Лекция №1
|
|
Скачать 0.82 Mb.
|
|
^
Клеточная стенка дрожжей, например, составляет примерно 15 % массы клетки, ее толщина достигает 400 нм. В состав клеточной стенки входят белково-полисахаридные комплексы и липиды. Примерно 70 % сухой массы клеточной стенки дрожжей составляют полисахариды маннан и глюкан. Полисахариды играют большую роль в сохранении ее механической прочности. Основу клеточной стенки бактерий образует гликопептид муреин. Этот полимер состоит из N – ацетилглюкозамина, N – ацетилмурамовой кислоты и бактериальных липидов особого состава. В состав пептидов клеточной стенки входят L–аланин, D-глутоминовая кислота, мезодиаминопимелиновая кислота или L – лизин и D – аланин. Диаминопимелиновая кислота, лизин, а иногда аргинин и диаминомасляная кислота связывают гетерополимерные цепи. От этих веществ зависит механическая прочность клеточной стенки. Количество белков в клеточной стенке обычно не превышает 13 % общей массы оболочки клеток. Установлено, что часть белков клеточной стенки находится в виде ферментов.  Рис.2. Разрез клетки хлебопекарных дрожжей Sacch. cerevisiae: 1 — клеточная оболочка, 2 — цитоплазма, 3 — цитоплазматическая мембрана, 4 — митохондрия, 5 — пора ядерной мембраны, 6 — ядерная мембрана, 7 — ядро, 8 — эндоплаз-матическая сеть, 9 — вакуоль. Содержание липидов в клеточной стенке дрожжей составляет от 1 до 10 % общего количества биомассы. Фракцию липидов образуют жирные кислоты, фосфолипиды, стеролы. Обычно липидые молекулы ориентированы перпендикулярно по отношению к поверхности клеток и образуют гидрофобные микроканалы, которые играют важную роль в транспорте водонерастворимых веществ, например, в проникновении парафина в клетку. Все микроорганизмы делятся на грамположительные (окрашиваются) или грамотрицательные (не окрашиваются).Существует мнение (по Граму), что компоненты клеточной стенки влияют на окраску препаратов микроорганизмов. Таким образом, химический состав клеточной стенки микроорганизмов различных групп неодинаков. Он изменяется константе Михаэлиса и в зависимости от условий культивирования. Механически и химически клеточная стенка является очень прочным образованием. Она сохраняет форму клетки и поддерживает нужное осмотическое давление в ней, а также принимает участие в транспорте веществ. В научных исследованиях и в биохимической технологии часто необходимо разрушить клеточную стенку. Для этого используют механические дезинтеграторы, ультразвук литические ферменты. Полученную после такой обработки массу, содержащую активные ферменты и не разрушенные структурные элементы клетки, называют клеточным гомогенатом.  Рис. 3. Мозаичная модель клеточной мембраны: маленькие шарики с хвостами — липиды, большие комки неправильной формы — белки. Цитоплазматическая мембрана отделяет протоплазму от клеточной стенки. Она является главным определителем осмотического давления, транспорта веществ и проницаемости в клетке. Поверхность цитоплазматической мембраны складчатая, ее толщина 8 нм. В настоящее время утверждается, что цитоплазматическая мембрана построена из биомолекулярного слоя липидов, в котором свободно плавают белковые молекулы или их комплексы, - это «мозаичная» структура построения цитоплазматической мембраны (рис.3). В бимолекулярном липидном слое благодаря гидрофобному взаимодействию молекул фосфолипидрв полярные части из молекул обращены к внешней поверхности, а гидрофобные части их молекул липидов – к внетренней поверхности слоя. При этом как фосфолипиды, так и молекулы белков находятся в непрерывном движении и взаимодействии. В активном состоянии мембрана имеет жидкую консистенцию, которая зависит от соотношения насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в мембране. Транспорт веществ через цитоплазматическую мембрану осуществляется диффузией веществ по градиенту концентрации. Известно, что клеточная мембрана полупроницаема, поэтому вещества в клетку могут попасть только в том случае, если их концентрация в клетке ниже, чем в окружающей среде. Одновременно в клетке постоянно наблюдается дефицит этих веществ, так как попавшие в клетку вещества сразу же используются в различных ферментативных реакциях. Таким образом, клетка работает как насос. Проницаемость клеток зависит от условий культивирования. Известно, что содержание биотина в питательной среде меняет проницаемость мембран. Это явление используют при получении глутаминовой кислоты, чтобы обеспечить выделение этой синтезированной в клетке кислоты через мембрану в окружающую среду. Внутренняя поверхность цитоплазматической мембраны граничит с цитоплазмой, которая представляет собой коллоидный раствор углеводов, аминокислот, ферментов, минеральных и других веществ в воде. Вязкость цитоплазмы в 800 раз выше вязкости воды. В цитоплазме находятся важнейшие клеточные органоиды – ядро, митохондрии, рибосомы, эндоплазматическая сеть, комплекс Гольджы и др. В них протекают все ферментативные процессы жизни. Эндоплазматическая сеть представляет собой мембранное образование, которое в виде мелких канальцев или пузырьков локализуется в любом месте цитоплазмы. Эндоплазматическая сеть содержит около 50 % липидов. Своей обширной мембранной поверхностью это образование в клеточной цитоплазме как бы изолирует и локализует различные ферментативные системы, которые катализируют синтез липидов, углеводов и других веществ. Комплекс Гольджи – мембранное образование, которое морфологически связано с эндоплазматической сетью. Он участвует в выводе вредных веществ из клетки, обеспечивает транспорт веществ между другими структурными элементами и участвует в образовании новых структурных элементов (например мезосом). Митохондрии – сравнительно большие изогнутые палочковидные структуры, длина которых достигает 1500 нм, а диаметр – 500 нм. Митохондрии покрывает оболочка, которая состоит из двух мембран. Между мембранами находится водянистая жидкость. Как внешняя, так и внутренняя мембраны состоят из белков (80%) и липидов (20%). Доказано, что митохондрии являются автономными структурами в клетке, которые самостоятельно размножаются. Форма и строение митохондрий у различных микроорганизмов неодинаковы. ^ Химический состав клеток. Влияние воды и микроэлементов на жизнь клетки. Связанная и свободная вода. Сухая клеточная масса микроорганизмов составляет 15–25% общей массы. В состав, которой входит до 50% фосфора, много калия, натрия, магния, серы, кальция, хлора и железа. Из микроэлементов в биомассе встречаются марганец, цинк, молибден, кобальт, хром и др. часть сухой биомассы составляют органогенные элементы – углерод (45–50%), кислород (30%), азот (7–14%) и водород (6–8%). Около половины сухой биомассы приходится на белки (30–80%), которые в клетках микроорганизмов находятся главным образом в виде физиологически активных комплексов – нуклеопротеидов, липопротеидов или ферментов. Аминокислотный состав белков практически для всех микроорганизмов известен. (В литературе по составу микроорганизмов имеются данные). Известно, что по составу аминокислот и их содержанию, белки микроорганизмов близки к казеину. Микробная биомасса содержит 5–30% нуклеиновых кислот (РНК и ДНК). Количество воды в клетках значительно превышает содержание всех остальных компонентов, содержание воды в клетках достигает 65–80%. В протоплазме на каждую молекулу белка приходится около 1800 молекул воды, условия культивирования микроорганизмов оказывает непосредственное влияние на содержание воды в клетках. Состав воды в клетках непрерывно обновляется, находящаяся вода в клетках может быть в свободном и в связанном с поверхностью макромолекул виде. Известно, что состав воды в клетках постоянно обновляется. В биологических системах связанной называют воду, которая прочно связана с поверхностью макромолекул биополимеров. Известно, что каждый грамм ДНК связывает 0,45 г. воды, которая образует гидратный слой толщиной 0,3 нм. В микроорганизмах обнаружено около 15–18% связанной воды. Связанная вода значительно отличается по своим свойствам от обычной воды, ее нельзя, например, использовать в качестве растворителя веществ, она не замерзает даже при –700С. (Это обусловлено, возможно, с тем, что молекула воды прочно связана с поверхностью макромолекул биополимеров). Для связанной воды характерна пониженная электропроводность. Термодинамически эта вода мало отличается ото льда. Связанную воду целесообразно рассматривать как структурный элемент, а не как среду. Безусловно, что большую часть находящейся в клетке воды составляет свободная вода, которая является реакционной средой и растворителем веществ. При участии гидролитических ферментов она включается во множество реакций, в результате которых образуются новое вещество с абсолютно новыми свойствами. Т.о., вода является не только средой, в которой протекают все биохимические процессы, но и активным преобразователем веществ. (Эти важные функции она осуществляет благодаря малой молекулярной массе и особенностям строения). Т  .о., обмен веществ в клетках, их рост и размножение может происходить только тогда, когда в ней имеется достаточное количество воды и если клетки погружены в водную среду с растворенными в ней питательными веществами. При отделении клеток от питательной среды, обмен веществ в клетках продолжается до тех пор, пока в межклеточном пространстве имеется вода и в ней растворены питательные вещества. После их использования обмен веществ в клетках продолжается за счет клеточных резервов (углеводы, липиды) в том случае, если сохраняются оптимальные температура и реакция среды. Когда использованы и резервные вещества, начинается автолиз (саморазрушение) клеток, в результате этого белки распадаются на аминокислоты, и углерод аминокислот идет для энергетических нужд.Известно, что при влажности биомассы свыше 20% воды полностью заполняет объем клетки и функционирует как непрерывная среда. При этих условиях в клетке могут свободно протекать все ферментативные процессы (рис. 4). Если биомасса содержит 10–20% влаги (это в основном связанная вода) – при этом клеточные коллоиды переходят в гели и протекание всех ферментативных процессов затруднено. При влажности 5–10% – физические свойства биомассы резко изменяются, в этих условиях возможен обмен между молекулами воды и некоторыми веществами на ближайших участках. Если влажность биомассы меньше 5%, вода в клетке локализуется в пределах определенных структурных элементов. При таком обезвоживании биомассы микробной культуры часть клеток повреждается и инактивируется. Как следует из вышесказанного, при уменьшении содержания воды снижается интенсивность биохимических реакций и, соответственно, интенсивность жизненных процессов. Состояние, в котором все активные жизненные процессы в клетках замедленны или приостановлены, называют анабиозом. Доказано, что сухие или замороженные культуры сохраняют свою жизнеспособность в течение тысячелетий. Лекция №5 Обмен веществ и ферментативные процессы. ^ Ассимиляция – это процесс поглощения веществ из окружающей среды и превращение этих веществ в специфические клеточные компоненты. Диссимиляция – это процесс обратный ассимиляции – разрушение специфических клеточных веществ и выделение их в окружающую среду. Эндотермические процессы ассимиляции питательных веществ, идущие с поглощением энергии, называют анаболическими, а экзотермические процессы диссимиляции, связанные с выделением энергии – катаболическими. Продукты, образующиеся в результате этих процессов, называются метаболитами. А все эти процессы в целом составляют обмен веществ – метаболизм. Синтез клеточных компонентов обеспечивает конструктивный метаболизм, а энергию, необходимую для этих процессов – энергетический метаболизм. Результат клеточной деятельности выражается увеличением размеров клетки и количества образующейся в результате клеточного деления биомассы. В сложных и разнообразных клеточных процессах обмена веществ участвуют многие биокатализаторы – ферменты. Деятельность, как отдельных клеточных структурных элементов, так и всей клетки в целом происходит лишь при участии ферментов, следовательно, все биохимические процессы в клетках являются ферментативными. В зависимости от характера катализируемых реакций ферменты разделяются на шесть основных групп:
Оксидоредуктазы – катализируют перенос атомов водорода или электронов. Участвуют в процессах дыхания и брожения. В результате их деятельности из органических веществ выделяется энергия. Трансферазы – катализируют перенос групп атомов, например, остаток фосфорной кислоты – фосфотрансфераза, аминогруппаминотрансфераза и др. Гидролазы – катализируют гидролиз сложных органических соединений в присутствии воды, например, эстеразы (липазы, пектинэстеразы), карбогидразы (лактаза, инвертаза, амилаза, целлюлоза). Лиазы – катализируют негидролитическое отщепление различных групп от молекул субстрата, например, дикарбоксилазы аминокислот, альдолазы, енолазы. Изомеразы – катализируют превращение органических веществ в их изомеры, например, триозофосфатизомераза катализирует превращение 3-фосфоглицеральдегида в диоксиацетонфосфат. Лигазы (синтетазы) – катализируют процесс соединения двух молекул при одновременном распаде молекул АТФ (рис.5) по схеме: В + АТФ = ВФ + АДФ А + ВФ = АВ + Ф Ферменты – это белки. М   олекулы белков очень большие, поэтому и молекулярная масса ферментов обычно превышает миллион. Часть молекулы белка фермента обладает специфическими свойствами. Под специфичностью понимают способность фермента воздействовать только на определенный субстрат, например, сахароза гидролизует только сахарозу. Свою специфичность ферменты реализуют при помощи каталитического центра. Обычно этот центр образует участок аминокислотной цепи в молекуле ферментного белка строго определенной аминокислотной последовательности и пространственной конфигурации.Часть ферментов представляет собой сложные белки – протеиды, содержащие кроме белковой части (апофермента), еще и небелковую (простетическую) часть – кофермент. Во многих случаях коферментами являются витамины. Коферменты определяют природу катализируемой реакции. По выполняемым функциям коферменты можно разделить на три группы. В первую группу входят коферменты, содержащие никотинамид. Они являются нуклеотидами – (производные пиридина). Никотинамид обеспечивает перенос пары электронов или протонов от субстрата. Таким образом, коферменты первой группы связаны с окислительно-восстановительными ферментами. Во вторую группу входят коферменты, участвующие в переносе групп атомов. Они связаны с трансферазами. В третью группу входят коферменты, катализирующие реакции синтеза, распада и изомеризацию углеродных связей. Эта группа связана действием лиаз, изомераз и лигаз. Отсюда механизм действия ферментов. Каталитически активные белки называют ферментами (от лат. слова fermentum – закваска) или энзимами (от греч. эн – внутри, зим – закваска). Первые сведения о существовании ферментов были получены при изучении процессов брожения. Роль ферментов в жизнедеятельности растений и микроорганизмов огромна. Благодаря каталитической функции разнообразные ферменты обеспечивают быстрое протекание огромного числа химических реакций. Складываясь в единый ансамбль саморегулируемых биохимических процессов, эти реакции преобразования веществ составляют материальную и энергетическую основу непрерывного самообновления белковых тел, т.е. самой сущности жизненных явлений. По И.П.Павлову ферменты – “есть возбудители всех химических превращений”, трансредукторы (датчики) в регуляции обмена веществ. В настоящее время в биологических объектах обнаружено несколько тысяч индивидуальных ферментов, несколько сотен из них выделено и изучено. Известно, что живая клетка может содержать до 1000 различных ферментов, каждый из которых ускоряет индивидуальную химическую реакцию. Биологические катализаторы (ферменты) по ряду признаков резко отличаются от неорганических катализаторов, хотя и те и другие лишь ускоряют достижение равновесия в химических процессах, которые протекают сами по себе, но с очень малыми скоростями. 1) Оксидоредуктазы – ускоряют реакции окисления-восстановления. С  убстрат + акцептор оксидоредуктаза Субстрат + Акцептор восстановлено-окисленныйОкисление протекает как процесс отнятия атомов водорода (электронов) от субстрата, а восстановление – как присоединение атомов водорода (электронов) к акцептору. Если обозначить акцептор буквой А, а субстрат – В, то уравнение реакции окисления-восстановления при участии оксидоредуктаз примет такой вид: В Н2 + А оксидоредуктаза В + АН2Характерной особенностью деятельности оксидоредуктаз в живой клетке является их способность образовывать системы (так называемые цепи окислительно-восстановительных ферментов), в которых осуществляется многоступенчатый перенос атомов водорода или электронов от первичного субстрата к конечному акцептору, которым является, как правило, кислород, так что в результате образуется вода. 2) Трансферазы – ускоряют реакции переноса функциональных групп молекулярных остатков. Трансферазы – это один из наиболее обширных классов, он насчитывает около 500 индивидуальных ферментов. В зависимости от характера переносимых группировок различают фосфотрасферазы, аминотрансферазы, гликозилтрансферазы, ацилтрансферазы, метилтрансферазы, формилтрансферазы. 3) Гидролазы – ускоряют реакции гидролитического распада. R  ^ В зависимости от характера субстрата, подвергающегося гидролизу, гидролазы делят на ряд подклассов, среди которых наиболее важны следующие:
4) Лиазы – ускоряют негидролитические реакции распада органических соединений по связям C-C; C-N; C-O и т.д. При этом замыкаются двойные связи и выделяются такие простейшие продукты как CO2, H2O, NH3 и т.п. Некоторые из этих реакций обратимы, и соответствующие ферменты в подходящих условиях катализируют реакции не только распада, но и синтеза. 5) Изомеразы – ускоряют геометрические или структурные изменения в пределах одной молекулы. Их насчитывается около 90 индивидуальных видов. Изменения могут состоять во внутримолекулярном переносе водорода, фосфатных или ацильных групп, в изменении пространственного расположения атомных группировок, в перемещении двойных связей. Важнейшими изомеразами являются триозофосфатизомераза, фосфоглицерат-фосфомутаза и др. 6) Лигазы (синтетазы). Характерные черты действия ферментов этого класса выявлены совсем недавно. Главная их особенность – сопряженность синтеза с распадом веществ, способность поставлять энергию для осуществления биосинтетического процесса. Лекция №6 Кинетика ферментативных реакций. ^ Под ферментативной кинетикой понимают зависимость скорости реакции, ускоряемой ферментом, от химической природы реагирующих веществ (субстраты, фермент) и условий их взаимодействия (концентрация, температура, pH среды, наличие активаторов и ингибиторов и т.п.). З  ависимость скорости ферментативного процесса от концентрации (рис. 7), температуры, pH среды, наличия активаторов и ингибиторов в значительной мере связано с изменением свойств фермента, как белкового тела.Поэтому мы рассмотрим только вопрос о закономерностях, определяемых природой и концентрацией реагирующих веществ и их изменениями. П  ервой фазой биокаталитического процесса является образование фермент-субстратного комплекса:E + S ES Эта равновесная система может быть охарактеризована соответствующей константой равновесия. Величину, обратную ей называю константой диссоциации фермент-субстратного комплекса или субстратной константой и обозначаю KS.  Субстратная константа зависит от природы субстрата и фермента и отражает степень их сродства. Пример: для сахарозы (фермент, ускоряющий реакцию гидролиза сахарозы) KS = 0,0167 М, т.е. концентрация фермент-субстратного комплекса, превышает концентрацию свободного фермента и субстрата приблизительно в 60 раз. Чем ниже значение KS. тем выше, следовательно, сродство фермента к субстрату. Т  ак как концентрация фермент-субстратного комплекса изменяется вследствие перехода последнего в продукт реакции с регенерацией свободного фермента:ES E + P, то значение субстратной константы kS находят из соотношения констант скоростей прямой (k+1) и обратной (k–1) реакции, т.е.  К указанному выводу можно прийти, приравнивая скорости прямой и обратной реакции, что характерно для равновесного состояния системы: 1 = k+1 [E] [S]; 2 = k–1 [ES], если 1 = 2, то тогда k+1 [E] [S] = k–1 [ES], т.е.  Т.о., субстратная константа диссоциации фермент-субстратного комплекса (kS) характеризует биокаталитический процесс с точки зрения сродства фермента и субстрата и соотношения констант скорости реакции распада и становления фермент-субстратного комплекса. Так как одновременно с диссоциацией фермент-субстратного комплекса на исходные вещества происходят превращения субстрата в продукт и распад комплекса фермент-продукт на составляющие его компоненты: E  + S ES E + P,то для полной характеристики ферментативного процесса введено понятие о константе Михаэлиса (Km), которая представляет отношение констант скоростей всех трех реакций, осуществляющихся в процессе ферментативного катализа:  Константа Михаэлиса (Km) всегда несколько выше по числовому значению, чем kS. Ферменты с субстратом образуют нестабильный промежуточный продукт, при этом получается фермент-субстратный комплекс, который затем распадается на свободный фермент и продукт реакции (рис. 8). Из уравнения видно, что фермент освобождается и может снова принять участие в реакции.  Скорость ферментативной реакции v можно охарактеризовать при помощи уравнения Михаэлиса-Ментенна:  vmax – максимальная скорость реакции; [S] – концентрация субстрата; Km – константа Михаэлиса. Численно константа Km равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной. Km имеет размерность Моль. Встречаются реакции и других типов, например обратимые с одним субстратом. По такому типу идет ферментативное превращение фумаровой кислоты в присутствии фермента фумаразы. Могут происходить необратимые реакции с несколькими субстратами. В водном растворе вещества реагируют только при столкновении. Если бы не было ферментов, эти столкновения были бы крайне редки (1 : 1012). Таким образом, ферменты увеличивают вероятность протекания реакции. Ферменты обладают очень высокой каталитической активностью. Одна молекула фермента за минуту может прореагировать с тысячами и даже миллионами молекул специфического субстрата. В клетках микроорганизмов обнаружено более 1000 различных ферментов. В каждой клетке имеется около 100 тысяч молекул ферментов. Благодаря большой каталитической активности ферментов, каждую реакцию в клетке могут катализировать 50-100 молекул соответствующих ферментов. Так, kS для сахарозы и комплекса сахарозы равно 0,0167 М, а Km составляет 0,0280 М. скорость химической реакции, ускоряемой ферментом (как и скорость обычной химической реакции), измеряют количеством молей субстрата, превращаемых в единицу времени. Принципиально важно, чтобы при этом поддерживались стандартные условия для проявления активности фермента: температура 250С, полное насыщение фермента субстратом, оптимальное значение pH. Скорость ферментативной реакции, измеренной при соблюдении вышеперечисленных условий, обозначают V и называют максимальной скоростью ферментативной реакции. Она определяется концентрацией фермента и константой скорости распада комплекса фермент-продукт: V = k+2 [E] Скорость ферментативной реакции, наблюдаемую при отсутствии полного насыщения фермента субстратом, обозначают . Она в каждый данный момент пропорциональна концентрации фермент-субстратного комплекса: = k+1 [ES]. Т.к.  , а  , т.е.  , то  .Таким образом, наблюдаемая скорость ферментативной реакции зависит от концентрации фермента и субстрата и их сродства. Численно Km равна той концентрации субстрата (в молях на литр), при которой составляет ½ V. За единицу любого фермента принимают то его количество, которое в стандартных условиях катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в минуту. Эта величина (1 мкмоль/мин) является так же единицей активности фермента. Лекция №7 Факторы, влияющие на каталитическую активность ферментов. ^ Каталитическая активность ферментов зависит от температуры, pH среды и присутствия различных веществ. Для действия каждого фермента характерна оптимальная температура, при которой скорость реакции максимальна. Так, α-амилаза культуры Aspergillus oryzae имеет оптимум температуры 50-550С. При повышении температуры от 20 до 600 скорость реакции растет; дальнейшее повышение температуры вызывает денатурацию белка и вместе с тем падение скорости реакции. Влияние температуры на активность ферментов показано на рис. 9. Оптимум температуры большинства используемых в биотехнологии ферментов микроорганизмов лежит в пределах 30-400С. Оптимум действия одних ферментов, например пепсина, наблюдается в кислой среде (pH 2,0), других – в щелочной, а у большинства ферментов – в нейтральной среде. Изменение активности лактатдегидрогеназы культуры B  ac. subtilis в зависимости от pH среды показано на рис. 10.Присутствие некоторых веществ может повышать активность действия ферментов (активаторы), а так же снижать ее (ингибиторы). Активаторами многих ферментов являются цистеин и глуатион, восстанавливающие дисульфидную связь, образуя SH-группы, которые часто определяют ферментативную активность, входя в состав каталитических центров. Ингибиторы ферментов могут быть неспецифическими (например, соли тяжелых металлов, которые при связывании с белками осаждают их из растворов), или специфическими (например, синильная кислота, реагируя с определенными химическими группами ферментов, ингибирует действие железосодержащих дыхательных ферментов). Некоторые вещества в присутствии ферментов конкурируют с субстратом. Обычно это наблюдается при попадании в сферу действия фермента структурных аналогов субстрата. Такие вещества называют субстратными антиметаболитами. Так, сукцинатдегидрогеназа катализирует превращение янтарной кислоты в фумарат. Синтез ферментов, как и всех других белков, идет на рибосомах из свободных аминокислот. Концентрация различных ферментов в клетке не является постоянной величиной. Их количество можно тысячекратно увеличить путем индукции, которую вызывают добавлением в среду субстрата. Внесение мальтозы в среду выращивания хлебопекарных дрожжей вызывает, например, увеличение содержания фермента мальтазы в клетках дрожжей. ^ Ведущую роль в механизме ферментативного катализа играет образование фермент-субстратных комплексов, на существование которых было указано в 1902 г. (Д.Браун).
E  + S I ES II ES` III EP IV E + PE – фермент; S – субстрат; S`– активированный субстрат; P – продукт реакции. Эта схема была разработана в 1903 г. В.Генри, затем в 1913 г. подтверждена Л.Михаэлисом и М.Ментен прямым выделением ES–, ES` и EP-комплексов. О Ацетилхолин- эстераза дним из примеров ферментативного катализа, осуществляемого в соответствии с приведенной схемой, может служить реакция гидролиза ацетилхолина. Это соединение служит медиатором (посредником) при передаче нервных импульсов: в ответ на выделение окончанием нервного волокна ацетилхолина следует ответная реакция возбуждения нервной клетки. Чтобы этот процесс протекал непрерывно, после каждого акта передачи нервного импульса вызвавшая возбуждение порция ацетилхолина (1 — 2 мкг) должна быть полностью разрушена. Это достигается посредством реакции гидролиза ацетилхолина при участии фермента ацетилхолинэстеразы. Гидролиз осуществляется с огромной скоростью: 1 — 2 мкг ацетилхолина за 0,1 — 0,2 мс: С  Н3 — СО — О — СН2 — СН2 — N+(СН3)3 + Н2О С  Н3 –– СООН + НО ––СН2 –– СН2 –– N+(СН3)3Ацетилхолинэстераза — однокомпонентный фермент. В ее активном центре сосредоточены по меньшей мере 4 аминокислотных радикала — глу, сер, гис и тир, обеспечивающие последовательное осуществление перечисленных выше этапов ферментативного катализа. Сначала между ферментом (ацетилхолинэстераза) и субстратом (ацетилхолин) возникает фермент-субстратный комплекс. Он образуется за счет электростатического взаимодействия между отрицательно заряженной ионизированной СООН-группой радикала глу и положительно заряженным атомом N молекулы ацетилхолина (рис. 11, /, Б). После образования фермент-субстратного комплекса вступают в действие остальные аминокислотные радикалы активного центра ацетилхолинэстеразы. В первую очередь замыкается связь между углеродом поляризованной СО-группы ацетильного радикала холина и кислородом ОН-группы остатка сер. Затем возникает водородная связь между кислородом сложноэфирной связи в молекуле ацетилхолина и ОН-группой радикала тир (рис. 11, II, В). Р  асположение молекулы ацетилхолина и радикалов сер и тир в активном центре фермента таково, что образование упомянутых связей ослабляет связь между СО-группой и атомом кислорода сложноэфирной связи в молекуле ацетилхолина (эффект «дыбы»). В результате для ее разрыва требуется гораздо меньше энергии, т. е. энергетический барьер оказывается сниженным вследствие активации молекулы ацетилхолина. Поэтому под влиянием радикала гис, оттягивающего на себя протон от ОН-группы сер, упрочняется сложноэфирная связь между радикалом сер и ацетильной группой с одновременным разрывом сложноэфирной связи в молекуле ацетилхолина и переходом протона от радикала тир к остатку холина (рис. 11, ///, Г). Последний высвобождается из активного центра (рис. 11, IV), а его место занимает молекула воды. Она образует связь с карбонильным кислородом ацетильной группы и кислородом тир (на рис. 11 этот этап не показан), после чего протон от остатка гис возвращается к кислороду ОН-группы сер, а протон воды — к радикалу тир. Одновременно выделяется второй продукт реакции — уксусная кислота и регенерируется свободный активный центр ацетилхолинэстеразы (рис. 11, IV, А), готовый к новому акту катализа.В процессе образования фермент-субстратного комплекса и на дальнейших фазах ферментативного катализа происходят неоднократные изменения третичной структуры фермента, приводящие к последовательному сближению с субстратом и ориентации в пространстве тех активных групп, которые взаимодействуют друг с другом на различных этапах преобразования субстрата. Изменение третичной структуры белка невозможно без участия всей или почти всей полипептидной цепи, образующей белковую молекулу. Следовательно, в каталитическом акте принимает участие по существу вся или почти вся молекула фермента. Лекция №8 Культивирование микроорганизмов. ^ Чтобы культура микроорганизмов могла нормально расти, размножаться и осуществлять биосинтез какого-то вещества, необходимы оптимальные условия окружающей среды: химические факторы – состав и концентрация питательных веществ, присутствие активаторов и ингибиторов; физические факторы – температура, давление, плотность, подвижность среды, освещение, радиация. При нарушении оптимальных границ этих факторов нарушается обмен веществ, прекращается или ограничивается рост и размножение культуры. |
плохо
1
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям