Методические указания устанавливают требования к проведению оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения (гмо)
|
|
Скачать 291.54 Kb.
|
| ПРИЛОЖЕНИЕ 1 УТВЕРЖДЕНО Постановлением Главного Государственного санитарного врача Российской Федерации От «___»_________2007 г. №___ 2.3.2. Пищевые продукты и пищевые добавки Медико-биологическая ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Методические указания МУ 2.3.2.2306-07 I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ 1.1. Методические указания устанавливают требования к проведению оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения (ГМО). 1.2. Требования, изложенные в настоящих Методических указаниях, применяются на этапе государственной регистрации ГМО, впервые поступающих на продовольственный рынок Российской Федерации. 1.3. Методические указания разработаны с целью обеспечения единой, научно- обоснованной системы оценки безопасности ГМО, и учитывают новые методические подходы, как разработанные в России, так и рекомендованные международными организациями (ВОЗ, ФАО и др.). II. Экспертный Анализ и оценка данных, характеризующих заявленные генно-инженерно-модифицированные организмы 2.1. Общая характеристика ГМО включает анализ информации, представленной заявителем: - информации, позволяющей идентифицировать ГМО (вид, сорт, трансформационное событие); - информации об исходном родительском организме (таксономическая характеристика, описание способа размножения и распространения; данные о токсических, аллергенных и других неблагоприятных свойствах); - информации об организмах-донорах вносимых генов (таксономическая характеристика, история использования); - информации о методе генетической модификации (описание метода модификации, структуры вектора, структуры вставки); - информации о ГМО (описание свойств, приобретенных растением в результате модификации, описание структуры генетической конструкции (внесенной или удаленной) и места ее локализации, характеристику экспрессии встроенных генов (экспрессия в процессе онтогенеза растения, интенсивность экспрессии в структурных компонентах растения, и др.), характеристику различий с родительским организмом (способ размножения, способность к перекрестному опылению, устойчивость к стрессовым воздействиям и др.), характеристику генетической и фенотипической стабильности (должны быть представлены данные, полученные в результате исследований нескольких поколений ГМО), характеристику способности к переносу генов в другие организмы (растения, микроорганизмы). 2.2. Оценка композиционной эквивалентности проводится на основании сведений, представленных заявителем, о результатах сравнения химического состава ГМО с химическим составом его традиционного аналога по следующим параметрам: - содержание белка; - аминокислотный состав; - содержание жира; - жирнокислотный состав; - углеводный состав; - содержание витаминов; - содержание макро- и микроэлементов; - содержание биологически активных веществ; - содержание аллергенов; - содержание антропогенных и природных контаминантов (токсичных элементов, микотоксинов, пестицидов, радионуклидов, вредных примесей и др.); - содержание антинутриентов и других веществ, характерных для растительных организмов данного вида. Перечень показателей варьируется в зависимости от свойств изучаемого растительного организма. 2.3. Оценка композиционной эквивалентности ГМО и его традиционного аналога проводится с учетом биологических колебаний значений показателей, характерных для растений данного вида. 2.4. Анализ результатов токсикологических исследований проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих: - результаты оценки безопасности одного или нескольких белков, определяющих проявление заданных признаков у ГМО (молекулярная и биохимическая характеристика белка; наличие или отсутствие гомологии с токсинами белковой природы, а также с белками, обладающими фармакологической, или иной биологической активностью (при использовании баз данных PIR, EMBL, SwissProt, GenBank, и др.); изучение стабильности белка при обработке, хранении, технологической переработке; влияние температуры и рН, возможные модификации и/или образование стабильных белковых фрагментов в результате различных воздействий; устойчивость белка к обработке протеолитическими ферментами в эксперименте in vitro; исследования острой пероральной токсичности белка в эксперименте на грызунах; и др.); - результаты оценки безопасности нативного продукта (данные 90-дневных исследований на грызунах, данные исследований на молодых быстро растущих животных (цыплятах-бройлерах, ягнятах и др.), – в случае если такие исследования проводились; - результаты других токсикологических исследований. 2.5. Анализ результатов аллергологических исследований проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих: - результаты оценки аллергенных свойств одного или нескольких белков, определяющих проявление заданных признаков у ГМО (сравнение с известными аллергенами с использованием баз данных, содержащих информацию о трехмерной структуре и функции известных аллергенов и родственных им белков); определение потенциальной аллергенности белка в иммунохимических исследованиях in vitro с использованием IgE, выделенных из сыворотки крови пациентов, страдающих аллергией; определение устойчивости к воздействию протеолитических ферментов (пепсина); скрининговые исследования с использованием сывороток крови пациентов, страдающих аллергией; дополнительные исследования (в т.ч. in vivo); - результаты аллергологических исследований нативного продукта (сравнение набора аллергенов исследуемого ГМО с набором аллергенов его традиционного аналога и др.), – должны быть проведены в случае, если имеются данные об аллергенных свойствах организма-донора. 2.6. Анализ результатов других исследований (в случае, если такие исследования были выполнены) проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих: - результаты определения пищевой ценности (так как заданные и незаданные эффекты генетической модификации могут являться причиной изменения баланса макро- и микронутриентов, и, следовательно, вести к изменению пищевой ценности продукта); - результаты применения новейших аналитических методов, таких как профильные технологии и др. 2.7. Анализ результатов пострегистрационного мониторинга в стране-заявителе и других странах, осуществляемого с целью выявления незаданных эффектов генетической модификации, которые не могли быть обнаружены на стадии регистрационных исследований, проводится на основании сведений, представленных заявителем. III. методы обнаружения, идентификации и количественного определения генно-инженерно-модифицированных организмов в пищевых продуктах 3.1. Экспертная оценка методов идентификации ГМО направлена на подтверждение их адекватности инструментальной и методической базе, используемой в учреждениях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека для контроля за обращением ГМО и маркировкой пищевых продуктов, содержащих ГМО. 3.2. Экспертная оценка методов обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО в пищевых продуктах проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих: - метод идентификации одного или нескольких трансформационных событий; - метод количественного определения одного или нескольких трансформационных событий; - протоколы проведения анализов; - описание праймеров; - стандартные образцы состава и свойств. IV. МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА генно-инженерно-модифицированных организмов 4.1. Медико-генетическая оценка ГМО включает проверку присутствия одной или нескольких синтетических генетических конструкций методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). 4.2. Медико-генетические исследования проводятся на основании сведений, представленных заявителем, включающих: - описание молекулярной структуры одной или нескольких синтетических генетических конструкций (нуклеотидная последовательность); - метод идентификации и количественного определения одного или нескольких трансформационных событий; - протокол проведения анализа; - описание праймеров; - стандартные образцы состава и свойств. V. Оценка ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИх СВОЙСТВ генно-инженерно-модифицированных организмов 5.1. Перечень и объем исследований по разделу V определяются экспертными (учеными) советами соответствующих аккредитованных испытательных центров Российской Федерации на основании анализа представленных материалов. 5.2. Изучаемые функциональные свойства: - рН водной суспензии; - растворимость; - реологические свойства водных дисперсий; - водоудерживающая и жироудерживающая способность; - критическая концентрация гелеобразования; - эмульсионная стабильность и др. VI. МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов 6.1. Перечень и объем исследований по разделу VI определяются экспертными (учеными) советами соответствующих аккредитованных испытательных центров Российской Федерации на основании анализа представленных материалов. 6.2. Гигиенические исследования ГМО включают определение показателей качества и безопасности: 6.2.1. Перечень показателей безопасности определяется на основании требований СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» для соответствующей группы продуктов. Изучаемые показатели: - содержание токсичных элементов; - содержание микотоксинов; - содержание пестицидов; - содержание радионуклидов; - содержание вредных примесей; - микробиологические показатели; - другие показатели (в случае необходимости). 6.2.2. Перечень показателей качества определяется на основании свойств соответствующего растительного организма, а также анализа представленных заявителем материалов. В случае если заявителем представлены исчерпывающие данные по оценке композиционной эквивалентности ГМО (содержание белка, аминокислотный состав, содержание жира, жирнокислотный состав, углеводный состав, содержание витаминов, макро- и микроэлементов, специфических компонентов, биологически активных веществ, антинутриентов и других веществ, характерных для растений данного вида) исследования могут быть ограничены определением влажности, золы, содержания белка, жира, углеводов, пищевых волокон. 6.2.3. В случае если генетическая модификация направлена на изменение химического состава ГМО, должны быть проведены исследования, подтверждающие заявленные изменения. 6.3. Токсикологические исследования ГМО проводятся в эксперименте на лабораторных животных: 6.3.1. Схема проведения эксперимента Вид животных крысы линии Вистар Пол самцы Возраст 40-50 дней Исходная масса тела 70-80 г Количество животных в группе в начале эксперимента не менее 50 особей в каждой группе Распределение по группам Животных делят на 2 группы: группа «контроль» получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО; группа «опыт» получает рацион с включением исследуемого ГМО Рацион Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных Карантин не менее 7-ми дней Условия содержания Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении. Продолжительность эксперимента 180 дней Забор материала для гематологических, биохимических, морфологических исследований На 30-й и 180-й дни эксперимента Количество животных, взятых на исследование Не менее 10/группу 6.3.2. На протяжении эксперимента животные получают полусинтетический казеиновый рацион (ПКР). Исследуемый ГМО и его традиционный аналог включают в состав корма в максимально возможном количестве, не нарушающем баланс основных пищевых веществ. Замена ингредиентов рациона должна быть проведена с учетом содержания белков, жиров и углеводов во вводимом продукте при соблюдении принципа изокалорийности. Продуктовый набор и химический состав базового ПКР представлен в табл. 1-2. Таблица 1 Состав базового полусинтетического казеинового рациона Ингредиенты Кол-во Белок Жиры Углеводы Калорийность г г г г ккал % Казеин Крахмал маисовый Масло подсолнечное нерафинированное Лярд Солевая смесь* Смесь в/р витаминов** Смесь ж/р витаминов*** Микрокристаллическая целлюлоза 25,0 58,0 5,0 5,0 4,0 1,0 0,1 2,0 20,20 0,58 - - - - - - 0,38 - 4,99 4,98 - - 0,1 - - 50,2 - - - 1,0 - - 84,22 203,12 44,91 44,82 - 4,00 - - 22,1 53,3 11,8 11,8 - 1,0 - - ИТОГО 100,1 20,78 10,45 51,2 381,07 100 * состав солевой смеси представлен в табл. 2 ** 1 г содержит: тиамина (В1) – 0,4 мг, рибофлавина (В2) – 0,6 мг, пиридоксина (В6) – 0,4 мг, никотиновой кислоты – 3,0 мг, пантотената кальция – 1,5 мг, фолиевой кислоты – 0,2 мг, цианкобаламина (В12) – 0,003 мг, викасола – 0,1 мг, L-метионина – 50 мг, глюкозы – до 1 г. *** 0,1 мл содержит: ретинола ацетата 800 МЕ, эргокальциферола – 70 МЕ, -токоферола ацетата – 5 мг, подсолнечного масла – до 0,1 мл. Таблица 2 Состав солевой смеси № Название соли Химическая формула Количество, г 1 Хлористый натрий NaCl 139,3 2 Калий фосфорнокислый, однозамещенный KH2PO4 388,8 3 Магний сернокислый MgSO4 57,4 4 Кальций углекислый CaCO3 380,4 5 Железо сернокислое FeSO4×7H2O 26,4 6 Калий йодистый KI 0,77 7 Марганец сернокислый MnSO4×7H20 4,55 8 Цинк сернокислый ZnSO4×7H2O 0,53 9 Медь сернокислая CuSO4×5H2O 0,48 10 Кобальт хлористый CoCl2×6H2O 0,024 11 Натрий фтористый NaF 0,50 12 Алюмокалиевые квасцы K2SO4Al2(SO4)3×24H2O 0,11 ИТОГО 1000 6.3.3. Исследуемые показатели: 6.3.3.1. Интегральные показатели Изучаемые показатели Периодичность сбора данных Общее состояние животных (внешний вид, двигательная активность, состояние шерстного покрова) каждые 2 дня Поедаемость корма ежедневно Масса тела каждые 7 дней Масса внутренних органов (головной мозг, сердце, селезенка, легкие, тимус, гипофиз, печень, почки, надпочечники, семенники) На 30-й и 180-й дни эксперимента 6.3.3.2. Гематологические показатели Изучаемые показатели Периодичность сбора данных - концентрация гемоглобина; - гематокрит; - общее количество эритроцитов; - средний объем эритроцита (СОЭ); - среднее содержание гемоглобина в эритроците (ССЭ); - средняя концентрация гемоглобина в эритроците (СКЭ); - общее количество тромбоцитов; - общее количество лейкоцитов; - дифференцированный подсчет лейкоцитов (нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, моноциты, базофилы). На 30-й и 180-й дни эксперимента 6.3.3.3. Биохимические показатели 6.3.3.3.1. Общий биохимический анализ крови. Материал для исследований: сыворотка крови. Изучаемые показатели Периодичность сбора данных - аланинаминотрансфераза (АЛТ); - аспартатаминотрансфераза (АСТ); - желчные кислоты; - фосфатаза щелочная; - билирубин общий; - билирубин прямой; - белок общий; - альбумин; - глобулин; - креатинин; - глюкоза; - альфа-амилаза; - липаза; - лактатдегидрогеназа; - общие липиды; - триглицериды; - холестерин; - холинэстераза; - мочевина; - хлориды; - натрий; - фосфор; - калий. На 30-й и 180-й дни эксперимента 6.3.3.3.2. Общий анализ мочи. Материал для исследований: моча. Изучаемые показатели Периодичность сбора данных - суточный диурез; - цвет и прозрачность; - относительная плотность; - pH; - белок; - глюкоза; - креатинин. На 30-й и 180-й дни эксперимента 6.3.3.3.3. Системные биомаркеры 6.3.3.3.3.1. Система антиоксидантной защиты. Изучаемые показатели Периодичность сбора данных Активность ферментов антиоксидантной защиты. Материал для исследований: эритроциты - глутатионредуктаза; - глутатионпероксидаза; - супероксиддисмутаза; - каталаза; На 30-й и 180-й дни эксперимента Содержание продуктов перекисного окисления липидов. Материал для исследований: кровь, печень - малоновый диальдегид. 6.3.3.3.3.2. Система ферментов метаболизма ксенобиотиков. Материал для исследований: печень. Изучаемые показатели Периодичность сбора данных Активность ферментов 1-й и 2-й фазы метаболизма ксенобиотиков - общее содержание цитохрома Р-450; - 7-этоксирезоруфин-О-деэтилаза; - 7-пентоксирезоруфин-О-деэтилаза; - UDP-глюкуронозилтрансфераза; - глутатионтрансфераза. На 30-й и 180-й дни эксперимента 6.3.3.3.3.3. Система регуляции апоптоза. 1) стабильность мембран лизосом. Материал для исследований: печень. Изучаемые показатели Периодичность сбора данных Общая и неседиментируемая активность ферментов лизосом - -галактозидаза; - -глюкуронидаза; - арилсульфатазы А и В. На 30-й и 180-й дни эксперимента 2) другие методы. 6.3.3.4. Морфологические исследования Исследуемые органы Методы исследований - кожа; - головной мозг; - сердце; - аорта; - селезенка; - легкие; - лимфатические узлы; - тимус; - щитовидная железа; - гипофиз; - ЖКТ: желудок, тонкая и толстая кишки; - печень; - поджелудочная железа; - почки; - семенники. На 30-й и 180-й дни эксперимента (плановый забор) 1. Макроскопические исследования 2. Микроскопические исследования: а) обзорные гистологические исследования 3. Морфометрический анализ Вскрытие погибших в течение эксперимента животных (внеплановый забор) 1. Макроскопические исследования 2. Микроскопические исследования (перечень исследуемых органов может быть сокращен до минимально необходимого для установления причины смерти): а) обзорные гистологические исследования. Дополнительные исследования 1. Микроскопические исследования: а) гистохимические исследования; б) иммуногистохимические исследования клеточных популяций и их производных. 2. Электронно-микроскопические исследования. 6.4. Иммунологические исследования ГМО проводятся в эксперименте на мышах линий СВА и С57Bl/6 и включают изучение его иммуномодулирующих и сенсибилизирующих свойств по четырем тестам: 1) действие на гуморальное звено иммунитета – в тесте определения уровня гемагглютининов к эритроцитам барана; 2) действие на клеточное звено иммунитета – в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана; 3) действие как сенсибилизирующего агента – в тесте чувствительности к гистамину; 4) действие на естественную резистентность мышей к Salmonella typhimurium (сальмонеллы мышиного тифа). В табл. 3 представлены сравнительные характеристики мышей линий СВА и С57Bl/6. Таблица 3 Характеристики мышей линий СВА и С57Bl/6 Действующий фактор Линия мышей СВА С57Bl/6 Эритроциты барана высокочувствительны низкочувствительны Гистамин не чувствительны чувствительны Salmonella typhimurium не чувствительны чувствительны 6.4.1. Схема проведения эксперимента Вид животных мыши линий СВА и С57Bl/6 Пол самцы Возраст половозрелые Исходная масса тела 18-20 г Распределение по группам Животных каждой линии делят на 2 группы: группа «контроль» получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО; группа «опыт» получает рацион с включением исследуемого ГМО Рацион* Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных Карантин не менее 7-ми дней Условия содержания Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении. * состав базового рациона приведен в п. 6.3.2. Исследования начинают через 21 день с момента перевода мышей на экспериментальные рационы. В течение эксперимента ведутся наблюдения за поедаемостью корма и общим состоянием животных. 6.4.2. Исследуемые показатели: 1) действие ГМО на гуморальное звено иммунитета. Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 20 животных) и опытной (не менее 20 животных) групп обеих линий внутрибрюшинно вводят 0,5 мл эритроцитов барана (20 млн. клеток/мл). Забор крови для исследований проводится на 7-й, 14-й и 21-й день после введения эритроцитов барана. Сыворотку крови титруют в реакции гемагглютинации общепринятым методом. Полученные данные обрабатывают методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты приводятся в виде Мm, где М – выборочное среднее измеряемых величин, m – стандартная ошибка. 2) действие ГМО на клеточное звено иммунитета. Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 15 животных) и опытной (не менее 15 животных) групп обеих линий подкожно в межлопаточную область вводят 0,5 мл эритроцитов барана (2 млн. клеток/мл). Через пять дней всем мышам в подушечку одной задней лапы вводят разрешающую дозу эритроцитов барана – 0,02 мл (1 млрд. клеток/мышь); в контрлатеральную лапу – 0,02 мл 0,95%-ного раствора хлорида натрия. Местную воспалительную реакцию оценивают через 18-20 часов путем определения массы опытной и контрольной лапок. Интенсивность местной реакции определяют по индексу реакции (ИР). 3) действие ГМО как сенсибилизирующего агента к гистамину. Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 15 животных) и опытной (не менее 15 животных) групп обеих линий внутрибрюшинно вводят гистамин гидрохлорид (2,5 мг/мышь в 0,5 мл физиологического раствора). Реакцию учитывают через 24 часа по проценту гибели мышей. 4) действие ГМО на естественную резистентность мышей к S. typhimurium изучают на модели внутрибрюшинного заражения мышей десятикратно отличающимися дозами S. typhimurium штамм 415. Через 21 день эксперимента мышей контрольной (не менее 30 животных) и опытной (не менее 30 животных) групп обеих линий заражают тремя дозами культуры: 1000, 100, 10 микробных клеток/мышь. После заражения за животными наблюдают в течение 21 дня. Вычисляют ЛД50, а также процент гибели животных по каждой дозе, затем проводят сравнительный анализ результатов. 6.5. Аллергологические исследования ГМО проводятся в эксперименте на лабораторных животных: потенциальную аллергенность оценивают, определяя тяжесть протекания системной анафилаксии и уровня циркулирующих сенсибилизирующих антител (cубклассов IgG1 + IgG4) у крыс, получающих в составе рациона исследуемый ГМО (группа «опыт») и его традиционный аналог (группа «контроль»). Метод основан на количественной сравнительной оценке тяжести реакции системной анафилаксии, возникающей при внутрибрюшинной (в/б) сенсибилизации взрослых крыс пищевым антигеном – овальбумином куриного яйца (ОВА) с последующим внутривенным (в/в) введением сенсибилизированным животным разрешающей дозы того же белка. 6.5.1. Схема проведения эксперимента Вид животных Крысы линии Вистар Пол Самцы Возраст Половозрелые Исходная масса тела 150-180 г Количество животных в группе в начале эксперимента не менее 25 особей в каждой группе Распределение по группам Животных делят на 2 группы: группа «контроль» получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО; группа «опыт» получает рацион с включением исследуемого ГМО Рацион (табл. 4) Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных Рацион не содержит яичного белка. Карантин не менее 7-ми дней Условия содержания Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении. Продолжительность эксперимента 29 дней Забор материала для исследований На 29-й день эксперимента Таблица 4 Стандартный рацион вивария Ингредиент Масса, г на 1 крысу в день Крупа овсяная 2,5 Зерновая смесь 14,0 Хлеб 2 сорт 4,0 Творог 2,0 Рыбная мука 0,5 Мясо 2 категория 4,0 Морковь 8,0 Зелень 8,0 Рыбий жир 0,1 Дрожжи 0,1 NaCl 0,15 Основные нутриенты Белок 3,69 Жир 1,28 Углеводы 12,42 Энергия, ккал 76,0 6.5.2. Исследуемые показатели: На 1-й, 3-й, 5-й день опыта крыс в/б сенсибилизируют ОВА, а на 21-й день эксперимента вводят дополнительную (“бустерную”) дозу антигена, уменьшенную в 10 раз в сравнении с первоначальной. Кормление рационами продолжают до утра 29-го дня эксперимента и затем вводят раствор ОВА в/в, после чего оценивают на протяжении 24 ч тяжесть развивающейся реакции анафилаксии по показателям числа летальных реакций, общего числа судорожных реакций и величины анафилактического индекса. Непосредственно перед введением разрешающей дозы у крыс отбирают 0,1-0,2 мл крови из хвостовой вены для определения уровня специфических антител. Иммуноферментное определение уровней циркулирующих специфических антител к ОВА проводят согласно. Статистическую обработку результатов проводят согласно U-критерию Фишера для долевых показателей, непараметрическим критериям хи-квадрат и Мана-Уитни с использованием пакетов программ Excel и SPSS 11.5. 6.6. Генотоксикологические исследования ГМО проводятся в эксперименте на лабораторных животных. Оценка потенциальной генотоксичности ГМО включает выявление повреждений ДНК и выявление мутагенной активности в эксперименте in vivo. Метод выявления мутагенной активности основан на учете хромосомных аберраций в метафазных клетках пролиферирующих тканей. Регистрация повреждений ДНК предусматривает оценку целостности структуры ДНК методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет). 6.6.1. Схема проведения эксперимента Вид животных мыши линии С57Bl/6 Пол самцы Возраст половозрелые Исходная масса тела 18-20 г Количество животных в группе в начале эксперимента не менее 15 особей в каждой группе Распределение по группам Животных делят на 2 группы: группа «контроль» получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО; группа «опыт» получает рацион с включением исследуемого ГМО Рацион* Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных Карантин не менее 7-ми дней Условия содержания Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении. Продолжительность эксперимента 30 дней Забор материала для исследований На 30-й день эксперимента * состав базового рациона приведен в п. 6.3.2. 6.6.2. Исследуемые показатели: 1) в основе метода выявления мутагенной активности лежит регистрация видимых структурных нарушений хромосом в клетках костного мозга на стадии метафазы. Анализируют 100 метафаз от каждого животного. Учитывают число одиночных и парных фрагментов, хроматидных и хромосомных обменов, ахроматических пробелов (гепов) и разрывов по центромере, число клеток с множественными повреждениями и клеток с полной деструкцией хромосом. Оценку результатов цитогенетического анализа проводят путем сопоставления долей клеток с хромосомными аберрациями в контрольной и опытной группах. 2) регистрация повреждений ДНК предусматривает оценку целостности структуры ДНК методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет). Метод основан на регистрации различной подвижности ДНК и возможных фрагментов ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель, в постоянном электрическом поле. При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий «хвост кометы», параметры которого зависят от степени поврежденности исследуемой ДНК. Общая схема метода включает получение гель-слайдов (подложки), получение микропрепаратов, лизис, щелочную денатурацию, электрофорез, нейтрализацию/фиксацию, окрашивание и микроскопический анализ. Микроскопический анализ проводят на эпифлуоресцентном микроскопе с соответствующими для конкретного красителя фильтрами при увеличении 200х-400х. На каждый микропрепарат анализируют не менее 100 «ДНК-комет». Анализ «ДНК-комет» может проводиться визуально или с помощью программно-аппаратного комплекса. 6.7. Исследования репродуктивной токсичности ГМО проводятся в эксперименте на лабораторных животных и включают: 1) изучение влияния на генеративную функцию; 2) изучение эмбриотоксического и тератогенного действий, регистрируемых в пренатальном и постнатальном периодах развития. 6.7.1. Схема проведения эксперимента Вид животных крысы линии Вистар Пол самцы, самки Возраст 40-50 дней Исходная масса тела 70-80 г Количество животных в группе в начале эксперимента не менее 50 особей в каждой группе 30 ♀, 20 ♂ Распределение по группам Животных делят на 2 группы: группа «контроль» получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО; группа «опыт» получает рацион с включением исследуемого ГМО Рацион* Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных Карантин не менее 7-ми дней Начало опытного вскармливания за 45-50 дней перед первым спариванием Условия содержания Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении. * состав базового рациона приведен в п. 6.3.2. 6.7.2. Исследуемые показатели: 6.7.2.1. Интегральные показатели Изучаемые показатели Периодичность сбора данных Общее состояние животных (внешний вид, двигательная активность, состояние шерстного покрова) каждые 2 дня Поедаемость корма ежедневно Масса тела каждые 7 дней 6.7.2.2. Показатели, характеризующие генеративную функцию Изучаемые показатели Сроки сбора данных Морфологические исследования семенников (определяют индекс сперматогенеза, среднее количество нормальных сперматогоний в каждом канальце, относительное количество канальцев с 12-й стадией мейоза) половозрелые особи Морфологические исследования яичников (примордиальные фолликулы, фолликулы с двумя и более слоями фолликулярных клеток, третичные фолликулы, атретические тела, желтые тела, общее количество генеративных форм) 6.7.2.3. Показатели, характеризующие пренатальное развитие потомства Изучаемые показатели Сроки сбора данных 1. Забой и вскрытие не менее 7 беременных самок на группу 19-20-й день беременности 2. Визуальное исследование матки, плаценты, плодов: выявление живых и мертвых плодов, подсчет количества желтых тел, мест имплантации, количество резорбций по правому и левому рогу матки (с последующим вычислением пред- и постимплантационной эмбриональной смертности) 3. Анализ эмбрионального материала (не менее 5-ти плодов от каждой крысы) 6.7.2.4. Показатели, характеризующие постнатальное развитие потомства Изучаемые показатели Сроки сбора данных 1. Контроль рождения потомства 20-22-й дни беременности 2. Учет величины помета в день родов, подсчет количества живых и мертвых крысят, подсчет особей разного пола, установление внешних уродств, измерение массы тела, определение краниокаудального размера 1-й день жизни 3. Учет показателей физиологического развития крысят: срок отлипания ушных раковин, появление первичного волосяного покрова, прорезывание резцов, открытие глаз, опускание семенников, открытие влагалища; выживаемость потомства. 1-30 дни жизни 4. Измерение массы тела и роста крысят 1, 4, 7, 14, 21 и 25 дни жизни 6.7.3. Отчет по результатам исследований репродуктивной токсичности ГМО должен включать цифровые данные в форме таблиц, содержащих основные сведения, необходимые для суждения о наличии или отсутствии у исследуемого ГМО неблагоприятного действия на внутриутробное развитие и процессы репродукции. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям