции миграции (ИИМ) и показателя эффекторных функций (ПЭФ). ИМ представляет собой частное от деления количества клеток в опыте 1 (с низкой дозой ФГА, стимулирующей миграцию гранулоцитов и моноцитов) на таковое в контроле и характеризует подвижность клеток в ответ на стимул. ИИМ равен частному от деления количества клеток в опыте 2 (с оптимальной дозой ФГА, стимулирующей продукцию лимфоцитами факторов ингибиции миграции) на таковое в контроле и характеризует потенциальную активность лимфоцитов – продуцентов факторов ингибиции миграции (эффекторов гиперчувствительности замедленного типа). ПЭФ – интегральный показатель активности ГЗТ-эффекторов (лимфоцитов и гранулоцитов с моноцитами), представляющий собой частное от деления ИМ на ИИМ. ^ (IL-1β, IL-5, IL-7, IL-12 (p 70), IL-13, IL-17, GCSF, MCP-1, MIP-1β) оценивали методом проточной флюориметрии на двулучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем (определяемый динамический диапазон 2-32000 пкг/мл). 1 мл цельной гепаринизированной крови смешивали с 4 мл среды RPMI-1640 (Sigma, USA), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5мМ HEPES-буфера и 100 мкг/мл гентамицина, т.е. кровь разводили в 5 раз. Подготовленные таким образом образцы крови (по 1 мл) культивировали в круглодонных стерильных пробирках в присутствии липополисахарида (ЛПС, Escherichia coli 0111:B4 (Sigma, США) в конечной концентрации 10 мкг/мл), а также в отсутствие митогенной стимуляции. Культивирование проводили при 37 °С в СО2-инкубаторе в течение 24 ч, после чего отбирали супернатанты и хранили полученные образцы при -20 °С до тестирования. Анализ содержания цитокинов проводили тремя независимыми экспериментальными сериями. Уровень продукции цитокинов в цельной крови пересчитывали индивидуально с учетом абсолютного количества мононуклеарных клеток (МНК) и выражали в пкг/мл/106 МНК. ^ Для математической обработки полученных данных использовалась статистическая компъютерная программа STATISTICA 6.0 for Windows (StatSoft, USA). ^ Характеристика иммунной системы и кроветворения у больных РМЖ после лучевой терапии и хирургического лечения до начала ХТ Анализ средних значений показателей эритропоэза у больных РМЖ после хирургического лечения выявил по сравнению со здоровыми донорами достоверное снижение содержания эритроцитов и гемоглобина (табл. 1). Лабораторные признаки анемии (эритроциты <3,9 х1012/л и гемоглобин <120 г/л) у больных РМЖ наблюдались с частотой 40% и 26% соответственно. У больных также отмечалось достоверное снижение абсолютного содержания лимфоцитов при отсутствии значимых изменений уровня лейкоцитов, нейтрофилов и моноцитов. Соответственно, лимфопения (<1.2 х109/л) регистрировалась у большинства пациентов - в 68% случаев, тогда как лейкопения (<4.0 х109/л) выявлялась только в 26% случаев, а нейтропения (<2.0 х109/л) еще реже – в 8% случаев. Выявленная лимфопения обуславливалась снижением абсолютного количества всех исследуемых субпопуляций лимфоцитов: CD3+, CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов, CD19+ В-лимфоцитов, CD16+ НК-клеток (табл.2). У больных регистрировалось снижение относительного количества CD4+ Т-лимфоцитов и увеличение CD8+ Т-клеток, что приводило к уменьшению ИРИ. Также отмечался дефицит относительного содержания в крови CD19+ В-лимфоцитов. При анализе моноцитарного звена иммунитета у больных отмечалось достоверное снижение количества моноцитов, способных фагоцитировать FITS-меченные латексные частицы, и недостоверное - ПАМ, исследуемого по продукции метаболитов кислорода (H2O2) в ответ на стимуляцию зимозаном. Снижение фагоцитарной активности было также характерно и для нейтрофилов, тем не менее, данная фракция клеток сохраняла способность к продукции Н2О2 в тимулированных культурах, среднее значение ПАН регистрировалось даже выше уровня доноров. Таблица 1 Сравнительная характеристика гематологических показателей у больных РМЖ и здоровых доноров, M ± s.e.
Примечание. ** - Рu<0,01 - достоверность различий между больными РМЖ и донорами; достоверность различий 1) между больными после хир.лечения и через 1 месяц после ХТ, 2) больными через 1 месяц и 3 месяца после ХТ, 3) больными ИТ /+/ и ИТ /-/ (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). Таблица 2 Сравнительная характеристика показателей иммунитета у больных РМЖ и здоровых доноров, M ± s.e.
Примечание. ** - Рu<0,01 - достоверность различий между больными РМЖ и донорами; достоверность различий 1) между больными после хир.лечения и через 1 месяц после ХТ, 2) больными через 1 месяц и 3 месяца после ХТ (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). Таблица 3 Сравнительная характеристика спонтанной и ЛПС-стимулированной продукции цитокинов (пкг/мл/106МНК) клетками крови больных РМЖ и здоровых доноров.
Продолжение табл. 3
Примечание. * - pU < 0,05; ** - pU < 0,01 - достоверность различий по сравнению с донорами; ^ - pU < 0,05; ^^ - pU < 0,01 – достоверность различий 1) между больными после хир.лечения и через 1 месяц после ХТ, 2) больными через 1 месяц и 3 месяца после ХТ, 3) больными ИТ /+/ и ИТ /-/ (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). Лабораторные признаки иммунодефицитного состояния были выявлены у подавляющего большинства больных РМЖ – в 84% случаев (42/50). Среди них комбинированные нарушения, затрагивающие два и более звена иммунитета, регистрировались более чем у половины больных - в 66% случаев, в то время как изолированные расстройства с поражением одного звена иммунитета встречались в 34% случаев. При этом в структуре иммунных нарушений изменения Т-клеточного и моноцитарного звеньев регистрировались значительно чаще (89% и 79%), чем изменения нейтрофилов и В-клеток (31% и 29%). Результаты исследования продукции цитокинов показывают, что даже в условиях спонтанного культивирования клетки цельной крови больных РМЖ активно секретируют хемокины и ростовые факторы. По сравнению с донорами у больных РМЖ после хирургического лечения регистрируется (табл. 3) достоверное увеличение спонтанной продукции факторов гемоиммунопоэза (G-CSF, IL-7) и, особенно, хемокинов (MCP-1, MIP-1β), а также достоверное повышение уровня митоген-индуцированной продукции провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-12, IL-17), ростового фактора IL-7 и хемокинов (MCP-1, MIP-1β). Интенсивность спонтанной и ЛПС-стимулированной продукции IL-13, относящегося к группе Th2/противовоспалительных цитокинов, оказалась существенно снижена. Продукция IL-5 оставалась на уровне нижних пороговых значений. Наблюдаемый дисбаланс цитокинов, очевидно, связан с предшествующей лучевой терапией и хирургическим лечением, вызывающими деструктивно-воспалительные процессы в тканях, и необходимостью восстановления клеточного гомеостаза в периферической крови. ^ После 1-го этапа из исследования по разным причинам выбыли 15 пациенток. В результате на 2-м этапе в исследование были включены 35 пациенток, полностью завершивших комплексное противоопухолевое лечение. Решено было выдержать интервал в 30 дней после окончания ХТ, так как этот период позволяет исключить вероятность гематотоксического действия остаточных концентраций цитостатиков, но в то же время недостаточен для возобновления значимого роста опухоли. При отсутствии воздействия иммуносупрессорных факторов (лекарственных и опухоль-ассоциированных) результаты иммунологического обследования с максимальной достоверностью будут отражать репаративные возможности гемоиммунопоэза пациентов. У больных РМЖ по сравнению со здоровыми донорами наблюдалось достоверное снижение содержания эритроцитов и гемоглобина при сохранении значений на уровне 1-го этапа обследования (табл. 1). В то же время у больных через 1 месяц после ХТ по сравнению с больными до ХТ наблюдалось достоверное снижение количества лейкоцитов (ниже уровня доноров) и нейтрофилов (в пределах нормативных значений), но среднее содержание лимфоцитов значимо не изменилось. Абсолютное количество моноцитов у всех пациентов по-прежнему находилось в пределах нормы. При сравнении частотных показателей периферической крови у пациентов на 2-м и 1-м этапах статистически достоверным оказалось увеличение частоты абсолютной нейтропении (с 8% до 29%). Абсолютная лимфопения регистрировалась у большинства пациентов - в 80% случаев. Лабораторные признаки анемии наблюдались почти с одинаковой частотой до и после ПХТ. У больных РМЖ через 1 месяц после ХТ абсолютные значения всех определяемых по CD-маркерам популяций клеток по-прежнему были достоверно снижены (табл. 2). По сравнению с 1-м этапом исследования отмечалось нарастание количественного дефицита всех субпопуляций Т-лимфоцитов, которое было статистически значимым в отношении абсолютного содержания CD8+ и относительного содержания CD3+ Т-клеток. Дальнейшее уменьшение абсолютного количества CD3+ и CD4+ Т-лимфоцитов проявлялось только в виде тенденции. Снижение ИРИ сохранялось и после ХТ. При оценке функциональной активности Т-клеточного звена иммунитета, как и до ХТ, наблюдалось достоверное уменьшение ИИМ, что указывало на повышенную продукцию Т-лимфоцитами факторов, ингибирующих миграцию лейкоцитов. При анализе моноцитарного звена иммунитета у больных сохранялось снижение фагоцитарной активности моноцитов и достоверно уменьшался ПАМ, который до ХТ оставался сохранным. Изменения функциональной активности нейтрофилов через месяц после завершения ХТ имели такой же характер, что и на этапе 1-го иммунологического обследования.  Рис. 1. Структура иммунодефицита (ИД) у больных РМЖ (%) В целом лабораторные признаки иммунодефицитного состояния на 2-м этапе исследования определялись у 89% пациенток. При этом структура иммунодефицита также сохранялась в основном прежней (рис.1): комбинированные нарушения - 68%, изолированные нарушения - 32%, дефицит по Т-клеточному звену иммунитета – 68%, по В-клеточному звену – 32%, недостаточность функции моноцитов/макрофагов – 77%, функции нейтрофилов – 19%. Анализ продукции цитокинов клетками крови (табл. 3), показал, что через 1 месяц после окончания ХТ у больных сохранялось достоверное повышение спонтанной продукции IL-7 и отмечалось дальнейшее нарастание спонтанной секреции G-CSF (5-кратное относительно уровня до ХТ). При этом возрастание продукции G-CSF, по-видимому, связано с нейтропенией, которая практически не регистрировалась до химиотерапии и выявлялась у трети больных после ХТ. С другой стороны, учитывая широкий потенциал иммуносупрессивной активности G-CSF, увеличение данного цитокина на фоне ХТ в отсутствии динамики Th2-цитокинов может указывать, что ХТ-индуцированная иммуносупрессия обусловлена не столько смещением баланса в сторону Th2-цитокинов, сколько усилением продукции G-CSF. После ХТ высокая продукция MIP-1β сохранялась. Однако спонтанная секреция MCP-1 достоверно снижалась практически до уровня донорских значений. Причем дополнительная стимуляция ЛПС не приводила к увеличению продукции хемокинов. Анализ цитокинов, регулирующих воспалительный процесс, показал, что через месяц после ХТ в целом баланс смещался в сторону ослабления провоспалительной активности клеток крови (значимое снижение спонтанной продукции IL-1β и IL-17 ниже уровня доноров, снижение ЛПС-стимулированной продукции IL-12 до уровня доноров). Значения продукции IL-13 и IL-5 после ХТ не менялись. После окончания ХТ у 17 из 35 пациентов (49%) наблюдался инфекционный синдром: Herpes zoster - 2 человека, Herpes simplex (первый эпизод или рецидив после длительной ремиссии) – 2 человека, обострение хронического бронхита – 2 человека, обострение хронического аднексита – 1 человек, острая инфекция ЛОР-органов (тонзиллит, гайморит, ОРВИ) -5 человек, абсцесс послеоперационного рубца - 2 человека, постинъекционный тромбофлебит – 2 человека, стоматит – 1 человек. При сравнении иммунологических и гематологических параметров в подгруппах больных оппозитных по инфекционному синдрому выявлены достоверные различия только по уровню митоген-индуцированной продукции цитокинов – у пациентов с развитием инфекционных осложнений отмечались выше уровни провоспалительных цитокинов IL-1β и IL-17, Th2-цитокина IL-13, фактора гемопоэза GCSF и хемокина MCP. Сформированные подгруппы не различались значимо по возрасту и распределению больных по стадии РМЖ. 46% пациентов (16 из 35 человек) во время ХТ дополнительно к основному протоколу лечения получали иммунотерапию по рекомендациям химиотерапевта – препарат ДНК деринат (внутримышечно №5-10). Он, как и большинство препаратов нуклеиновых кислот, обладает регенераторным и репаративным действием, стимулирует лейкопоэз. Через 1 месяц после завершения ХТ было проведено сравнение клинико-лабораторных параметров в подгруппах больных, получавших и не получавших деринат. Сформированные подгруппы были клинически однородны. Анализ частоты развития инфекционного синдрома показал, что в подгруппе с иммунотерапией инфекционные осложнения развивались в 2 раза чаще - в 69% случаев (11/16), чем в оппозитной группе - в 32% случаев (6/19), выявленные различия были достоверными по методу Фишера. После применения препарата ДНК наблюдалась тенденция к увеличению количества пациентов с лейкопенией, лимфопенией и нейтропенией (табл. 4). У пациентов, получавших иммунотерапию во время ХТ, достоверно ниже наблюдалось среднее содержание эритроцитов и выше - продукция противовоспалительного цитокина IL-13, хотя в обеих группах значения последнего регистрировались достоверно ниже уровня доноров. Таблица 4 Сравнительная лабораторная характеристика больных РМЖ через 1 месяц после ХТ с наличием/отсутствием иммунотерапии (деринат) во время ХТ, M ± s.e.
Примечание. ТМФ – точный метод Фишера; рu – U-критерий Вилкоксона-Манна Уитни. ^ Анализ показателей гемограммы показал, что через 3 месяца после ХТ у больных наблюдалось увеличение количества лейкоцитов (до нормативных значений) и достоверное повышение абсолютного количества лимфоцитов (ниже уровня доноров) по сравнению с результатами обследования через 1 месяц после ХТ (табл. 1). Абсолютное количество нейтрофилов и моноцитов, сохранялось в пределах значений доноров. Анализ показателей эритропоэза у больных РМЖ в исследуемой группе выявил положительную динамику по содержанию гемоглобина, тогда как количество эритроцитов сохранялось ниже уровня доноров - как на предыдущих этапах обследования. При сравнении частотных показателей цитопении у пациентов на 3-м этапе исследования с аналогичными показателями 2-го этапа выявлено достоверное снижение частоты лимфопении (с 80% до 46%), тенденция к снижению частоты лейкопении и анемии. У больных РМЖ через 3 месяца после ХТ при анализе параметров иммунитета достоверное снижение абсолютных значений всех исследуемых популяций клеток сохранялось (табл. 2). Тем не менее, отмечался достоверный прирост абсолютного и относительного содержания В-лимфоцитов. Увеличение абсолютного количества субпопуляций Т-лимфоцитов проявлялось в виде тенденции. Учитывая значимое повышение доли CD8+ Т-лимфоцитов и дальнейшее снижение ИРИ в этот период, можно заключить, что прирост CD8+ Т-клеток опережает прирост CD4+ Т-лимфоцитов. Также наблюдалось достоверное повышение ПЭФ, вероятно, за счет Т-клеток. При анализе моноцитарного звена иммунитета у больных наблюдали сохранение дефицита фагоцитарной активности моноцитов и восстановление до уровня доноров ПАМ, который достоверно снижался через 1 месяц после ХТ. Изменения функциональной активности нейтрофилов через 3 месяца после завершения ХТ имели такой же характер, что на этапах 1-го и 2-го иммунологического обследования - одновременное снижение фагоцитарной активности и усиление метаболической активности (ПАН). Лабораторные признаки иммунодефицитного состояния на 3-м этапе исследования по-прежнему определялись у большинства пациенток - 86%. По сравнению со 2-м этапом исследования наблюдались некоторые изменения структуры иммунодефицита (рис. 1). По В-клеточной недостаточности наблюдалась положительная динамика - количество В-лимфоцитов через 3 месяца после ХТ практически у всех пациентов было в пределах нормативных значений (р=0,004, ТМФ). Но увеличилось относительное количество пациентов с признаками Т-клеточного дефицита, несмотря на отсутствие отрицательной динамики по абсолютному и относительному содержанию Т-лимфоцитов. Анализ продукции цитокинов клетками крови показал, что через 3 месяца после окончания ХТ у больных сохранялся повышенный уровень спонтанной продукции фактора гемоиммунопоэза IL-7 без значимых отличий от значений у пациентов на первых этапах исследования (табл. 3). Уровень IL-7 не увеличивался дополнительно при митогенной стимуляции. В то же время отмечалось достоверное (16-кратное) снижение спонтанной секреции G-CSF относительно результатов через 1 месяц после ПХТ, но способность клеток крови к продукции этого цитокина под воздействием ЛПС сохранялась на высоком уровне (ИВЛПС = 35,8). Т.о. нормализация уровня лейкоцитов и уменьшение выраженности лимфопении сочетались с уменьшением спонтанной продукции фактора гемоиммунопоэза G-CSF. Секреция MCP-1, начав снижаться после ХТ, через 3 месяца достигла уровня донорских значений. Высокая спонтанная продукция MIP-1β сохранялась, но была уже достоверно ниже, чем на 2-м этапе исследования. Причем дополнительная стимуляция ЛПС приводила к увеличению продукции хемокинов, существенно большему, чем у доноров и пациентов на 1-м и 2-м этапах исследования: ИВЛПС (MCP-1) = 45,1, ИВЛПС (MIP-1β) = 4,0. Спонтанная продукция цитокинов с про- и противовоспалительной активностью на 3-м этапе обследования находилась на равномерно низком уровне. Провоспалительные цитокины IL-1β, IL-17 и IL-12 секретировались клетками крови пациентов менее интенсивно, чем клетками доноров, достоверно в случае первых двух. Продукция противовоспалительного цитокина IL-13 регистрировалась достоверно ниже уровня доноров, как и на других этапах исследования. Секреция IL-5 через 3 месяца после ХТ наблюдалась на нижнем пороговом уровне, как и у доноров и у больных на протяжении всего исследования. При этом стимуляция митогеном существенно усиливала продукцию провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-17 и IL-12 (ИВЛПС – 60,6; 34,3 и 4,1 соответственно), но не изменяла уровень IL-13 и IL-5. Помимо лабораторных изменений, характерных для пациентов на разных этапах наблюдения, на протяжении всего исследования отмечаются и общие особенности гемоиммунопоэза. На всех трех этапах исследования наблюдается абсолютная лимфопения. В структуре иммунодефицита преобладают комбинированные нарушения с преимущественным поражением Т- и моноцитарного звеньев иммунитета. При этом Т-клеточный дефицит развивается в первую очередь за счет уменьшения содержания Т-лимфоцитов, тогда как их функциональная активность, связанная с продукцией факторов ингибиции миграции лейкоцитов даже нарастает. Дефект в моноцитарном звене напротив обусловлен изменением функциональных показателей при сохранении нормального количества этих клеток. На всех этапах исследования проведенный нами корреляционный анализ выявляет выраженную обратную взаимосвязь между уровнем IL-7 и абсолютным количеством циркулирующих лимфоцитов у больных РМЖ (1-й этап - rS= -0,88; p<0,0001; 2-й этап - rS= -0,80; p<0,001; 3-й этап - rS= -0,87; p<0,0001). Абсолютная лимфопения, снижение ИРИ и увеличение уровня продукции IL-7 на протяжении всего исследования косвенно свидетельствуют о включении механизмов гомеостатической пролиферации. ^ Для оценки результатов проведенной иммунореабилитации (ронколейкин, лейкинферон и тимоген) проводилось сравнение через 3 месяца после окончания ХТ по лабораторным показателям подгрупп пациентов, получавших и не получавших иммунотерапию, а также через 1,5 и 2 года анализировались отдаленные результаты лечения – частота рецидивирования и выживаемость. Подгруппы были однородны по возрасту и стадии заболевания. Средние значения содержания лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов существенно не различалась между подгруппами больных в зависимости от иммунотерапии (табл. 1). У больных РМЖ после иммунореабилитации выявлена нормализация количества эритроцитов и гемоглобина в отличие от пациентов без иммунотерапии, у которых их содержание оставалось сниженным. При сравнении частотных показателей отмечено после применения комбинации иммуномодуляторов значительное уменьшение частоты анемии по содержанию эритроцитов (с 33% до 7%), и в меньшей степени – частоты лейкопении (с 38% до 29%) и нейтропении (с 29% до 14%), однако метод Фишера не выявил достоверности различий по данным параметрам. При сравнении параметров иммунитета через 3 месяца после ХТ у больных РМЖ, получавших и не получавших иммунотерапию по протоколу исследования, статистически достоверных различий не выявлено (табл. 2). Но у пациентов после курса иммунотерапии наблюдалось некоторое снижение функциональной активности фагоцитов - в отличие от оппозитной подгруппы ПАМ определялся достоверно ниже уровня доноров, а ПАН – в пределах значений доноров. В связи с применением иммунотерапии наблюдались незначительные изменения структуры иммунодефицита в виде тенденции (рис. 1). Количество пациентов с комбинированными иммунологическими нарушениями после применения комплекса иммуномодуляторов увеличилось с 59% до 69% и, соответственно, с изолированными нарушениями уменьшилось с 41% до 31%. С меньшей частотой регистрировался Т-клеточный иммунодефицит, но частота встречаемости дефицита функции моноцитов увеличилась. Анализ продукции цитокинов у 9 пациентов, получавших иммунотерапию, и у 5 пациентов без иммунотерапии (табл. 3) не выявил достоверных различий между подгруппами, оппозитными по иммунотерапии. Однако подгруппы пациентов различались по некоторым параметрам относительно нормативных значений. Так, в подгруппе женщин, получавших иммуностимуляторы, митоген-индуцированная продукция IL-1β регистрировалась достоверно сниженной (почти в 40 раз относительно другой подгруппы), а MCP-1, наоборот, повышенной. При оценке ИВЛПС наблюдали, что у больных после иммунотерапии по сравнению с оппозитной подгруппой митоген оказывал значительно меньшее стимулирующее влияние на продукцию цитокинов IL-1β и G-CSF, и большее - на продукцию MCP-1. У 46 пациентов из 50, включенных в исследование, проводилась оценка отдаленных результатов – частоты рецидивирования и выживаемости в сроки 1,5 и 2 года после окончания противоопухолевого лечения. В анализ исходов заболевания не были включены четверо пациентов, которые не завершили ХТ по протоколу настоящего исследования (в связи с развитием осложнений, прогрессией основного заболевания либо по причине отказа от продолжения ХТ). В итоге пациенты были разделены на две подгруппы в зависимости от иммунотерапии после 2-го этапа исследования: 1) ИТ /+/, n=14; 2) ИТ /-/, n=32; При сравнении подгрупп было выявлено, что у больных, получивших курс имуностимуляторов по протоколу исследования, через 1,5 и 2 года с меньшей частотой наблюдались рецидивы РМЖ и летальные исходы в результате прогрессии РМЖ (табл. 5). Однако достоверности этих различий по методу Фишера не выявлено. Таблица 5 Сравнительная характеристика исходов заболевания больных РМЖ в подгруппах в зависимости от проведения иммунотерапии после ПХТ (n)
^
ВЫВОДЫ
^
^
</120> |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям