Анализ ряда генов как возможных генов-модификаторов клинической картины муковисцидоза у больных из россии 03. 00. 15. генетика 14. 00. 09. педиатрия
|
|
Скачать 271.73 Kb.
|
|
Представлены сведения о предстоящей защите диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Тимковская Елизавета Ефимовна «Анализ ряда генов как возможных генов-модификаторов клинической картины муковисцидоза у больных из России» 03.00.15 – генетика; 14.00.09 – педиатрия медицинские науки Д 001.016.01 ГУ Медико-генетический НЦ РАМН 115478, Москва, ул. Москворечье, 1, МГНЦ РАМН Тел: 8 (499) 612-86-07 www. med-gen. ru Предполагаемая дата защиты диссертации – 05 ноября 2007 года Представлена на сайте МГНЦ РАМН – 25.07.2007 Работа принята к защите 09.07.2007 На правах рукописи Тимковская Елизавета Ефимовна АНАЛИЗ РЯДА ГЕНОВ КАК ВОЗМОЖНЫХ ГЕНОВ-МОДИФИКАТОРОВ КЛИНИЧЕСКОЙ КАРТИНЫ МУКОВИСЦИДОЗА У БОЛЬНЫХ ИЗ РОССИИ 03.00.15. – генетика 14.00.09. – педиатрия АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва, 2007 Работа выполнена в ГУ Медико-генетический научный центр РАМН ^ кандидат биологических наук, Н.В. Петрова доктор медицинских наук, Н.Ю. Каширская Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор ^ доктор медицинских наук, профессор И.К. Волков Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования Российская медицинская академия последипломного образования Министерства здравоохранения и социального развития РФЗащита диссертации состоится « » 2007 г. в « » часов на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 в ГУ Медико-генетический научный центр РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ Медико-генетический научный центр РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1. Автореферат разослан « » 2007 г. Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор ^ ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Муковисцидоз (МВ)- частое аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное мутацией гена CFTR, характеризующееся клиническим полиморфизмом. Частота МВ в Европе, в среднем, составляет 1:3000 – 1:3500 новорожденных, в России, по разным оценкам, от 1:4900 до 1:12000. [Капранов Н.И. и др., 2004; Радионович А.М. и др., 2005]. Продолжительность жизни, спектр и тяжесть клинических проявлений значительно варьируют среди больных МВ. Значительное количество симптомов МВ и осложнений могут отсутствовать у одних больных на протяжении всей жизни, тогда как у других имеется почти полный их спектр уже в раннем возрасте. К таким проявлениям, например, относятся: мекониальный илеус и синдром дистальной интестинальной обструкции, недостаточность поджелудочной железы, цирроз, сахарный диабет, остеопороз, а также колонизация Pseudomonas aeruginosa, существенно ухудшающая течение и прогноз заболевания. Вариабельность клинического течения лишь отчасти обусловлена CFTR генотипом [CFG-PC, 1993; Ferrari M., Cremonesi L., 1996; Parad R.B. et al., 1999; McKone E.F. et al., 2006]. Различное течение МВ наблюдается у больных, проживающих в равных социальных условиях, наблюдаемых в одних медицинских центрах и имеющих одинаковые мутации в гене CFTR, в частности, у сибсов. Причем конкордантность по тяжести заболевания у монозиготных близнецов, достоверно выше, чем у дизготных [Mekus N. et al., 2000; Vanscoy L.L. et al., 2007]. Это позволяет предполагать влияние на клиническую картину МВ других генетических факторов, отличных от гена CFTR. В связи с широкой вариабельностью клинической картины идентификация генов, вовлеченных в патогенез отдельных синдромов МВ, является важной медико-генетической задачей во всем мире. Изучается ряд генов, белковые продукты которых могут быть вовлечены в патогенетические механизмы МВ [Drumm M.L. et al., 2005; Salvatore F. et al., 2002; Witt H., 2003]. В нашей стране молекулярно-генетические работы, посвященные изучению генов, модифицирующих клинические проявления МВ, немногочисленны и проведены на выборках больных МВ небольшого размера без учета CFTR генотипа [Иващенко Т.Э., Баранов В.С., 2002; Корытина Г.Ф. и др., 2004; Келемберт Н.А. и др., 2005]. Возможность прогнозировать дальнейшее течение заболевания и возникновение определенных осложнений позволит оптимизировать проведение профилактических и лечебных мероприятий и может способствовать созданию новых этиопатогенетических подходов к терапии заболевания, что будет способствовать дальнейшему увеличению продолжительности и повышению качества жизни больных. Цель исследования: изучение возможного модифицирующего влияния генов eNOS, TNFA, LTA, GSTM1, MBL2, HFE на клинические проявления МВ у российских больных. Задачи исследования:
Научная новизна и практическая значимость. Впервые получена оценка частот аллелей и генотипов полиморфных локусов генов еNOS, TNFA, LTA, GSTM1, MBL2, HFE в выборке больных МВ, гомозиготных по мутации F508del, проживающих на территории Российской Федерации. Впервые определены частоты мутаций в первом экзоне, а также аллелей и генотипов промоторного полиморфизма в гене MBL2 у здоровых индивидов, проживающих на территории Европейской части России. Проведен анализ связей данных полиморфных локусов с клиническими проявлениями муковисцидоза и выявлены ассоциации с тяжестью бронхолегочной патологии и рядом осложнений МВ. Впервые у больных МВ, носителей аллеля A VNTR eNOS4, установлено менее благоприятное развитие бронхолегочного процесса и особенности поражения печени. У пациентов, являющихся носителями мутации Н63D в гене HFE, выявлено более тяжелое поражение желудочно-кишечного тракта и более благоприятное течение бронхолегочного процесса. Впервые в России показана ассоциация тяжести бронхолегочного процесса и кишечного синдрома у больных МВ с мутантными аллелями гена MBL2. Результаты работы вносят вклад в общее представление о генах-модификаторах клинической картины МВ. Полученные в работе данные имеют существенное значение для проведения ДНК-диагностики с целью выявления факторов риска развития ряда осложнений МВ. Положения, выносимые на защиту:
Апробация работы. Материалы работы были представлены на VII Национальном Конгрессе по муковисцидозу, 5-6 апреля 2005 года, г.Воронеж; V съезде Российского общества медицинских генетиков, май 2005 года, г.Уфа; VIII Национальном конгрессе по муковисцидозу, июнь 2007 года, г.Ярославль; лабораторных и межлабораторном семинарах ГУ МГНЦ РАМН. Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ. Объем и структура работы. Работа изложена на 163 страницах; состоит из введения, обзора литературы, глав «материалы и методы», «результаты и обсуждение», заключения, выводов, практических рекомендаций, приложений и списка литературы (186 источника, из них 149 зарубежных). Работа проиллюстрирована 20 таблицами и 25 рисунками. ^ Нами было проанализировано 148 историй болезни детей, больных муковисцидозом, гомозиготных по мутации F508del, проживающих в РФ, находившихся на постоянном амбулаторном учете и обследованных в научно-клиническом отделе муковисцидоза (Российский центр муковисидоза) (руководитель - д.м.н. проф. Н.И. Капранов) с 1991 по 2006 год. Анализируемые параметры включали: пол, возраст, место проживания, проводимую терапию, время манифестации кишечного и респираторного синдрома, возраст постановки диагноза, форму заболевания, тяжесть течения, показатели ФВД (ФЖЕЛ и ОФВ1), результаты посева мокроты (наличие высева, его периодичность, существование мукоидной или гладкой формы P.aeruginosa, наличие высева St.aureus, MRSA, Al.xylosoxidans, B.сepacia, St.maltophilia), массо-ростовой индекс (МРИ), поражение гепатобилиарной системы и наличие в анамнезе мекониального илеуса. Анализ полиморфизмов генов-модификаторов проводили в выборке больных МВ, гомозиготных по мутации F508del, и контрольной выборке здоровых индивидов. Выборка здоровых индивидов (289 человек) по полу, возрасту, этнической принадлежности и месту проживания соответствовала выборке анализируемых больных. Выделение геномной ДНК проводили из лейкоцитов венозной крови набором реактивов «Wizard Genomic DNA Purification Kit» фирмы «Promega» (USA) в соответствии с рекомендациями производителя. Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводили методом полимеразной цепной реакции на программируемом термоциклере МС2 производства фирмы “ДНК-технология” (Россия) с использованием ДНК-полимеразы Biotaq (“БиоМастер”) и олигонуклеотидных праймеров, которые синтезировались в НПО «Литех» (Россия). Исследование полиморфизмов изучаемых генов проводили методом ПДРФ-анализа [Monti L.D. et al.,2003; Zhang D.L., 2003; Пай Г.В. и др., 2003; Madsen et al., 1998; Beutler E. et al., 1996]. Результаты оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы Vilber Lourmat (Франция) в УФ-свете. В работе использовались эндонуклеазы производства Fermentas (Литва), «Сибэнзим» (Россия). ^ проводили с использованием параметрической и непараметрической статистики в зависимости от шкал и характера распределения переменных. Для анализа ассоциаций между полиморфными вариантами изучаемых генов и количественными характеристиками течения заболевания использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Расчет данного критерия осуществляли с использованием пакета «Statistica 6.0». Анализ качественных признаков проводили на основе сравнения частот их проявления в исследуемых группах, с последующей попарной проверкой статистической достоверности различий значений частот с использованием критериев согласия 2, двустороннего теста Фишера, модифицированного 2 [Животовский, 1991]. Расчет осуществляли с использованием пакета программ, имеющегося в лаборатории, составленного сотрудниками д.б.н. Ельчиновой Г.И., д.б.н. Нурбаевым С.Д.. ^ Активный поиск кандидатных генов, оказывающих влияние на характер течения МВ, ведется в настоящее время многими группами исследователей. Особое внимание уделяется генам, вовлеченным в процессы иммунной защиты и воспаления [Drumm M.L. et al., 2005; Salvatore F. et al., 2002; Witt H., 2003]. Изучение модулирующего влияния кандидатных генов-модификаторов следует проводить в группе больных с одинаковым CFTR генотипом для исключения возможного специфического влияния разных мутаций гена CFTR на фенотип [CFGPC, 1993; Каширская Н.Ю., 2001; de Gracia J., et al., 2005; Loubieres M.D., et al., 2002; McKone E.F., et al., 2003; Salvatore F., 2002]. Наиболее многочисленную группу в исследованной нами выборке больных составили 148 пациентов, гомозиготных по мутации F508del (32% от общего числа больных МВ, обследованных в научно-клиническом отделе муковисцидоза МГНЦ РАМН с 1991 по 2006 год). Для этой группы характерно преобладание смешанной формы заболевания (98%), а также быстрое прогрессирование заболевания (ранняя манифестация кишечного синдрома - 0,27 ± 0,08 года (0,00 - 6 лет) и ранняя манифестация легочного синдрома - 0,66 ±0,11 года (0,00 - 10 лет)). Высев P.aeruginosa отмечен у 77% больных, из них хроническая синегнойная инфекция - у 57,6%. Высев S.aureus присутствовал в анамнезе у 73% пациентов. Мекониальным илеусом заболевание дебютировало у 7,5% больных. Синдром дистальной интестинальной обструкции отмечен у 7,6%. Патология печени выявлена у 31% больных, в том числе цирроз у 17,6%, фиброз у 11,5%, холестатический гепатит у 1,4%, вирусное поражение печени у 2% пациентов. Средний возраст больных с поражением печени составил 9,26 ±0,61 лет. В настоящей работе исследовано влияние генов еNOS (эндотелиальной синтазы оксида азота), TNFA (фактора некроза опухоли α), LTA (лимфотоксина α), GSTM1 (глутатион-S-трансферазы М1), MBL2 (манозо-связывающего лектина), HFE (гемохроматоза типа I), как наиболее вероятно вовлеченных в патогенез клинических проявлений МВ. В исследованных генах были проанализированы полиморфизмы, ассоциированные с функцией генов и имеющие относительно высокую популяционную частоту (не менее 10%). ^ Принимая во внимание то, что оксид азота, синтезируемый eNOS (эндотелиальной синтазой оксида азота), стимулирует бронходилятацию, задействован в иммунной защите и участвует в регуляции сосудистого тонуса, отчасти компенсируя индуцированную гипоксией вазоконстрикцию в легких больных МВ, нами проведен анализ полиморфизма VNTR 27 п.н. в 4 интроне гена еNOS у больных МВ и в контрольной группе. Частота аллеля А еNOS4 составила в выборке больных муковисцидозом, гомозиготных по мутации F508del, 0,208, а в контрольной выборке 0,111, различие частот достоверно: χ12=10,13, p<0,01. Группы обследуемых больных МВ с различными генотипами по VNTR еNOS4 не отличались по полу, получаемой терапии, месту проживания. Различий по тяжести течения и форме заболевания между группами не наблюдалось. В группе больных с генотипами А/А и А/В выявлены достоверно более низкие показатели ФЖЕЛ (69,37±4,09% от должного) по сравнению с группой больных с генотипом В/В (80,57±3,31% от д.) (Z=2,14, p=0,03). Показатели ОФВ1 у больных, имеющих аллель А, также ниже (64,48±5,50% от д.), чем у больных с генотипом В/В (77,62±4,14% от д.) (Z=1,85, p=0,06) (рис.1). Подавляющее большинство литературных источников свидетельствует о снижении синтеза NO у обладателей А аллеля [Пай Г.В. и др., 2006; Tsukada T. et al., 1998; Hoffmann I.S. et al., 2005; Song J. et al., 2003]. Полученные нами результаты согласуются с этими данными, т.к. недостаточная выработка NO должна неблагоприятно отражаться на ФВД из-за способности оксида азота вызывать бронходилятацию и улучшать мукоцилиарный транспорт. Достоверных различий в высеве P.aeruginosa, St.aureus, MRSA, Al.xylosoxidans, B.сepacia, St.maltophilia между группами не наблюдалось.  Рисунок 1. Ассоциация полиморфизма VNTR eNOS4 с показателями ФВД (ФЖЕЛ и ОФВ1) у больных МВ. Цирроз печени выявлен у 6,6% больных с генотипами А/А и А/В, что достоверно реже, чем у больных с генотипом В/В (22,06%) (χ12=4,06, p<0,05). Однако фиброз печени, напротив, достоверно чаще отмечнен у больных с генотипами А/А и А/В (21,21%), чем у больных с генотипом В/В (5,88%) (χ1,0652=5,67, p<0,05). Тогда как различие суммарных частот поражений печени в группах незначимо (27,27% и 32,35%, соответственно, p>0,05) (рис.2). Различий по среднему возрасту больных с заболеванием печени, а также по наличию вирусного поражения печени у больных с разными VNTR eNOS4 генотипами не выявлено. %  Рисунок 2. Ассоциация полиморфизма VNTR eNOS4 с поражением печени у больных МВ. Для подтверждения диагноза билиарного цирроза, развивающегося при МВ, необходимо гистологическое заключение, однако больным МВ пункция печени не показана и у этого контингента больных диагноз ставится косвенно, по совокупности клинических, лабораторных показателей и данных УЗИ. Определяющим в постановке диагноза цирроза является наличие у больного портальной гипертензии (ПГ), в развитии которой вовлечена eNOS, увеличивающая синтез NO у больных с циррозами печени, что рассматривается как адаптация эндотелиальных клеток к стойкому повышению давления в системе портальной вены [Goh B.J. et al., 2006]. Повышенная продукция NO этим ферментом способствует дилятации портальной вены и ее притоков, реваскуляризации сосудистых коллатералей и развитию, т.о., ПГ [Mohammed N.A. et al., 2003]. Низкая регистрация цирроза печени среди больных, несущих аллель А, соответствует данным о низкой активности eNOS у больных с генотипами А/А и А/В. Итак, у больных МВ аллель eNOS4*A ассоциирован со снижением показателей ФВД и более редким диагнозом цирроза печени. Анализ ассоциации полиморфизмов -308G>A гена TNFA и +252 A>G гена LTA с клиническими проявлениями муковисцидоза. TNFA (фактор некроза опухоли α) является мощным провоспалительным цитокином и хемоатрактантом для нейтрофилов. Учитывая его значительную роль в развитии лейкоцитарного повреждения легких, нами был проведен анализ полиморфизмов -308 G-A в гене TNFA и +252 A-G в гене LTA, ассоциированных с изменением уровня TNFA в плазме, у больных муковисцидозом и у здоровых индивидов. Различий частот аллелей и генотипов полиморфизмов -308G-A гена TNFA и +252 A-G гена LTA, а также комбинаций генотипов по данным полиморфизмам между выборками здоровых и больных муковисцидозом не выявлено. Группы обследуемых больных с различными генотипами по полиморфизмам -308G-A в гене TNFA и +252 A-G гена LTA не отличались по полу, получаемой терапии, месту проживания. В группе больных с генотипами А1—А2 и А2—А2 выявлена более поздняя постановка диагноза по сравнению с группой больных с генотипом А1-А1 по гену TNFA (3,21±0,6 года против 1,89±0,25 года; Z=-2,23; p=0,025) (рис. 3). Более поздняя постановка диагноза наблюдалась также в группе пациентов, гетерозиготных по обоим полиморфизмам генов TNFA и LTA (А1—А2; В1—В2), по сравнению с группой больных, гомозиготных по более частым аллелям изучаемых полиморфизмов (А1—А1; В2—В2) (3,31±0,89 года против 1,69±0,29 года; Z=-2,12; p=0,034). Достоверных различий в возрасте начала заболевания и времени появления симптомов, как при совместном рассмотрении полиморфизмов, так и при анализе каждого из них в отдельности не выявлено.  ^ Рисунок 3. Ассоциация полиморфизмов -308 G-A гена TNFA и +252 A-G гена LTA с возрастом постановки диагноза. Различий по другим изучаемым параметрам между группами больных с разными генотипами по исследуемым полиморфизмам в генах TNFA и LTA не выявлено. ^ GSTM1 (глутатион-S-трансфераза М1) участвует в детоксикации ксенобиотиков и нейтрализации продуктов перекисного окисления липидов, снижая степень оксидативного стресса, выраженного при МВ. Учитывая вышесказанное, а также данные литературы о наличии экспрессии гена GSTM1 и в тканях легких и в печени [Cantlay AM. et al.,1994; Henrion-Caude A. et al., 2002], нами проведен анализ делеционного полиморфизма GSTM1 у больных муковисцидозом, а также у здоровых индивидов. Частота гомозигот по нулевому аллелю GSTM1 достоверно не различалась в выборке больных МВ и в контрольной выборке. Группы больных с различными генотипами GSTM1 не отличались по полу, получаемой терапии, месту проживания. Параметры, характеризующие тяжесть течения бронхолегочного процесса, в группах с различными генотипами по делеционному полиморфизму гена GSTM1 у обследованных больных значимо не различались. Было выявлено достоверное увеличение частоты фиброза печени у гомозигот по нулевому аллелю GSTM1 (14,04%) по сравнению с больными, имеющими функциональные аллели (1,79%) (χ1,1062=6,34, p<0,05) (рис. 4). Общая частота заболеваний печени в этих группах больных различалась недостоверно (33,33% против 25,0% соответственно, χ12=0,95, p>0,05). Различия в частоте цирроза, холестатического гепатита и вирусных поражений печени между группами больных с разными генотипами GSTM1 не отмечены. Т.к. GSTM1 имеет антиоксидантные и детоксикационные свойства, возможно, постоянное использование лекарств и воздействие системного оксидативного стресса обладают более сильным повреждающим действием на печень среди больных МВ, гомозиготных по нулевому аллелю GSTM1, чем у носителей функциональных аллелей. В литературе имеются сведения об увеличении риска гепатопатий среди индивидов, гомозиготных по нулевому аллелю [Engracia V. Et al., 2003; Mohammadzadeh Ghobadloo S.et al., 2006]. %  Рисунок 4. Ассоциация делеционного генотипа GSTM1 с фиброзом печени. Таким образом, выявлена ассоциация генотипа 0/0 GSTM1 с увеличением частоты фиброза печени у больных МВ. Однако, учитывая отсутствие достоверных различий между группами в частоте других заболеваний печени, имеющих сходный патогенез, полученные результаты требуют подтверждения. ^ MBL (маннозо-связывающий лектин) является важным компонентом системы врожденного иммунитета, действующим как опсонин и активатор комплемента, и его уровень может оказывать влияние на течение МВ. Нами был проведен анализ промоторного полиморфизма и трех мутаций первого экзона гена MBL2 (R52C, G54D и G57E) в выборках здоровых индивидов и больных МВ. Достоверных различий частот мутантных аллелей в выборках больных МВ и контроля не выявлено. В дальнейшем все мутантные аллели были объединены и обозначены как O, поскольку каждая из мутаций приводит к практически полному отсутствию белка MBL в сыворотке; аллель дикого типа обозначен как A. Различия в частотах генотипов и аллелей полиморфизма -221G-C гена MBL2 между группами здоровых индивидов и больных МВ не достоверны. В дальнейшем аллель G обозначен как Y, а аллель C – как X. Существует отчетливая связь между уровнем MBL в сыворотке и генотипом по гену MBL2 [Steffensen R., et al., 2000; Lee S.G., et al., 2005]. У индивидов с генотипом YA/YA уровень сывороточного MBL максимален, тогда как индивиды, имеющие аллель X полиморфизма (-221G>C) на одной хромосоме и аллель O на другой (генотип XA/O) или гомозиготные по аллелю O, имеют низкий уровень MBL в сыворотке. В соответствии с этим обследуемые больные МВ были разделены на три группы: 1). 39 человек – с генотипом YA/YA; 2). 57 пациентов, имеющих средние уровни MBL и следующие генотипы YA/XA, YA/O или XA/XA и 3). 8 больных - с генотипом XA/O или O/O. Изучаемые группы больных МВ с разными генотипами по гену MBL2 достоверно не различались по возрасту на момент последнего обследования. Различия в возрасте постановки диагноза также не достоверны.  ^ Примечание. Дошкольный возраст 4-6лет, младший школьный возраст 7-11лет, старший школьный возраст I 12-14 лет, старший школьный возраст II 15-17 лет Рисунок 5. Ассоциация генотипов MBL2 с показателями ОФВ1 в различных возрастных группах. В нашем исследовании при рассмотрении общей выборки без учета возраста различия в показателях ФВД у пациентов с разными генотипами MBL2 не выявлены. При разделении больных на возрастные группы оказывается, что у детей младшей возрастной группы (4-6 лет), имевших мутантные аллели по гену MBL2, показатели ФВД ниже (ФЖЕЛ -72,66±5,38% от д., ОФВ1 - 68,48±7,03% от д.), чем у пациентов с генотипом YA/YA (ФЖЕЛ - 83,74±5,27% от д., ОФВ1 - 89,91±6,57% от д.) (для показателя ОФВ1 это различие достоверно: Z=2,08, p=0,038). У детей средних возрастных групп (6-11 лет и 11-14 лет) различия показателей ФВД между пациентами с разными генотипами по гену MBL2 не достоверны. А в старшей возрастной группе (15-17 лет) наблюдалась обратная тенденция, т.е. у больных с генотипом YA/YA показатели ФВД снижены сильнее (ФЖЕЛ- 69,81±10,87% от д., ОФВ1- 59,88±13,72% от д.), чем у больных с мутантными аллелями гена MBL2 (ФЖЕЛ 92,36±9,45% от д., ОФВ1 83,74±5,27% от д.) (хотя различия и не достигли уровня значимости: для ФЖЕЛ – Z=-1,29, p=0,11; для ОФВ1 Z=-1,21, p=0,22). Это можно объяснить тем, что функция иммуномодулятора, которую выполняет MBL, наиболее важна в раннем детском возрасте, когда система специфического иммунитета сформирована неполно. В более взрослом возрасте высокий уровень MBL может уже не иметь протективного значения и, напротив, усугублять развитие заболевания, что соответствует наблюдениям H.V.Olesen с соавторами [2006]. Значимых различий в частоте высева P.aeruginosa между группами с различными генотипами MBL2 не выявлено. Однако обнаружено достоверное различие возраста первого высева P.aeruginosa в исследуемых группах больных МВ. Более раннее начало поражения бронхолегочной системы P.aeruginosa отмечено у больных второй и третьей групп по сравнению с пациентами, имеющими генотипы YA/YA по гену MBL2 (Z=2,39; p=0,017).  % Рисунок 6. Ассоциация генотипов MBL2 с возрастом первого высева P.aeruginosa.  Рисунок 7. Ассоциация мутации G54D гена MBL2 с высевом Al. xylosoxidans и St. maltophilia. Была также изучена частота поражения бронхолегочной системы другими видами инфекции. Al. xylosoxidans выявлен у 5,2%, а St.maltophilia – у 15,5% пациентов. Различий в частоте поражения этими видами инфекции в группах больных с генотипом YA/YA и другими генотипами по гену MBL2 не выявлено. Но при рассмотрении каждого аллельного варианта гена MBL2 отдельно оказалось, что среди гомо- и гетерозигот по аллелю В частота поражения Al.xylosoxidans и St.maltophilia достоверно выше, чем у больных, не имеющих такового (14,0% против 3,0%; 20,972 = 4,20; p=0,037 и 30% против 12,5%; 21,018 = 3,90; p=0,049, соответственно). МИ и СДИО чаще наблюдали у больных, имевших генотипы, ассоциированные с пониженным уровнем MBL2 (18,4%), чем у больных с генотипом YA/YA (8,1%) (p=0,058). Рядом исследователей было показано, что у больных МВ, имеющих генотипы, обусловливающие сниженный уровень MBL2, частота и тяжесть поражения печени циррозом выше, чем у больных с нормальным уровнем MBL2 [Gabold M., et al., 2001]. Thio C.L. с сотрудниками [2005] показал, что аллель С промоторного полиморфизма -221G-C чаще встречается у индивидов с вирусной персистенцией (HBV). У индивидов, имеющих гомозиготные генотипы, ассоциированные с низкой продукцией MBL2, вирусная персистенция также отмечается чаще. В исследуемой нами выборке больных МВ частоты поражения печени циррозом и фиброзом в группах с разным генотипом по MBL2 не различались. Холестатический гепатит отмечен только среди больных, имеющих генотипы со сниженной продукцией MBL2 (7,8%) (p=0,09). Инфицирование вирусами HBV и HCV выявлено у трех больных, имеющих генотипы с мутантными аллелями гена MBL2. Таким образом, была обнаружена ассоциация генотипов MBL2, ассоциированных со снижением уровня MBL, с более ранней колонизацией легких P.aeruginosa, со снижением ОФВ1 у детей дошкольного возраста, с тенденцией к более частому развитию холестатического гепатита (p<0,1), мекониального илеуса и синдрома дистальной интестинальной обструкции (p<0,1). Выявлена ассоциация мутации G54D с более частым высевом Al. xylosoxidans и St. maltophilia. Анализ ассоциации мутации Н63D гена HFE с клиническими проявлениями муковисцидоза. Принимая во внимание данные литературы о связи мутаций гена гемохроматоза (HFE) с развитием мекониального илеуса и поражения печени у больных МВ [Rohlfs E.M. et al., 1998; Devaney J., et al., 2003; Salvatore F. et al., 2002], а также учитывая локализацию HFE в непосредственной близости к локусам MHC и схожесть желудочно-кишечных проявлений при наследственном гемохроматозе (НГ) и МВ, нами был проведен анализ мутаций H63D и C282Y в гене HFE у больных муковисцидозом и у здорового контроля. В выборке больных МВ, гомозиготных по мутации F508del, частоты аллелей D и Y мутаций H63D и C282Y в гене HFE составили 0,15 и 0,010, соответственно. Различия частот аллелей и генотипов по проанализированным мутациям между выборками здоровых индивидов и больных муковисцидозом недостоверны. Ввиду низкой частоты мутации C282Y (1%), анализ ассоциации с клиническими проявлениями МВ проводили только для мутации H63D. Группы обследуемых больных с генотипами H/H и D/H не отличались по полу. В группе больных с нормальным генотипом доля москвичей, обследуемых более часто и имеющих более широкий спектр доступных лекарственных средств, оказалась достоверно выше (χ21=5,38,p<0,05). Также среди больных с генотипом H/H большее число получало Пульмозим (Дорназа-альфа, Хоффманн ля Рош, Швейцария) (χ21=3,44, p<0,1), препарат, достоверно улучшающий показатели ФВД, увеличивающий массо-ростовой индекс, снижающий обсемененность мокроты S.aureus и P.aeruginosa [Капранов Н.И. и др., 2001]. У больных МВ, имеющих мутацию H63D в гене HFE, первые проявления со стороны ЖКТ наступали достоверно раньше (0,19±0,14 года), чем у больных с генотипом H/H (0,43±0,14 года) (Z=-2,04, p=0,04). Достоверные различия также отмечены в суммарной частоте МИ и СДИО, наблюдавшихся чаще у больных с генотипом H/D (24,24%), чем у больных с генотипом H/H (9,09%) (χ1,0432=4,65, p<0,05). Т годы аким образом, выявлена четкая связь мутации H63D с желудочно-кишечными проявлениями при МВ, обусловленными нарушением внешнесекреторной функции поджелудочной железы, причем D аллель ассоциирован с более выраженными изменениями в ЖКТ. E.M. Rohlfs с сотрудниками [1998] и J. Devaney с сотрудниками [2003] выявили тенденцию к увеличению частоты МИ у больных, несущих мутацию C282Y, однако для мутации H63D таких закономерностей выявлено не было [Rohlfs E.M. et al., 1998; Devaney J. et al., 2003]. В нашем исследовании среди трех больных, носителей мутации C282Y, МИ и СДИО в анамнезе не отмечались.  Р % исунок 8. Ассоциация мутации H63D гена HFE с возрастом манифестации кишечного синдрома.  Рисунок 9. Ассоциация мутации H63D гена HFE с мекониальным илеусом (МИ) и синдромом дистальной интестинальной обструкции. Различия частоты поражений печени в группах больных МВ с разными генотипами по мутации H63D не значимы. В группе больных с генотипом D/H выявлены более высокие средние показатели ФЖЕЛ (85,78±4,85% от д.) по сравнению с группой больных с генотипом Н/Н (74,80±2,90% от д.) (Z=1,85, p=0,06). У носителей мутации H63D наблюдались более высокие значения ФЖЕЛ, несмотря на то, что условия лечения и получаемая терапия этой группой больных были достоверно менее благоприятные, чем для больных с генотипом H/H. В доступной нам литературе данные о связи мутации H63D с заболеваниями легких отсутствуют. Ген HFE располагается в одном регионе с генами МНС, и можно предполагать, что аллель D ассоциирован с определенными гаплотипами МНС, способствующими более благоприятному течению бронхолегочного процесса. Например, мутация H63D находится в неравновесии по сцеплению с гаплотипом HLA A-29, который ассоциирован с увеличением числа Т-киллеров (CD8) [Cardoso C.S. et al., 2002]. Частота высева St.maltophilia у больных с генотипом D/H составила 3,03%, у больных с генотипом H/H - 15% (Р=0,06). Т.е. более благоприятные результаты микробиологического исследования, как и другие показатели течения бронхолегочного процесса, отмечены у носителей мутации H63D. Таким образом, выявлена ассоциация мутации H63D HFE c более ранней манифестацией кишечного синдрома и достоверно более высокой частотой МИ и СДИО. У обладателей мутации H63D в гене HFE также отмечена тенденция к более высоким показателям ФЖЕЛ (p<0,1) и более редкому высеву St.maltophilia (p<0,1), несмотря на менее благоприятные условия для лечения бронхолегочной патологии в этой группе больных (р<0,05). По нашему мнению, гены eNOS, MBL2, HFE можно рассматривать как модификаторы клинических проявлений МВ и анализ полиморфизмов в этих генах может оказаться полезным при прогнозе возможных осложнений у конкретных больных МВ. ВЫВОДЫ:
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ. Учитывая достаточно четкую корреляцию тяжести легочной патологии с А аллелем полиморфизма VNTR гена eNOS, мутациями G54D, G57E, R52C и полиморфизмом -221G-C гена MBL2 представляется вполне оправданным рекомендовать генотипирование больных МВ на наличие неблагоприятных аллелей с целью объективного прогноза течения заболевания и выработки более рациональной тактики лечения. ^ % от д. – % от должного ЖКТ – желудочно-кишечный тракт МВ – муковисцидоз ОФВ1 – объем форсированного выдоха в одну секунду ФВД – функция внешнего дыхания ФЖЕЛ – форсированная жизненная емкость легких еNOS – эндотелиальная синтаза оксида азота GSTM1 – глутатион-S-трансфераза М1 HFE – гемохроматоз LTA – лимфотоксин α MBL2 – манозо-связывающий лектин MRSA – метициллин-резистентный золотистый стафилококк NO – оксид азота TNFA – фактор некроза опухоли α СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ:
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям