Стимуляция ангио/миогенеза при сердечно-сосудистой патологии с использованием генной терапии и аутотрансплантации клеток-предшественников 14. 00. 41. Трансплантология и искусственные органы 14. 00. 06. Кардиология
|
|
Скачать 0.55 Mb.
|
 Рисунок 4. Динамика величины дефектов перфузии (ДП) исходно и в различные сроки после операции на нагрузке и в покое больных ДКМП. Для оценки клинической эффективности клеточной кардиомиопластики в зависимости от способа введения аутологичных клеток-предшественников CD133+ проводилась оценка перфузии миокарда в динамике после операции у 6 больных с изолированным интракоронарным способом введения CD133+ (группа 1) и у 4 пациентов при изолированном интрамиокардиальном транскатетерном способе доставки клеточного материала (группа 2). Всего у данной группы пациентов было проанализировано 200 миокардиальных сегментов, из которых леченных – 104, нелеченных – 96. Для анализа эффективности способа введения клеток использовали интегральный показатель прироста накопления РФП к году после операции относительно исходного уровня. В леченных сегментах, при интрамиокардиальном способе введения накопление РФП достоверно увеличивалось на нагрузке в сегментах с умеренным, значительным и выраженным снижением перфузии в среднем на 20% относительно исходного уровня. В сегментах с выраженным нарушением перфузии накопление РФП, хотя достоверно и увеличивалось, но ни в одном сегменте в послеоперационных исследованиях уровень накопления РФП не превышал 50% от максимального. В сегментах с исходно нормальной перфузией достоверных изменений выявлено не было. При интракоронарном способе введения накопление РФП также увеличивалось, но ни в одном сегменте не было выявлено достоверной разницы изменения перфузии ни на нагрузке, ни в покое. Прирост накопления РФП не превышал в среднем 10%. В нелеченных сегментах достоверной и выраженной разницы в показателях накопления РФП, в исходно нормально перфузируемых сегментах и в сегментах с различными типами нарушения перфузии до операции и в зависимости от способа введения CD133+ выявлено не было ни на нагрузке, ни в покое. При анализе показателей систолического утолщения в леченных сегментах исходно и в различные сроки после операции также отмечается более выраженная достоверно положительная динамика при интрамиокардиальном способе введения клеток. В нелеченных сегментах не было обнаружено достоверного изменения показателя систолического утолщения. У пациентов обеих групп отмечается существенное уменьшение площади ДП (%) как на нагрузке так и в покое к 1 году после операции в сравнении с дооперационным. Однако при интрамиокардиальном введении клеток эта тенденция выражена более явно. Качество жизни пациентов ИБС и ДКМП после лечения с помощью аутологичных клеток-предшественников CD133+ достоверно улучшилось по всем шкалам опросника SF – 36. Достоверное улучшение качества жизни наблюдается уже спустя 3 месяца после вмешательства и постепенно возрастает к 1 году в сравнении с исходными значениями. ^ При сравнении результатов ЭхоКГ исследования пациентов до и после введения клеток CD133+ было отмечено достоверно уменьшение размеров ЛЖ (КДО, КСО, КДР и КСР), что сопровождалось улучшением сократительной функции ЛЖ. ^ При применении терапевтического ангиогенеза при ХИНК побочных эффектов после введения стимуляторов ангиогенеза отмечено не было. Уровень мочевины в сыворотке пациентов, получивших «Ангиостимулин», в динамике значимо не отклонялся от нормальных показателей (15-50 мг/%) в течение всего периода наблюдения. Через 1 месяц после введения стимулятора клиническое улучшение состояния нижней конечности отмечалось в 80 % случаев. Заживление трофических язв через 1,5-3 месяца наблюдалось в 3 из 6 случаев, положительная динамика со стороны долго незаживающих послеоперационных ран – также в 3 случаях. Отмечалось уменьшение болевого синдрома у пациентов. При раздельном анализе эффект лечения через 1 месяц более выражен у пациентов 1-ой группы (p<0,05): клиническое улучшение появилось у 90% пациентов 1-ой группы и у 73 % больных 2-ой группы. Если во 2-ой группе клиническое улучшение ограничилось минимальным (+1 по Рутерфорду), то в 1-й в 40 % случаев возникло умеренное улучшение (+2 по Рутерфорду). Через 3 месяца клинический эффект наступил у 100 % пациентов в обеих группах. В 1-й группе умеренное улучшение отмечено у 78 % пациентов, а во 2-й – у 57 %; минимальное в 1-й группе – у 22 % больных, во 2-й – у 43 %. К 6-му месяцу эффект сохраняется у всех пациентов 1-й группы и у 81 % - 2-й группы. Положительная динамика в обеих группах в лучшем случае не превысила «+2» по Рутерфорду (умеренное улучшение), однако, и ухудшения по причинам, связанным с исследованием, отмечено не было. Возврат состояния конечности к исходному установлен в 2 случаях во 2-й группе исследования (19 %) , что обусловлено атроэмболией из аорты. В отдалённом периоде (больше 6 месяцев) обследовано 3 пациента. По причине стабильной положительной динамики со стороны нижних конечностей и отсутствия отрицательной со стороны других артериальных бассейнов им не проводилась дополнительная терапия. У двоих из них наступило клиническое выздоровление (полностью исчезли симптомы ишемии) через 9 месяцев после введения стимулятора ангиогенеза (клетки-предшественники); у одного – достигнутый к 6-му месяцу эффект (умеренное улучшение) сохраняется уже в течение 2 лет. Средний прирост напряжения кислорода через 1 месяц в 1-й группе составил 7,5 мм рт. ст., во 2-й группе – 6,5 (р<0,05 в обеих группах), через 3 месяца в 1-й группе – 14,0 мм рт.ст., во 2-й – 10,4 (р<0,05 в обеих группах по сравнению с исходными данными и данными через 1 месяц), через 6 месяцев в 1-й группе – 16,0 мм рт.ст., во 2-й – 13,0 (р<0,05 в обеих группах по сравнению с исходными данными и данными через 1 месяц и через 3 месяца для 1-й группы). Средний прирост напряжения кислорода в 1-й группе выше на всех этапах наблюдения, но статистическая достоверность получена лишь через 3 месяца (p<0,05). При анализе результатов транскутанного напряжения кислорода в 1-й группе в зависимости от способа введения стимулятора наблюдалось достоверное увеличение показателя Тк РО2. При внутриартериальном введении клеток-предшественников в течение 3 месяцев, при внутримышечном – в течение всего периода наблюдения. Средний прирост Р О2 при внутримышечном введении клеток-предшественников выше на всех этапах наблюдения, но статистической достоверности различий между группами с разными способами введения стимулятора не получено (p>0,05). Для оценки толерантности к физической нагрузке у пациентов с перемежающейся хромотой проводился тредмил-тест. ДББХ и МДХ достоверно увеличиваются в течение всего периода наблюдения: в меньшей степени за первый месяц, в большей – за последующие месяцы. Через 1 месяц ДББХ увеличивается на 0,58 минуты, через 3 месяца ещё на 1,88 минуты, через 6 месяцев – на 3,17 минуты (суммарно за 6 месяцев на 5,63 минуты). МДХ к 6 месяцу возросла на 5,82 минуты. В 2 случаях через 3 месяца и в 4 (44 %) – через 6 месяцев тредмил-тест прекращен через 12 минут (512 метров) по причине его полного выполнения (переход во 2А степень ХИНК). Через 3 месяца после введения стимулятора ангиогенеза появление новых видимых коллатеральных сосудов отмечено у всех ангиографически обследованных пациентов. В среднем увеличение коллатеральной сети в 1-й группе составило +2,28+/-0,75 (p>0,05, n=7), во 2-й – +2,0+/-0,45 (р<0,01, n=11). Установлена прямая достоверная связь между динамикой увеличения коллатеральной сети и изменением клинического статуса конечности (по Рутерфорду), транскутанным напряжением кислорода, средним показателем перфузии. Возраст и исходная тяжесть ишемии конечности достоверно не влияли на увеличение количества коллатеральных сосудов по данным ангиографии. Клиническое улучшение состояния нижних конечностей оказало существенное влияние на качество жизни пациентов. Физическая активность (ФА), показатель влияния болезни на выполнение физических нагрузок, достоверно ниже принятого за норму показателя качества жизни здоровой популяции г. Санкт-Петербург исходно в обеих группах (р<0,05). В динамике наблюдается улучшение данного параметра. В 1-й группе значимо ФА возрастает к 3 месяцу, приближаясь к нормальному значению через 6 месяцев. Во 2-й группе лишь через 6 месяцев установлено значимое увеличение ФА, не достигшей нормального значения (p<0,05), что вероятно обусловлено преклонным возрастом пациентов и большим количеством сопутствующих заболеваний. Интенсивность боли и её влияние на повседневную деятельность, достоверно снижается и, соответственно, увеличивается показатель болевого фактора (БФ) через 3 месяца в обеих группах исследования. Значимого отличия между показателями БФ на различных этапах наблюдения у пациентов 1-й группы и нормальным значением установлено не было. Во 2-й группе значение БФ значительно ниже нормального уровня в течение первых 3 месяцев и приближается к нормальному значению к 6 месяцу. Общее здоровье (ОЗ), на момент заполнения опросника и перспектив лечения достоверно отличалась на начальном этапе в обеих группах от нормального значения. В последующем данный показатель приближается к нормальному даже во 2-ой группе, где отсутствует значимый прирост ОЗ, что подтверждает наличие положительной динамики в лечении. В отличие от показателя ОЗ жизнеспособность (ЖС), сравнима с нормальным значением, а через 6 месяцев в 1-ой группе – превышает его (p<0,05), что объясняется значительным улучшением эмоционального настроя пациентов на фоне улучшения физического состояния. То же можно сказать и о психическом здоровье (ПЗ) пациентов. При исходно значительно сниженном ПЗ у пациентов 1-ой группы по сравнению с нормальным значением (p<0,05), уже в течении первого месяца эмоциональная картина меняется – ПЗ стремится к нормальному. Показатель РПП (влияния эмоционального состояния на жизнедеятельность) достоверно увеличивается у пациентов 2-й группы через 1 месяц, у пациентов 1-й группы – через 3 месяца. Социальная активность ожидаемо возростает, достоверно не отличаясь от нормального значения. Часть пациентов (6 человек – 24 %) изменили планы на будущее: трое снова начали, а трое продолжили работать после длительного перерыва. ^ Значительное число больных ИБС (от 5 до 21% по разным оценкам) имеют противопоказания к реваскуляризации хирургическими и интервенционными методами, либо у них таким способом не удается достичь полной реваскуляризации (de Feyter P., 1992; Mukherjee D. и соавт., 1999) и снять симптоматику стенокардии. В такой ситуации целесообразно рассматривать возможность применения терапевтического ангиогенеза, позволяющего обеспечить полноценный кровоток путем стимуляции формирования новых сосудов (Laham R. и соавт., 2000). Аналогичным образом, заметное количество больных хронической ишемией нижних конечностей (до 5%) страдают от остаточных симптомов после хирургии и традиционной терапии (Baumgartner I. и соавт., 2000). Несомненно, в этой группе больных терапевтический ангиогенез выглядит перспективным дополнением хирургического лечения. Более того, тяжелая сердечная недостаточность – прогрессирующий синдром, характеризующийся необратимой утратой миоцитов, теоретически может быть компенсирован за счет стимуляции регенерации миоцитов, т.е. миогенеза. Первый этап нашего исследования был посвящен созданию генетической конструкции для терапевтической стимуляции ангиогенеза у нуждающихся в этом больных. В качестве преспективных генов-кандидатов были выбраны VEGF165 и bFGF. Полученные на основе pBK-CMV генетические конструкции эффективно воспроизводятся в культуре E. coli, и с высокой степенью чистоты могут быть выделены из клеточного лизата на колонках фирмы Qiagen. Созданная таким образом конструкция позволяет относительно легко нарабатывать значительные (15 – 50 мг за один цикл выделения) количества плазмидной ДНК, пригодной для введения больным. Мы остановились на плазмидной конструкции в качестве стимулятора ангиогенеза основываясь, во-первых, на относительной дешевизне и простоте получения значительного количества препарата, во-вторых, на данных об эффективной экспрессии плазмидной ДНК в мышечной ткани (Tripathy и соавт., 1996), и, в-третьих, из-за опасения осложнений, связанных с применением у больных вирусного вектора (Marshall и соавт., 2003). Последующее исследование токсичности и переносимости препаратов подтвердили безопасность их применения в эксперименте на животных, и в перспективе – для лечения больных. Первично эффективность препарата VEGF165 была проверена в стандартном тесте с матригелем. Продемонстрирована экспрессия кодируемого плазмидой белка VEGF165 в человеческих клетках НЕК 293, а имплантация крысе помещенных в матригель трансфецированных плазмидой клеток приводила к эффективной стимуляции процессов ангиогенеза в коже. Следующим этапом нашего исследования стала проверка эффективности сконструированных препаратов на модели хронической ишемии скелетной мышцы задней конечности крысы. Сравнительное изучение эффективности двух генетических конструкций показало, что через 30 дней после введения в зону ишемии даже минимальной из использованных нами в эксперименте доз (250 мкг/животное) VEGF165 отмечается достоверное по сравнению с контролем увеличение плотности капиллярного русла, в то время как введение даже максимальной в рамках данного исследования дозы bFGF (750 мкг/животное) не оказывает существенного влияния на кровоток в ишемизированной конечности. Ангиогенная эффективность белковых препаратов FGF была продемонстрирована в ряде экспериментов на животных, как при локальном, так и при интракоронарном способах введения (Lazarous D. и соавт., 2000; Rajanayagam M. и соавт., 2000). В то же время результаты клинических испытаний белковых и генетических препаратов FGF далеко не так однозначны (Ruel M. и соавт., 2002; Simons M. и соавт., 2002). На данном этапе наших исследований, мы решили сосредоточиться на клинических испытаниях содержащей VEGF165 плазмиды (препарат «Ангиостимулин»). Поскольку ишемия органа приводит, в том числе к истощению регенеративных возможностей за счет уменьшения числа резидентных стволовых клеток, введения ангиогенных факторов может оказаться недостаточно для полноценного восстановления функции органа. В этой связи привлекательной альтернативой выглядит использование стволовых плюрипотентных клеток. Эндотелиальные клетки-предшественники (ЭКП) представляют собой гетерогенную группу клеток, характеризуемую экспрессией ряда поверхностных маркеров, таких как CD34, CD133 и VEGFR-2 (KDR или Flk-1), способностью накапливать DiI-Ac-LDL и связывать считающиеся специфичными для эндотелия лектины, такие как Ulex europaeus. Маркер стволовых клеток CD34 в меньшем количестве выявляется также на зрелых клетках эндотелия, и поиск более специфичных маркеров привел к обнаружению CD133, с высокой плотностью экспрессируемого на незрелых стволовых клетках, и утрачиваемого в процессе дифференцировки (Handgretinger R. и соавт., 2003). Предполагается, что в популяции ЭПК наличествуют две субпопуляции: более примитивная CD133+/CD34-/VEGFR-2+ и более зрелая CD133+/CD34+/VEGFR-2+. Нашей задачей было более подробно исследовать субпопуляционный состав ЭПК, а также фенотипически и функционально охарактеризовать эти клетки в условиях in vitro и in vivo. Использованный в нашей работе способ выделения позволяет с высокой эффективностью получать очищенный препарат аутологичных стволовых клеток пациента. На выходе с колонки мы получали 1-3 миллиона стволовых клеток. Анализ поверхностного фенотипа выделяемых клеток позволил продемонстрировать наличие в костном мозге обследованных пациентов CD133+/CD34- субпопуляции стволовых клеток, которые в дальнейшем дифференцируются в субпопуляцию, экспрессирующую CD133+/CD34+, и в ходе последующей дифференцировки в соответствующих условиях in vitro приобретают фенотип зрелых эндотелиальных клеток. В то же время, эта субпопуляция CD133+/CD34- ЭКП функционально оказалась более активной, чем теоретически более зрелая субпопуляция ЭКП CD133+/CD34+. В условиях in vitro эта субпопуляция клеток-предшественников после обработки SDF-1 более активно прилипает к обработанной фибронектином поверхности и более эффективно дифференцируется в зрелые эндотелиальные клетки по сравнению с субпопуляцией CD133+/CD34+ клеток. Со времени первого сообщения в научной литературе (Asahara T. и соавт., 1997) было принято считать, что фенотип ЭКП определяется экспрессией на поверхности маркеров CD34 и VEGFR-2. В дальнейшем, обнаружение маркера стволовых клеток CD133 (Peichev M. et al., 2002), экспрессия которого, в отличие от CD34 утрачивается по мере дифференцировки ЭКП в клетки эндотелия, позволило подразделить популяцию ЭКП на субпопуляцию CD133+/CD34+/VEGFR-2+, предположительно состоящую из более ранних клеток-предшественников, и субпопуляцию CD133-/CD34+/VEGFR-2+ клеток, предположительно далее продвинувшуюся по пути дифференцировки эндотелиального ростка (Peichev M. c соавт.). Полученные нами данные указывают на вероятность существования третьей, потенциально более примитивной субпопуляции ЭКП, определяемой экспрессией на поверхности CD133 и VEGFR-2 при отсутствии экспрессии CD34. Этот вывод подкрепляется результатами, полученными Guo Y. и соавт. В своей работе они показали, что в процессе культивирования in vitro CD34-отрицательные стволовые клетки, выделенные из костного мозга мышей, приобретают способность экспрессировать CD34, т.е. CD34- стволовые клетки могут быть предшественниками CD34+ клеток. Аналогичным образом, в нашем исследовании CD133+/CD34- ЭКП из костного мозга человека дифференцировались в CD133+/CD34+ клетки при культивировании in vitro в условиях, способствующих дифференцировке в эндотелиальные клетки. Описанная нами субпопуляция CD133+/CD34- ЭКП отличается от субпопуляции ЭКП, описанной Rehman и соавторами, поскольку последнюю характеризует высокий уровень экспрессии CD14 (95,7%) и низкий уровень экспрессии CD133 (0,16%) на поверхности клеток, в то время как исследованные нами CD133+/CD34- не экспрессируют CD14. Kuci S. и соавторы (Hangretinger R. и соавт., 2003) показали, что получаемая при культивировании in vitro мононуклеаров человеческой крови в присутствии Flt3/Flk2 лиганда и интерлейкина-6 субпопуляция стволовых CD133+ клеток не экспрессирует CD34 и обладает способностью репопулировать костный мозг мышей с двойной мутацией: тяжелым комбинированным иммунодефицитом и диабетом I-го типа. После трансплантации эти клетки приживались на значительно более длительное время, чем свежевыделенные CD34+ клетки. Кроме того, на ограниченном контингенте больных (6 пациентов) было показано, что трансплантация CD133+ клеток ведет к улучшению функционирования миокарда в постинфарктный период (Stamm C. et al.,2003). Наблюдение за пересаженными бестимусным мышам CD133+ клетками-предшественниками из пуповинной крови человека показало, что они участвуют в формировании капиллярной сети в ишемизированной задней конечности, стимулируют процессы неоваскуляризации и способствуют восстановлению ишемизированых тканей задней конечности. Тем не менее, конкретные механизмы, опосредующие миграцию стволовых клеток в ишемизированные ткани, а также регуляция и механизм регенеративного действия CD133+ стволовых клеток требуют дальнейшего, более углубленного экспериментального исследования. Хотелось бы подчеркнуть, что по нашему мнению, субпопуляция CD133+/CD34-/VEGFR-2+ ЭКП костномозгового происхождения играет ключевую роль в регенерации эндотелия и восстановлении поврежденных тканей. Учитывая их высокую регенеративную способность, представляется рациональной трансплантация таких клеток в терапевтических целях. По результатам наших экспериментов, мы предполагаем, что субпопуляция CD133+/CD34-/VEGFR-2+ клеток содержит предшественники CD133+/CD34+/VEGFR-2+ клеток и обладает более высоким по сравнению с последними потенциалом восстановления сосудистого русла. Полученные нами данные расширяют современные представления о гетерогенности популяций ЭКП и могут иметь значение для лечения ишемической болезни сердца и патологии магистральных сосудов. При ИБС в основе всех патологических процессов лежит, как правило, постепенное прогрессирование артериальной недостаточности с нарушением периферической макрогемодинамики в результате развития стенотических и облитерирующих процессов в артериях. Прежде всего, это касается микроциркуляторных расстройств, которые развиваются вторично из-за низкого перфузионного давления (Савельев В.С. и соавт., 1997). Отмечается поражение капилляров, питающих мышечные волокна конечностей, дегенеративные изменения эндотелия в них и агрегация форменных элементов крови. Поэтому клиника тяжелой ишемии определяется как микроциркуляторными нарушениями, так и изменениями гемореологическими. Несостоятельность капиллярного кровообращения является одним из ведущих факторов в развитии грубых трофических нарушений у пациентов с декомпенсацией каппилярного кровотока (Казаков Ю.И. и соавт., 1997). Следует отметить, что даже при идеально выполненной операции микроциркуляция в конечности не нормализуется в течение 2-3 лет после операции и ухудшается из-за продолжающегося прогрессирования основного патологического процесса. Поэтому все пациенты после операции нуждаются в продолжении консервативной терапии, независимо от исхода хирургического лечения (в том числе по причине сопутствующего поражения других артериальных бассейнов). Больным же с неоперабельным поражением дистального артериального русла нижних конечностей, слабым развитием коллатеральных путей кровотока и, соответственно, минимальным клиническим улучшением и при отсутствии динамики после операции (по результатам нашего исследования всего в 15 % случаев) помимо принятого объёма консервативной терапии требуется более интенсивное воздействие на коллатеральное русло глубокой бедренной и подколенной артерий. При клиническом применении генных технологий (плазмидной конструкции VEGF165) для лечения хронической критической ишемии нижних конечностей (терапевтическая доза препарата составляет 1000 мкг (Isner J. И соавт., 1999) различной этиологии (атеросклероз и облитерирующий тромбангиит) по данным литературы уже через 1 месяц после введения препарата получен статистически достоверный положительный результат. Максимальный терапевтический эффект отмечен к третьему месяцу. Сходная динамика установлена и нами. У большей части пациентов (до 71 %) полностью прекратились или уменьшились боли покоя (до 86 % по данным литературы), у 4 из 5 пациентов зажили или значительно уменьшились трофические язвы (57-67 % по данным литературы), на 10,4-13 мм рт.ст. увеличилось транскутанное напряжение кислорода, показатели перфузии конечности по данным лазерной допплеровской флоуметрии, в среднем на 0,1 – индекс лодыжечного давления (по данным литературы на 0,15-0,19), на 1,88 минуты – длительности безболевой ходьбы (на 1,3 минуты по данным литературы); возросло количество новообразовавшихся видимых коллатеральных сосудов на уровне колена, голени и стопы по данным ангиографического исследования – средний прирост составил +2,0+/-0,45 (по разным данным литературы в среднем +1,3+/-0,04). В той или иной степени к 3 месяцу клиническое улучшение отмечается у всех пациентов (90% пациентов по данным литературы), при этом умеренное улучшение по шкале Рутерфорда – в 57 % случаев (50% по данным литературы (Baumgartner I. и соавт., 1998). ВЫВОДЫ
^ Исходя из результатов проведенных исследований представляется целесообразным применение внутримышечного введения генного препарата VEGF165 (ангиостимулина) при ишемии миокарда и хронической ишемии нижних конечностей (с учетом критериев включения и исключения пациентов). Использование аутологичных костномозговых клеток-предшественников CD133+ можно рекомендовать для лечения сердечной недостаточности в сочетании с хирургическими методами, при этом наиболее эффективным является метод изолированного интрамиокардиального введения. При лечении ХИНК можно рекомендовать как внутриартериальное, так и внутримышечное введение аутологичных клеток-предшественников CD133+ или ангиостимулина (гена VEGF165). ^
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям