Регуляция дифференцировки клеток трансгенными нейротрофическими факторами 03. 00. 25 Гистология, цитология, клеточная биология
|
|
Скачать 0.62 Mb.
|
|
Риc.12 Ко-культивация спинального ганглия новорожденной крысы и нервной ткани эмбриона дрозофилы, экспрессирующей bdnf. Масштаб 50 микрометров ^ Возможность выделения трансгенных нейротрофических факторов из трансфицированных клеток в окружающую среду делает логичным эксперименты по выявлению влияния клеток трансгенных линий дрозофилы на окружающие клетки в условиях трансплантации в мозг млекопитающих. Для этой цели мы использовали трансгенные линии дрозофилы, в геном которых введен ген человека, кодирующий глия-производный нейротрофический фактор (GDNF). GDNF, член суперсемейства TGF-beta, известен своим трофическим влиянием на развивающиеся дофаминэргические нейроны. В то же время, GDNF оказывает трофическое влияние и на другие популяции нейронов мозга. Целью экспериментов было исследование приживления и развития ксенотрансплантатов нейральных закладок дрозофилы линии С3-1М(gdnf) при их котрансплантации с тканью неокортекса крысиных эмбрионов в мозг взрослых крыс и влияния клеток дрозофилы, экспрессирующих глияпроизводный трофический фактор (GDNF), на приживление и рост контрансплантируемого аллотарнсплантанта. Было исследовано влияние эмбриональных, нервных клеток дрозофилы линии С3-1М(gdnf) на аллотрансплантат мозга крыс при совместной трансплантации. Для этого было выделено две группы крыс. В затылочную кору мозга первой (контрольной) группы крыс трансплантировали неокортекс 15-ти дневных крысиных эмбрионов (Э-15). Животным второй группы в затылочную кору мозга вводили котрансплантат неокортикальной ткани Э-15 с нейральной закладкой дрозофилы С3-1М(gdnf). В качестве маркерного гена в клетках линии С3-1М(gdnf) содержался ген lacZ. Животных первой и второй групп фиксировали через 33 дня после операции. Во всех случаях в мозге крыс первой и второй группы были обнаружены трансплантированные ткани. Трансплантированные клетки дрозофилы во второй группе были легко идентифицируемы. Иммуногистохимическая реакция на lacZ, проведенная на срезах мозга, подтвердила наличие вставки. Методом гибридизации in situ на срезах было установлено, что белок GDNF синтезируется в эмбриональных, нервных клетках дрозофилы при их совместной трансплантации с неокортексом крысиных эмбрионов в мозг взрослых крыс. Нервные клетки дрозофилы при трансплантации в мозг не погибают, и образуют отростки. У первой (контрольной) группы животных трансплантаты были небольших размеров и имели нормальную плотность васкуляризации. Ткань трансплантатов состояла из компартментов нервных клеток, которые объединялись глиальными образованиями. Во второй (опытной) группе крыс ткань котрансплантатов была пронизана множеством сосудов, плотность которых была много выше (более, чем в 2 раза), чем в контроле. Выраженной иммунной реакции не наблюдалось. Котрансплантаты состояли из крупных участков, содержащих нейроны эмбрионального крысиного мозга, связанных глиальными мостами, среди которых располагались группы клеток нейральных закладок дрозофилы. Большинство клеток дрозофилы (5-6 мкм в диаметре), красящихся на lacZ, были вполне жизнеспособны, хотя часть проявляла признаки дегенерации. К  летки дрозофилы никогда не отделялись от остальных тканей глиальным барьером, а напротив, часто наблюдалось множественное образование отростков между нейронами эмбрионального крысиного мозга и клетками дрозофилы Иммуногистохимическое исследование срезов мозга крыс контрольной группы показало наличие четко выраженного глиального рубца на границе ксенотрансплантата. При исследовании второй – опытной - группы крыс было обнаружено отсутствие глиального рубца на границе ткани реципиента с трансплантатом (рис 13). Наличие клеток дрозофилы в ксенотрансплантате было подтверждено иммуногистохимической реакцией на маркер lacZ, а экспрессия gdnf человека - гибридизацией in situ.Рис 13. Влияние ксенотрансплантата трансгенной (gdnf) эмбриональной нервной ткани дрозофилы на развитие гомотрансплантата в мозге взрослой крысы. Полученные результаты свидетельствуют об успешном развитии котрансплантатов, состоящих из эмбриональных клеток неокортекса крыс и нейральных закладок дрозофилы, экспрессирующих GDNF, при их пересадке в мозг взрослых млекопитающих. Морфологическое изучение показало, что в случаях котрансплантации наблюдается усиление роста трансплантированных аллогенных неокортикальных тканей. Можно предполагать, что хорошее приживление и нормальный размер трансплантата может быть отражением нейропротективной функции GDNF, в результате чего сохраняется значительная часть клеток, которые погибли бы в результате некроза или путем апоптоза. Котрансплантаты отличались тем, что содержали множество крупных сосудов, не типичных для окружающих трансплантат тканей. Вероято, GDNF может, способствовать усиленному росту сосудов. Наше исследование показало также, что ткани нейральных закладок дрозофилы не отделяются от окружающих крысиных клеток глиальным барьером. Более того, видны тесные сплетения нервных отростков клеток дрозофилы и клеток крысы, свидетельствующие об отсутствии межвидового антагонизма. По морфологическим критериям, значительная часть клеток нейральных закладок дрозофилы сохраняется в жизнеспособном состоянии в течение двух недель, с последующим уменьшением их количества в котрансплантате. Часть аллогенных клеток котрансплантата экспрессируют тирозингидроксилазу при всех исследованных сроках переживания экспериментальных животных - до 1 месяца. Известно, что в эмбриональной коре кошек (Sawada, 2000) и в коре эмбрионов и ранних постнатальных крыс (Chun, 1987) имеется популяция временно существующих дофаминэргических (DA) нейронов, которые отсутствуют у взрослых животных. При этом неизвестно, какие факторы влияют на специфику развития данной популяции кортикальных нейронов. Результаты настоящего исследования позволяют высказать предположение, что одним из факторов, ответственных за судьбу транзиторных DA в неокортексе может быть GDNF. В пользу этого свидетельствовало наличие большого числа DA нейронов в контрольных трансплантатах неокортекса и их отсутствие в котрансплантатах. Вероятно, GDNF в котрансплантатах оказывает регулирующее действие на ход дифференцировки этой популяции нейронов, ускоряя прохождение транзиторной фазы или вообще «снимая» ее. Во взрослой коре этот фактор не экспрессируется (Berger, 1985; Trupp, 1997), и поэтому DA нейроны длительно сохранялись в неокортикальных аллотрансплантатах у животных контрольной группы. Полученный нами препарат трансгенных клеток дрозофилы оказался обладающим выгодной комбинацией влияния нейротрофического фактора млекопитающих и факторов эмбриональных, нервных тканей дрозофилы на приживляемость трансплантатов. Эта комбинация препятствует образованию глиального рубца и улучшает приживляемость трансплантата. Именно блокада образования глиального рубца вокруг трансплантата, по всей вероятности, играет решающую роль в обеспечении лучшей его приживляемости. Очевидно, что эмбриональные, нервные клетки дрозофилы, продуцирующие GDNF человека, блокируют пролиферацию глии и образование глиального рубца. Это влияет, в свою очередь, на приживаемость трансплантата. В отсутствие клеток дрозофилы, экспрессирующих GDNF, трансплантат окружается плотным глиальным рубцом, что создает условия, несовместимые с его выживанием. Выделяемый нейротрофический фактор положительно влияют на приживаемость котрансплантата, стимулируя образование связей между клетками. Количество эмбриональных, нервных клеток дрозофилы в трансплантате постепенно снижается с течением времени. Через один месяц после трансплантации обнаруживаются лишь единичные клетки дрозофилы в районе введения. Вероятно, это связано с тем, что клетки дрозофилы не могут долго существовать при повышенной температуре (37оС). Непродолжительность переживания клеток дрозофилы после трансплантации их в ткани млекопитающих может иметь положительное значение для применения этих клеток в качестве носителя терапевтического фактора, так как при этом ограничивается длительность воздействия препарата и снижается вероятность неоплазии. ^ Как изложено выше, эмбриональные, нервные клетки дрозофилы экспрессирующие нейротрофический фактор. При добавлении к аллотрансплантату эти клетки, блокируют образование рубцовой ткани на границе трансплантат - ткань хозяина. Мы предположили, что в блокировании глиального рубца участвует не только трансгенный фактор, но белки, вырабатываемые непосредственно клетками дрозофилы. Поскольку при температуре тела млекопитающих клетки дрозофилы активно синтезируют белки теплового шока, имеющие важное адаптивное значение, мы предположили, что именно с этими белками связано торможение пролиферации глии и формирования рубцовой ткани. Для подтверждения данного предположения были проведены две серии экспериментов. В первой серии в затылочную область мозга взрослых крыс трансплантировали эмбриональные, нервные клетки Drosophila melanogaster трансгенной линии Oregon, меченой геном бактериальной галактозидазы lacZ. Во второй серии опытов для ксенотрансплантации использовали аналогичный материал, но от мутантной линии ts403, утратившей способность к синтезу главного белка теплового шока Hsp70. Через неделю мозг фиксировали в 4% формальдегиде. Срезы окрашивали на бактериальную галактизидазу (Х-гал) для идентификации клеток дрозофилы, иммуногистохимически на кислый глиальный фибриллярный белок (GFAP) для выявления глиальных клеток и рубцовой ткани и на индуцируемый главный белок теплового шока для обнаружения соответствующего продукта - Hsp70. Ксенотрансплантаты были идентифицированы в обеих сериях по Х-гал реакции. и с помощью обычной гистологической окраски. Клетки ксенотрансплантата линии Oregon активно синтезируют белок теплового шока Hsp70, о чем свидетельствует интенсивная иммуногистохимическая реакция на данный белок Также наблюдалась экстраклеточная позитивная реакция на белок теплового шока дрозофилы, демонстрирующая его секрецию клетками дрозофилы в окружающие ткани. В этой серии опытов глиальный рубец вокруг ксенотрансплантата был значительно меньше, чем во второй серии экспериментов с мутантной линией ts403 иммуногистохимическая реакция ксенотрансплантата на Hsp70 белок была отрицательной. В то же время на границе ксенотрансплантат - ткань хозяина формировался четко выраженный глиальный рубец (рис. 14а, б).  ^ а. Глиальный рубец не формируется на границе ксенотрансплантат клеток линии Oregon - ткань хозяина. Окраска на кислый глиальный фибриллярный белок (GFAP). б. Формирование глиального рубца на границе ксенотрансплантат клеток мутанта ts403 дрозофилы-ткань хозяина. Окраска на GFAP. в. Клетки мутанта ts403 в ксенотрансплантате (стрелка). Окраска крезилвиолетом. Масштаб 10 микрометров Полученные результаты указывают на возможную роль белка теплового шока Hsp70 в снижении образования глиального рубца вокруг ксенотрансплантата. По всей вероятности этот процесс играет значимую роль в обеспечении лучшей приживаемости аллотрансплантата в том случае, если он пересаживается в комбинации с ксенотрансплантатом эмбриональных, нервных клеток дрозофилы. Известно, что белок Hsp70 способен вызывать деградацию и выведение из клетки измененных белков, а также “активировать” митохондрии и препятствовать апоптозу. В связи с этим его благоприятный эффект, выявленный в наших экспериментах, не является случайным. Таким образом, экспрессия белка Hsp70 в трансплантируемых клетках ведет к уменьшению посттравматического глиофибриллярного рубца. 6. Использование промоторно-регуляторной (п/р) области гена белка теплового шока дрозофилы (Hsp70), в качестве регуляторного элемента при введении чужеродных генов в клетки млекопитающих. Широкое распространение при лечении различных заболеваний приобретают методы клеточной и генной терапии с использованием стволовых клеток, которые обладают большим потенциалом к развитию в различных направлениях. Существенное значение при этом имеет разработка способов повышения их жизнеспособности и управления путями их специализации при операциях трансплантации. Для этого необходим поиск генетических регуляторных элементов, способных трансформировать стволовые клетки в направлении, нужном для успешного лечения. Нами предлагаются регуляторные элементы генома дрозофилы, которые имеют определенные преимущества перед ретровирусными элементами в силу большей безопасности для терапевтического применения. В случае удачного подбора таких элементов появляется возможность повышения эффективности генной и клеточной терапии при лечении многих заболеваний, требующих использования метода трансплантации тканей. Результаты опытов, показали, что нейрогены, введенные в геном дрозофилы, будучи соединенными с п/р областью гена hsp70 дрозофилы активируются под влиянием теплового шока. Они автоматически активируются также в ксенотрансплантатах эмбриональной, нервной ткани дрозофилы в мозгу взрослой крысы. Этот факт говорит о возможности использования п/р области гена hsp70 дрозофилы для трансформации нужным генетическим материалом клеток млекопитающих и человека, подлежащих трансплантации пациентам. Температура тела человека должна быть опознана промотором дрозофилы как хит-шоковая и соответственно может обусловить активацию соединенного с ним гена. Для исследования функционирования этой п/р области в качестве управляющего элемента трансгенеза в клетках млекопитающих были созданы две конструкции. Одна, из них, содержала ген флюоресцентного белка Cyan находящийся под промотором CMV, другая содержала аналогичный ген под управлением п/р области гена hsp70 дрозофилы. Обе конструкции были приготовлены на основе вектора pcDNA 3,1+ . В работе использовали эмбриональные стволовые (ЭС) клетки мыши линии R1, полученные от доктора Наги (A.Nagy, Mount Sinai Hospital, Toronto, Canada). Эти клетки были выделены из бластоцист мышей линии (129/Sv~o 129/SvJ) F1, имеющих окраску агути. Трансфекцию ЭС клеток R1 осуществляли с помощью электропорации. Клетки R1, трансфицированные плазмидой pSV2neo, служили контролем. В результате получили две культуры одна из которых, должна была содержать Cyan-ген под промотором гена цитомегаловируса человека (PCMV), другая – аналогичный ген под контролем п/р области гена hsp70 дрозофилы. С помощью Нозерн блот-гибридизационного анализа было показано, что в клетках первой культуры синтезируется мРНК для цветного белка и, следовательно, соответствующий трансген активируется. При исследовании трансформированных культур ЭСК на флюоресцентном микроскопе было обнаружено, что клетки, которые трансформированы геном CFP под промотором CMV, светятся голубым светом, что свидетельствует о синтезе белка в этих клетках (рис. 15б). Клетки, трансфицированные геном ^ 70 дрозофилы в обычных условиях не светятся. Однако после предварительного температурного шока, полученного прогреванием культуры ЭСК при 42оС в течение 30 минут трансформированные клетки обнаруживали выраженное голубое свечение. В обычной ситуации, при температуре теплового шока фактор транскрипции теплового шока (Hsf) высвобождается из комплекса Hsf/Hsp90 млекопитающих или комплекса Hsf/Hsp83 дрозофилы, образует тример и транспортируется в таком виде в ядро, где взаимодействует с п/р областью гена hsp70 дрозофилы и активирует промотор. В отсутствие предварительного нагревания клетки мыши, содержащие трансген CFP под контролем п/р области гена hsp70 дрозофилы, не могут синтезировать CFP, поскольку комплекс Hsf/Hsp90 мышей, в отличие от комплекса Hsf/Hsp83 дрозофилы, не реагирует на нормальную температуру тела млекопитающих. Воздействие температуры 42оС разрушает комплекс Hsf/Hsp90, и Hsf транспортируется в ядро. Полученные данные свидетельствует о том, что Hsf млекопитающих способен взаимодействовать с п/р областью гена hsp70 дрозофилы и активировать стоящий под ним трансген, но это происходит только после нагревания клеток до температуры теплового шока млекопитающих. Для решения задачи, поставленной в начале этой работы (т.е. включение промотора при температуре 37оС) нами была сделана конструкция, содержащая аналог гена hsp90 млекопитающих ген hsp83, необходимый для активации промотора hsp70 дрозофилы при температуре 37оС. Данная конструкция методом электропорации была введена в культуру, содержащую ранее введенный ген CFP под промотором hsp70 дрозофилы. В результате была получена культура, несущая ген белка теплового шока Hsp83 дрозофилы под CMV-промотором, и ген ^ 70 дрозофилы. Мы наблюдали активное свечение данной культуры при нормальной температуре культивации клеток млекопитающих, т.е. был достигнут тот эффект, которого мы добивались. Р   ис 15. Флуоресценция эмбриональных стволовых клеток мыши линии (129/Sv~o 129/SvJ), инъецированных полученными конструкциями. а-культура клеток под световым микроскопом, b-флюоресценция клеток, трансфицированных конструкцией, несущей ген CFP под промотором CMV, c- флюоресценция клеток, трансфицированных конструкцией, несущей ген CFP под промотором hsp70; инкубация при 370С, d- флюоресценция клеток, трансфицированных конструкцией, несущей ген CFP под промотором hsp70 инкубация при 420 С.Следовательно, регуляторная система дрозофилы, распознающая температуру теплового шока способна функционировать в клетках млекопитающих. Разработанная методика может быть использована для трансфекции стволовых и прогениторных клеток млекопитающих и человека генами нейротрофических факторов и другими генами, полезными для использования в клеточной терапии. Таким образом, была показана возможность создания системы, реагирующей на температуру тела млекопитающих включением нужных трансгенов, полезных при лечении некоторых заболеваний а значит и использования п/р области гена hsp70 дрозофилы для регуляции экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих. ^ На основании данных результатов был получен вектор LP1 для введения чужеродных генов в клетки млекопитающих под контролем нового регулируемого промотора и несущий ген флуоресцентного белка на N-конце для контроля вставки. Данный вектор обладает рядом преимуществ. Во-первых, он содержит промотор невирусной природы, что крайне выгодно при его возможном использовании в терапии. Во-вторых, экспрессию гена, находящегося под контролем данной последовательности, можно регулировать: Данный вектор методом липофекции был введен в линию клеток эмбриональной почки человека НЕК 293. Для исследования функционирования введенной конструкции трансфицированные клетки были обработаны температурой теплового шока 42°С. В клетках человека мы наблюдали экспрессию маркерного гена не через 2-3 часа, как наблюдается у насекомых, а через 24 часа . Свечение было активным и наблюдалось в течение двух суток. При дальнейшем изучении было обнаружено, что активация промотора начинается и при менее травматичной температуре - 39оС. Через сутки было проведено повторное воздействие на культуру высокой температурой. Через 24 часа мы вновь наблюдали свечение. Таким образом, был получен новый вектор для введения чужеродных генов в клетки млекопитающих под контролем регулируемого промотора. Данный вектор можно активизировать температурой 39оС и включение промотора может быть многократным. Это свойство полученной конструкции представляет большой интерес для возможного применения в генно-клеточной терапии. Задержка экспрессии терапевтического трансгена дает время для предварительно прогретых клеток адаптироваться к условиям ткани реципиента и более эффективно наработать трансгенный белок. Н  ами были предприняты попытки введения полученной конструкции в клетки первичных культур клеток человека и животных различного происхождения. В экспериментах использовались различные методы введения конструкции в клетки, такие как липофекция, электропорация или инъекция в ооциты рыб, однако нелинейные клетки плохо принимают любые конструкции, медленно делятся и быстро уходят в дифференцировку. Мы попробовали, что произойдет, если ввести конструкцию в смеси с реактивом для липофекции непосредственно в неостриатум мозга взрослой мыши.^ Р иc.16 Введение вектора LP1 непосредственно в мозг мыши. Масштаб 30 микрометров.В результате мы наблюдали внедрение конструкции с GFP в клетки мозга, локализованные в герминативной области – субвентрикулярной зоне боковых желудочков (рис16). Незначительное количество светящихся клеток, объясняется тем, что в мозгу взрослой мыши деление клеток происходит крайне редко. По всей видимости, конструкция встраивалась только при делении клеток. Таким образом, был обнаружен еще один способ введения конструкций в стромальные клетки, при этом маркироваться будут только те клетки, которые делились в момент инъекции конструкции в мозг. Данный метод имеет еще один положительный момент: Встраивание чужеродного гена происходит в собственные клетки реципиента, имеющие лучшие перспективы длительного переживания и интеграции в мозге, чем трансплантированные экзогенные клетки при алло- или ксено-трансплантации. ^ Необходимо попытаться заменить клетки дрозофилы на клетки более близкие человеку, а также проверить, как будет влиять гиперэкспрессия нейротрофического фактора на окружающие клетки при ко-культивации и позволят ли трансгенные клетки млекопитающих столь интенсивную экспрессию введенного гена. Для анализа влияния гиперэкспрессии нейротрофического фактора на окружающие клетки при кокультивации был использован ген ngf (фактор роста нервов) млекопитающих. Для этих целей нами была получена генно-инженерная конструкция LP19 на основе вектора EGFP-N1, в которой ген фактора роста нервов ngf стоит в одной рамке считывания с геном зеленого флуоресцентного белка gfp под цитомегаловирусным промотором человека (CMV). Контроль наличия вставки был осуществлен методом блот-гибридизации по Саузерну. Секвинирование участка полилинкера показало наличие последовательности гена фактора роста нервов млекопитающих. Для анализа активации гена ngf в клетках данная конструкция была трансфицирована в эмбриональные стволовые клетки мыши линии (129/Sv~o 129/SvJ) методом электропорации. А также конструкция LP19 была трансфицирована в клетки линии НЕК293 (линия эмбриональных клеток почки человека), методом липофекции. (Рис. 17) Наличие экспрессии ngf в линии ES и в НЕК293 проверяли с помощью метода блот-гибридизации по Нозерну (Рис. 18).
Результат нозерн-блот гибридизации для линий ES и HЕК293 оказался различным. У контрольных эмбриональных стволовых клеток мыши была обнаружена экспрессия собственного ngf. В то же время экспрессия этого фактора в трансгенной линии была гораздо более ярко выражена. Нозерн-блот гибридизация показала наличие в этих клетках двух мРНК различной подвижности. Одна из них соответствовала собственно хозяйской, тогда как другая была значительно тяжелее. Данный результат объясняется тем, что трансфицированные клетки кроме РНК нормального фактора содержат РНК химерного белка, в состав которого кроме фактора входит «зеленый хвост», который утяжеляет молекулу. Таким образом, трансгенные клетки содержат помимо собственного NGF также химерный белок NGF. Клетки линии НЕК293 не содержат собственного белка, тогда как трансгенная линия обладала белком ожидаемой подвижности. В результате для дальнейшего исследования была использована трансгенная линия НЕК293. Наличие имуноцитохимической окраска клеток полученной линии антителами к NGF свидетельствует о наличии белка NGF в трансфицированных клетках. (Рис. 19) Таким образом, была получена линия Нек293, продуцирующая трансгенный белок NGF.
^ В дальнейших экспериментах было исследовано влияние выделяемого трансфицированными клетками нейротрофического фактора на другие клетки, находящиеся в соседстве с трансгенными.  ^ Масштаб 100 микрометров.В этих экспериментах была исследована способность клеток линии НЕК293, содержащих трансгены нейротрофических факторов, влиять на нервные клетки млекопитающих тканеспецифической культуры млекопитающих. С этой целью колонии селектированной нами трансгенной по ngf линии НЕК293, ко-культивировали с эмбриональными спинальными ганглиями плода человека (11-я неделя эмбриогенеза). Трансгенные колонии НЕК293 были помечены зеленым белком. В контрольных культурах отростки нервных клеток появляются на 3-й день и позднее. При добавлении в культуру колоний клеток трансгенной линии, содержащей ген ngf мыши, наблюдается бурная реакция клеток спинального ганглия, выражающаяся в интенсивном росте отростков нервных клеток по направлению к колонии трансгенной линии (рис.20).Было обнаружено, что нейротрофичесий фактор, высвобождаясь в среду, стимулирует образование отростков ко-культивируемых нервных клеток. Таким образом, была получена еще одна модель стимуляции образования отростков эмбриональных, нервных клеток в определенном направлении. Она также представляет интерес в связи с частой необходимостью выращивания нервных отростков в заданном направлении. Не являясь чужеродными для тканей человека, клетки линии НЕК293 не исчезают со временем, поэтому данный метод целесообразно использовать, для постоянной экспресии терапевтического фактора. Таким образом, оба протокола имеют право на существование при различных целях. При нейродегенеративных заболеваниях может появиться необходимость, как в том, так и в другом подходе. В одних случаях нужно кратковременно стимулировать дифференцировку клеток трансплантата, в других - восстановить продукцию недостающего белка. ^ В изложенных выше экспериментах было показано позитивное влияние эмбриональных, нервных клеток дрозофилы, продуцирующих GDNF человека, на процессы посттравматического заживления в мозге млекопитающих. В дальнейших экспериментах мы исследовали влияние трансдукции гена этого фактора в линейные клетки человека на трансфицированные клетки и их окружение при кокультивации. Для данной работы была получена конструкция Lр14. Генно-инженерная конструкция для введения человеческого гена gdnf была синтезирована на основе вектора pEGFP-N1, содержащего CMV промотор и маркерный ген флуоресцентного белка GFP (зеленый) на N конце. В этот вектор был встроен человеческий ген gdnf. В результате была получена конструкция размером в 5,3 kb несущая гены gdnf и gfp под общим CMV промотором. Клетки НЕК293 были трансфицированы плазмидой Lр14, содержащей химерный ген gdnf/gfp и ген устойчивости к неомицину (neo). Для получения стабильно трансфицированных клеток проводили селекцию на среде содержащей неомицин (500 мкг/мл). Наблюдалось активное флуоресцентное свечение зеленого белка в культурах. Анализ полученных культур проводили методом Саузерн-блот анализа. Для дальнейшей работы были отобраны клоны, полученные путем независимой трансформации, содержащие химерный ген gdnf/gfp по данным Саузерн-блот анализа и по активности свечения. Для проверки нормальной транскрипции РНК был проведен Нозерн-блот анализ. Анализ показал, что ген gdnf нормально работает в отобранных клонах, полученных после трансфекции плазмидой несущей gdnf и отобранных на G-418.(рис. 21)  К 3 4 5^ (НЕК293), несущих химерный ген gdnf/gfp. К- контроль (исходные клетки). 3-5-выбранные варианты культур, содержащих конструкцию LP 14. Наличие нужной вставки в плазмиде LP14 было также подтверждено с помощью секвинирования. При сравнении полученной последовательности с последовательностями, имеющимися в базе GeneBank, было установлено, что вставка соответствует гену gdnf. Синтез химерного белка GDNF-EGFP клетками, трансфицированными Lр14, был подтвержден при помощи Вестерн-блот гибридизации (рис.22). MW, кДа ^ Р  ис.22 Вестерн-блот гибридизация. 1 – лизат клеток линии НЕК293, трансфицированных pEGFP-N1, 2 – лизат клеток линии НЕК293, трансфицированных Lр14. Цифрами отмечены молекулярные массы белков, входящих в состав маркера.Полоса, присутствующая на дорожке 1 рис.3.6, соответствует молекулярной массе 34,5 кДа, а полосы, представленные на дорожке 2 – молекулярным массам 34,5 и 58,4 кДа. Можно сделать вывод, что в клетках линии НЕК293 экспрессируется собственный GDNF, имеющий молекулярную массу 34,5 кДа, что согласуется с литературными данными (Lin, 1993). Однако крайне незначительное количество собственного белка можно приравнять к следовому. Полоса с массой 58,4 кДа соответствует химерному белку GDNF-EGFP, который экспрессируется с введенной конструкции Lр14. Также можно заключить, что концентрация химерного белка GDNF/GFP превышает концентрацию GDNF. |
1 2 3 4 5
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям