Фармакологическая коррекция иммунометаболических нарушений в условиях гипоксии (экспериментально-клиническое исследование) 14. 03. 06 фармакология, клиническая фармакология 14. 01. 17 хирургия
|
|
Скачать 1.06 Mb.
|
|
На правах рукописи НИКОЛАЕВ СЕРГЕЙ БОРИСОВИЧ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ В УСЛОВИЯХ ГИПОКСИИ (экспериментально-клиническое исследование) 14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология 14.01.17 – хирургия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Курск – 2011 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». ^ доктор медицинских наук, профессор, член-корр. РАЕН Быстрова Наталья Анатольевна доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН, Заслуженный врач РФ ^ Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Провоторов Владимир Яковлевич доктор медицинских наук, профессор Парфенов Игорь Павлович доктор медицинских наук Филиппова Ольга Всеволодовна ^ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Защита диссертации состоится «____» ___________ 2011 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (305041, г. Курск, ул. К.Маркса, 3). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (305041, г. Курск, ул. К.Маркса, 3). Автореферат разослан «____» ___________ 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент Пашин Е.Н. ^ Гипоксия является ведущей патогенетической составляющей различных нозологических форм патологии и осложняет течение многих заболеваний. Гипоксией сопровождаются все виды дыхательной и сердечно-сосудистой недостаточности, кровопотеря, ишемия миокарда, нарушение мозгового или периферического кровообращения, термические и механические травмы. В хирургической практике нередко приходится на время прекращать кровоснабжение оперируемого органа, создавая искусственную ишемию. Это определяет исключительную важность и социальную значимость проблемы защиты организма от кислородной недостаточности и энергодефицита (Мороз В.В. и др., 2002; Ашмарин И.П., 2005; Шулутко Б.И., Макаренко С.В., 2005; Игнатьев В.И., Кокосов А.Н., 2006; Бизенкова М.Н., 2008). По современным представлениям, главной мишенью для гипоксии является энергетический обмен. Энергодефицит и активация на его фоне перекисного окисления липидов приводят к комплексной модификации всех функций биологических мембран (Лукьянова Л.Д., 2004; Чеснокова Н.П., 2006; Васильев К.Ю., Хазанов В.А., 2007), в том числе мембран иммуноцитов и эритроцитов (Стародубцева М.Н. и др., 2007; Кармен Н.Б., 2008; Конопля А.И. и др., 2008; Новицкий В.В. и др., 2008; Софронов В.В. и др., 2010). При этом при гипоксии замыкается порочный круг: недостаток кислорода нарушает энергетический обмен и стимулирует свободнорадикальное окисление, а активация свободнорадикальных процессов, повреждая мембраны митохондрий и лизосом, усугубляет энергодефицит (Зенков Н.К. и др., 2001; King J.G., Tsen K.T., 2006). Все это создает условия для проникновения в сосудистое русло метаболитов, способных непосредственно изменять функциональную активность иммунокомпетентных клеток, а также индуцировать появление иммуносупрессорных свойств у эритроцитов (Прокопенко Л.Г. и др., 2003; Лебедев В.В., 2004; Земсков А.М. и др., 2007). Иммунные нарушения, возникающие при гипоксии различного генеза, и механизмы их развития остаются все еще мало изученными (Демина Д.В., 2004; Игнатьева С.Н., 2007; Ben-Shoshan J. et al., 2008; Tsoi E.M., 2008; Lee C.T., 2010). Функции иммунной системы осуществляются на фоне метаболических процессов и их сдвигов, вызываемых действием на организм различных агентов, а также клеток микроокружения – эритроцитов (Прокопенко Л.Г. и др., 2006; Kiang J.G., 2006; Земсков А.М. и др., 2007; Конопля А.А. и др., 2010). Типовые метаболические сдвиги, возникающие при гипоксии различного генеза, сочетаются и с определенными особенностями нарушений метаболизма в тех или иных органах и тканях, обусловленными спецификой их структурно-функциональной организации, природой индуцирующего агента и первичным звеном его воздействия на клетки и организм в целом (Чеснокова Н.П., 2006; Бизенкова М.Н. и др., 2007; Прокопенко Л.Г. и др., 2008). Взаимосвязь многочисленных метаболических сдвигов, нарушений физико-химических свойств эритроцитов, возникающих при гипоксии, с функцией иммунной системы до настоящего времени изучена недостаточно. Неоднозначность механизмов нарушений, лежащих в основе разных типов гипоксии, обусловливает тот факт, что корригирующие свойства фармакологических препаратов, проявляемые на одной какой-либо модели, не обязательно должны воспроизводиться на другой (Зарубина И.В. и др., 2002; Новиков В.Е., Катунина Н.П., 2002; Оковитый С.В. и др., 2005). Для эффективной иммунореабилитации, в том числе и при гипоксии, необходимо использовать комбинации препаратов, которые способны помимо воздействия на энергопродуцирующую систему клетки, иметь дополнительные точки приложения: иммуноциты, интенсивность ПОЛ, структурно-функциональное состояние мембран клеток-мишеней и эритроцитов (Караулов А.В. и др., 2008; Конопля А.А. и др., 2010). В существующих стандартах лечения состояний включающих гипоксическую компоненту мало патогенетически обоснованных и эффективных способов фармакологической коррекции сопровождающих их иммунных и оксидантных расстройств (Земсков А.М., Самодай В.Г., 2006; Рыбников В.Н., 2009; Мансимова О.В. и др., 2010). При выборе лекарственного препарата его точка приложения должна определяться степенью выраженности нарушений того или иного звена иммунной и антиоксидантной системы для обеспечения максимальной эффективности проводимой терапии (Земсков А.М. и др., 2008; Караулов А.В. и др. 2008; Конопля А.А. и др., 2010). Критическая ишемия нижних конечностей является хирургической патологией, в патогенезе которой значительную роль играют нарушения, обусловленные локальной гипоксией большого массива мягких тканей. Разработка способов консервативной терапии КИНК у больных с нереконструируемым сосудистым руслом, позволяющих улучшить результаты лечения и исходы заболевания, является одной из актуальных хирургических проблем (Лазаренко В.А. и др., 2004; Беликов Л.Н. и др., 2006; Горпинич А.Б. и др., 2008). Кроме того, КИНК сопровождается развитием вторичного иммунодефицита гуморального и клеточного звена, усиливающегося при нарастании тяжести ишемии (Дибиров А.А., 2009; Малхас Т.С., 2009; Косаев Д.В. и др., 2010). Некупирующийся иммунодефицит после выполнения реваскуляризирующих операций и недостаточная эффективность прямых иммуномодуляторов возможно объясняется сохраняющейся несостоятельностью периферического сосудистого русла, что не позволяет полностью оборвать цепочку патологических реакций индуцированных гипоксией (Морозов М.Ю. и др., 2006; Kominsky D.J. et al., 2010). При этом вторичное иммунодефицитное состояние у больных с облитерирующим атеросклерозом при ишемии высокой степени способствует возникновению гнойно-воспалительных осложнений в послеоперационном периоде (Земсков А.М., Самодай В.Г., 2006; Малхас Т.С., 2009). В связи с выше изложенным, актуален поиск фармакологических средств и их сочетаний, обладающих высокой антиишемической активностью у пациентов с нереконструируемым артериальных руслом, способных также оказывать влияние на состояние иммунной реактивности, оксидантного статуса и отдалять развитие неблагоприятных исходов в виде гангрены с последующей ампутацией конечности. Раскрытию механизмов нарушений иммунного и метаболического гомеостаза при различных видах экспериментальной гипоксии, установлению роли эритроцитов, тромбоцитов и гепатоцитов в патогенезе этих расстройств и разработке патогенететически обоснованных методов фармакологической коррекции, с подтверждением их клинической эффективности на примере КИНК атеросклеротического генеза, посвящена данная диссертационная работа. ^ – установить характер и степень иммунометаболических нарушений при основных видах гипоксических состояний, разработать способы фармакологической коррекции. Задачи:
^ Установлены характер и степень иммунометаболических нарушений при различных видах системной и локальной гипоксии, впервые проведен их сравнительный анализ. Впервые выявлены изменения сорбционных свойств, энергетического и антиоксидантного статуса эритроцитов в зависимости от патогенеза гипоксического воздействия. Установлена взаимосвязь между метаболическими, структурно-функциональными изменениями в эритроцитах и нарушением иммунной реактивности. На основании выявленных патогенетических особенностей развития иммунодефицита при недостатке кислорода разработаны дифференцированные способы фармакологической коррекции при различных видах гипоксии системного или локального характера. Определена роль эритроцитов в реализации иммуномодулирующего действия полиненасыщенных фосфолипидов (фосфоглив), регуляторов энергетического обмена (эспа-липон), антигипоксантов (гипоксен) и антиоксидантов (мексикор) в условиях гипоксии. Впервые выявлена роль эритроцитарно-лимфоцитарных взаимодействий в реализации эффектов антиоксидантов при интервальной гипоксической гипоксии. Установлено, что иммуномодулирующее действие эритроцитов животных, получавших исследованные фармакологические препараты опосредуется цитокинами спленоцитов, повышающими взаимодействие Т- и В-лимфоцитов и угнетающими развитие антигенспецифической и антигеннеспецифической форм иммуносупрессии. Установлен механизм развития эритроцитарно-тромбоцитарной иммуносупрессии при острой гемической гипоксии и возможности ее эффективной коррекции сочетанным применением фосфоглива и эспа-липона. Выявлены системные иммунные и оксидантные нарушения, а также изменения физико-химических свойств эритроцитов у больных с критической ишемией нижних конечностей атеросклеротического генеза. Разработан метод комплексного консервативного лечения больных с критической ишемией нижних конечностей в виде сочетанного использования серотонина адипината и мексикора. Установлена клинико-лабораторная эффективность предложенной фармакологической схемы. ^ Экспериментально обоснована целесообразность дальнейшего изучения и использования препаратов с антиоксидантным, антигипоксантным, мембраностабилизирующим действием, регуляторов энергетического обмена, а также их комбинаций, при иммунодефицитных состояниях с патогенетическим гипоксическим компонентом. Установлена недостаточная эффективность раздельного использования полиненасыщенных фосфолипидов, активаторов энергетического обмена, антиоксидантов и антигипоксантов для коррекции иммунометаболических нарушений при некоторых видах системной и локальной гипоксии. Доказана возможность коррекции эритроцитарно-тромбоцитарной иммуносупрессии при гипоксии с использованием фосфоглива и эспа-липона. Выявлено индуцирующее влияние сочетанного использования фосфоглива и эспа-липона, а также изолированного – мексикора, на повышение иммуногенных свойств тяжелых эритроцитов в условиях гипоксии. Показана взаимосвязь между изменением физико-химических свойств, метаболического статуса эритроцитов и эффективностью фармакологической коррекции иммунометаболических нарушений при отдельных видах гипоксических состояний фармакологическими препаратами различных групп. Обоснована целесообразность проведения дальнейших исследований по поиску оптимальных сочетаний фармакологических препаратов в качестве средств коррекции иммунометаболических нарушений при различных формах гипоксических состояний. Клинически обоснованы методы иммунореабилитации в комплексном лечении больных с критической ишемией нижних конечностей атеросклеротического генеза серотонина адипинатом и мексикором. Разработанные рекомендации внедрены в работу ГМУ «Курская областная клиническая больница», МУЗ «Городская клиническая больница скорой медицинской помощи» г. Курска. Материалы диссертации включены в рабочие программы ряда кафедр Курского, Российского, Саратовского, Самарского, Волгоградской, Ивановской, Воронежской государственных медицинских университетов и академий и медицинских факультетов Белгородского и Орловского государственных университетов. ^
^ . Основные положения диссертации доложены и обсуждены на II заочной электронной межвузовской научной конференции «Вопросы иммунопатологии и иммунореабилитации» (Курск, 2005), Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006), Всероссийском симпозиуме «Магнитные поля и здоровье человека» (Курск, 2007), Международной научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Паттайя, Тайланд, 2007), IV Международной конференции по иммунотерапии (Москва, 2008), XIII и XV Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Дубай, ОАЭ, 2008, 2010), Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), 74-й научной конференции КГМУ, сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН: Университетская наука: Теория, практика, инновации (Курск, 2009), X Международном Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», посвященному 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д. Адо (Казань, 2009), XIII Всероссийском научном форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009), региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы научно-практической медицины» (Брянск, 2009), Российской научно-практической конференции «Инновации в анестезиологии и медицине критических состояний» (Курск, 2009), Межвузовской научной конференции, посвященной памяти профессора Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ (Курск, 2009), VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2010), III общероссийской научной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Сочи, 2010), совместном заседании кафедр фармакологии; клинической фармакологии; хирургических болезней ФПО; хирургических болезней №1; хирургических болезней №2; биологической химии; микробиологии, вирусологии и иммунологии; фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета (2010). Публикации. По материалам диссертации опубликована 31 работа, из них 18 – в рекомендуемых изданиях ВАК РФ и 1 монография, в которых содержится полный объем информации, касающейся темы диссертации. ^ Диссертация изложена на 327 страницах машинописного текста, иллюстрирована 68 таблицами и 21 рисунком, состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания методов исследования, изложения собственных результатов (9 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 399 отечественных и 193 иностранных источника. ^ Материалы и методы. Экспериментальная часть. Объект исследования. Эксперименты выполнены на крысах Вистар массой 180–210 г, прошедших карантинный режим вивария ГОУ ВПО КГМУ Росздрава и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме. Для получения статистически достоверных результатов группы формировали из 8-10 животных. В контрольные и опытные группы входили животные одного возраста, полученные из питомника одновременно. Разброс в группах по исходной массе не превышал ±10%. Исследования проводились в соответствии с Приказом МЗ РФ от 19.06.2003 г. №267 «Правила лабораторной практики в Российской Федерации» и принципами, изложенными в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей» (г. Страсбург, Франция, 1986). ^ Острое ишемическое поражение печени вызывали оперативным методом под внутрибрюшинным гексеналовым наркозом (30 мг/кг веса) путем пережатия гепатодуоденальной связки после ее инфильтрации 0,5 мл 0,5% раствора новокаина с помощью турникета в течение 20 и 30 минут (Антопольская Е.А., 1988). Рану брюшной полости ушивали послойно и обрабатывали йодопироном. Верификация наступления структурных изменений в ткани печени производилась гистологическими методами. При патоморфологическом исследовании обращали внимание на изменение комплексной микроскопической структуры печени и состояние гепатоцитов в центральных и периферических дольках. ^ моделировали у животных под эфирным наркозом. После наступления наркоза крысу фиксировали к операционному столику, снимали исходную электрокардиограмму. Вскрывали грудную клетку и лигировали переднюю нисходящую ветвь левой коронарной артерии на 1,0-1,5 мм ниже ушка предсердия. После перевязки производили послойное ушивание раны. Послеоперационную рану обрабатывали йодопироном. Развитие экспериментального острого инфаркта миокарда верифицировали электрокардиографически в последующие сутки наблюдения (Коган А.Х., 1979). В качестве контроля в эксперимент были введены ложнооперированные животные, у которых объем операции ограничивался вскрытием брюшной полости или грудной клетки и послойным ушиванием раны. ^ вызывали путем помещения крыс в гермокамеры (эксикатор) одинакового объема до появления признаков терминальной стадии гипоксии 1 раз в сутки в течение 5 дней с интервалом в 24 часа (Зеленская К.Л. и др., 2005; Лукьянова Л.Д., 1990). ^ моделировали следующим способом: после предварительного обильного питья под общим обезболиванием выполняли венесекцию участка бедренной вены одной из задних лапок крысы, затем канюлировали мобилизованную вену и вводили 1 мг гепарина, после чего из кровотока удаляли кровь из расчета 10 мл/кг веса, что приблизительно соответствует 1,8-2,1 мл. Объем циркулирующей жидкости восполняли аналогичным кровопотере объемом 0,9% раствора хлорида натрия (Sapirstein L.A. et al., 1960; Лукьянова Л.Д., 1990). ^ моделировали путем пятикратного через 24 часа внутрибрюшинного введения нитропруссида натрия (Na2[Fe(CN)5NO]) в дозе 1 мг/кг веса (Зеленская К.Л. и др., 2005; Лукьянова Л.Д., 1990). ^ В работе использовались следующие препараты: мексикор (ООО "ЭкоФармИнвест", Россия); фосфоглив (НИИ «Биомедхимии» РАМН, Россия), гипоксен (ЗАО «Корпорация Олифен», Россия); эспа-липон (Esparma GmbH, Германия) и серотонина адипинат (ЗАО «ЛОРР», Россия). Способ введения препаратов соответствовал рекомендациям, приведенным в пособии по фармакотерапии М.Д. Машковского «Лекарственные средства» и аннотациях по использованию препаратов. Перерасчет доз с человека (средний вес 70 кг) на животных – белых крыс производился в сторону увеличения в 5,9 раз (Фисенко В.П., 2000). Первое введение препаратов в экспериментальных моделях с однократным острым воздействием (ишемия печени, ЭИМ и ОГГ) выполнялось за 1 час до манипуляции. Исключение составлял фосфоглив в модели острой ишемии печени. Препарат начинали вводить за пять суток до операции, что было обусловлено тяжестью оперативного вмешательства и особенностями фармакокинетики препарата, чтобы обеспечить его стабильный уровень в плазме крови к моменту моделирования ишемии печени. При многократных гипоксических воздействиях (ГипГ и ГТГ) первое и последующие введения препаратов осуществляли за 1 час до помещения крыс в гермокамеры или введения нитропруссида натрия соответственно (табл. 1). Таблица 1 ^
^ Крыс иммунизировали однократным внутрибрюшинным введением эритроцитов барана в дозе 2х109 клеток на 1 кг массы тела. Выраженность гуморального иммунного ответа оценивали на пятые сутки после иммунизации путем определения в селезенке числа антителообразующих клеток (Мальберг К., Зигль Э., 1987). Гиперчувствительность замедленного типа у крыс индуцировали внутрибрюшинным введением 1х108 ЭБ в 0,5 мл 0,15 М раствора натрия хлорида. О выраженности ГЗТ судили по разнице масс регионарного и контрлатерального лимфатических узлов через 24 часа после введения разрешающей дозы антигена (Федосеева В.Н. и др., 1993). Активность и интенсивность фагоцитоза нейтрофилов, выделенных из периферической крови, оценивали по фагоцитарному индексу, фагоцитарному числу и индексу активности фагоцитов (Медведев А.Н., Чаленко В.В., 1991; Фримель Г., 1987). Активность кислородзависимых бактерицидных систем нейтрофилов определяли в реакции восстановления нитросинего тетразолия, спонтанной и стимулированной зимозаном, с расчетом функционального резерва (Виксман М.Е., Маянский А.Н., 1979; Щербаков В.И., 1989). В части экспериментов для выяснения механизмов нарушения метаболической активности нейтрофилов периферической крови их кислородзависимую активность оценивали фотометрически по показателям оптической плотности в спонтанной, стимулированной неопсонизированным зимозаном, стимулированной опсонизированным зимозаном реакции восстановления нитросинего тетразолиям и вычисляли коэффициенты функционального резерва – КАо (отношение НСТ инд. оз к НСТ-сп.), КАн (НСТ-инд. нз к НСТ-сп.) и КО (отношение НСТ-инд. оз к НСТ-инд. нз) (Зинкин В.Ю. и др., 2004). ^ Донорами крови служили животные опытных и контрольных групп. Кровь получали из яремной вены под эфирным наркозом у животных не получавших препараты: при ГипГ, ОГГ, ГТГ на 5-е сутки, при ЭИМ – на 10-е сутки; у крыс получавших лекарственную терапию – через 24 часа после последнего введения препарата(ов). Собирали пул крови от 5-6 однородных по опыту животных. Кровь отстаивали дважды в 10 мМ Na-фосфатном буфере (рН=7,4), содержащем 0,9% хлорида натрия и 3% декстрана Т-500, с последующей очисткой с помощью НВS-целлюлозы в Na-фосфатном буфере (Beutler E., 1985). Далее эритроциты фракционировали в градиенте концентрации агарозы (Иванов В.П. и др., 2004). Получали фракции легких эритроцитов (плотность ниже 1,079 г/см3) и тяжелых эритроцитов с плотностью, превышающей 1,117. В некоторых экспериментах эритроциты фракционировали в градиенте плотности яичного альбумина (Кобозев Т.В. и др., 1978). Иммуномодулирующие свойства легкой и тяжелой фракций эритроцитов, определяли путем трехкратного (с интервалом в 24 часа) внутривенного введения (по 108 клеток/кг массы) интактным реципиентам, которых иммунизировали ЭБ в последний день введения аллогенных эритроцитов (Конопля А.А., 2004). ^ Гепаринизированную кровь центрифугировали 5 мин при 180g. После расслоения крови на плазму, лейкоцитарный слой и эритроциты, отбирали первые два слоя и центрифугировали в течение 10 мин при 600 g. Супернатант представлял собой плазму, обогащенную тромбоцитами. Для получения плазмы, дефицитной по тромбоцитам, обогащенную тромбоцитами плазму центрифугировали в течение 20 мин при 1000g (Коган А.Х. и др., 1992). После выделения плазмы, дефицитной по тромбоцитам, и тромбоцитов, взвесь последних пропускали через колонку с сефарозой 2В, получая концентрированную и очищенную взвесь тромбоцитов (Ермолаева Т.А. и др., 1991). Плазму, обогащенную и дефицитную по тромбоцитам, использовали для обработки ЛЭ (1х107 клеток инкубировали в 1 мл плазмы в течение 1 часа при 37 °С). Тромбоциты и ЛЭ инкубировали в плазме крови (1х108 тромбоцитов плюс 1х107 эритроцитов в 1 мл плазмы, 30 минут при 37 °С). Иммуномодулирующая активность инкубата определялась путем трехкратного (с шестичасовым интервалом) внутривенного введения здоровым аллогенным реципиентам, которых иммунизировали ЭБ при последнем поступлении инкубата. Иммуномодулирующую активность тромбоцитов определяли путем их однократного внутривенного введения (по 108 клеток/кг массы) интактным аллогенным реципиентам с одновременной иммунизацией ЭБ (Быстрова Н.А., 2003). ^ Клетки селезенки фракционировали по их способности прилипать к стеклянной поверхности (Дерфлинг П., Вихнер З., 1987). Прилипающие к стеклу клетки дополнительно фракционировали при температурном градиенте (Родионов С.В. и др., 1985). Клетки культивировали в среде 199 (107 клеток на 1 мл среды), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотики в течение 4-6 часов и готовили пул супернатантов прилипающих и не прилипающих к стеклу спленоцитов, содержащих равные объемы супернатантов 5-6 животных (Конопля А.И., Прокопенко Л.Г., 1982). Белки СПКС и СНКС после диализа и концентрирования фракционировали на сефадексе G-100 (Детерман Г., 1970). Получали три фракции белков: фракция I содержала белки с ММ более 100 кД, фракция II – белки с ММ 50-60 кД и фракция III – белки с ММ менее 15 кД. Концентрацию белков во фракциях устанавливали по Бредфорду, используя краситель Кумаси G-250 (Шишкин C.С., 1989). Иммуномодулирущую активность СПКС и СНКС оценивали путём однократного внутрибрюшинного введения интактным аллогенным реципиентам из расчета 5 мг белка супернатанта на 1 кг массы тела одновременно с иммунизацией ЭБ. Для определения иммуномодулирующей активности, выделенные хроматографические фракции вводили однократно внутрибрюшинно аллогенным реципиентам из расчета 2 мг белка на 1 кг массы тела, одновременно с иммунизацией ЭБ (Быстрова Н.А., 2003). ^ Лимфоциты периферической крови выделяли по В.Н. Федосеевой с соавт. (1993) и вводили крысам-реципиентам внутривенно однократно в дозе 108 клеток/кг одновременно с иммунизацией ЭБ. Клетки культивировали с ауто- или аллогенными эритроцитами в соотношении клеток 1:2 (5х107 лимфоцитов и 1х108 эритроцитов в 3 мл среды 199). Активность надосадочной жидкости определяли путем добавления ее к взвеси нейтрофилов (1х107 клеток на 100 мкг белка супернатанта) и последующего определения показателей ФМА нейтрофилов (Быстрова Н.А., 2003). ^ Разделение белков сыворотки крови первоначально осуществлялось солевым методом на осадочные и надосадочные с дальнейшим фракционированием на сефадексе G-150 и G-75 соответственно. Для исследования влияния сыворотки крови, ОБ и НБ на формирование ГИО и ГЗТ на ЭБ последние вводили внутрибрюшинно, одновременно с антигеном из расчета 200 мг белка на кг, а их гель-хроматографические фракции в дозе 50 мг белка на кг массы тела лабораторного животного (Базарная Т.В., 1996). ^ Иммуносупрессорный потенциал крови оценивали по концентрации в сыворотке липопротеидов низкой плотности (Меньшиков В.В., 1987) и гликозаминогликанов (Мурашов Б.Ф. и др., 1986), α-1-антипротеаз и α-2-макроглобулинов (Русаков С.В., Кубышкин А.В., 1995). ^ Размеры зон некроза и ишемии у крыс определяли через 4 часа после окклюзии коронарной артерии при помощи дифференциального индикаторного метода (Сернов Л.Н., Гацура В.В., 1989). ^ Для определения сорбционной способности эритроцитов по отношению к витальным красителям 1 мл суспензии эритроцитов смешивали в пробирке с 3 мл 0,025% раствора метиленового синего, инкубировали 10 мин при комнатной температуре и центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин. При длине волны 630 нм определяли оптическую плотность исходного раствора и надосадочной жидкости в единицах экстинкции по отношению к изотоническому раствору натрия хлорида (Тогайбаев А.А. и др., 1988). Количество поглощенного красителя выражали в процентах по формуле (1): ССЭ = 100 – 100 С2 / С1 , где (1) ССЭ – сорбционная способность эритроцитов в % поглощенного красителя; С1 – оптическая плотность раствора до инкубации с эритроцитами в единицах экстинкции; С2 – оптическая плотность раствора после инкубации с эритроцитами в единицах экстинкции. Исследовали также сорбционную емкость гликокаликса эритроцитов для альцианового синего, который является катионным красителем фталоцианиновой группы и обладает способностью связываться с гликолипидами, гликопротеидами и кислыми мукополисахаридами. Количество поглощенного альцианового синего рассчитывали в граммах на 1 эритроцит (Семко Г.А., 1998). ^ В сыворотке крови экспериментальных животных определяли концентрацию билирубина, активность аспартат- и аланинаминотрансфераз, щелочной фосфатазы, гаммаглутамилтранспептидазы, холестерина по Ильку, бета-липопротеидов по Бурштейну, общего белка, протромбинового индекса, фибриногена, мочевины (Меньшиков В.В., 1987). Величины всех перечисленных показателей определяли унифицированными методами с использованием наборов реагентов Био-ЛА-Тест «Плива-Лахема», Чехия. Интенсивность ПОЛ в сыворотке крови оценивали по содержанию малонового диальдегида (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977) и диеновых конъюгатов жирных кислот (Стальная И.Д., 1977). Антиоксидантный статус оценивали по активности в сыворотке крови каталазы (Королюк М.А. и др., 1988). В сыворотке крови также определяли концентрацию стабильных метаболитов оксида азота (Голиков П.П., 2004). Интенсивность ПОЛ в эритроцитах оценивали по содержанию в них ацилгидроперекисей и МДА (Бенисевич В.И., Идельсон Л.И., 1973). Энергообеспечение эритроцитов оценивали по содержанию в них аденозинтрифосфата и 2,3-бисфосфоглицерата (Виноградова И.Л. и др., 1980), а их антиоксидантный статус по активности СОД и глутатионредуктазы (Макаренко Е.В., 1988). Содержание фруктозо-2,6-дифосфата в лимфоцитах определяли по способности этого соединения активировать пирофосфатзависимую фосфофруктокиназу (Коровкин Б.Ф. и др., 1999). В супернатанте из печени крыс традиционными методами определяли концентрацию МДА и ДК с дальнейшим перерасчетом на 1 грамм ткани печени. ^ исследования основана на анализе результатов обследования и лечения 38 пациентов с облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей в стадии критической ишемии без трофических расстройств и гангрены (согласно критериям Европейского консенсуса, 1992 г., соответствуя III стадии хронической артериальной недостаточности по классификации А.В. Покровского) с наличием нереконструируемого поражения артериального русла нижних конечностей – критерии включения. Пациенты находились на лечении в отделении сосудистой хирургии ГМУ «Курская областная клиническая больница» с 2008 по 2010 год (главный врач – к.м.н. М.А. Кожухов, зав. отделением – В.П. Еськов). Перед включением в клиническое обследование у всех пациентов получено информированное согласие. Протокол клинического исследования был утвержден этическим комитетом ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Росздрава». Клиническое изучение было открытым, стандартизированным. Все поступающие в отделение пациенты с критической ишемией нижних конечностей были распределены на 2 группы. 1-я группа (группа сравнения) – 20 пациентов – получала стандартную фармакотерапию (пентоксифиллин, ксантинола никотинат, ацетилсалициловая кислота). Во 2-й группе (основной) у 18 пациентов стандартную терапию в течение 10 дней дополняли серотонина адипинатом (10 мг на 200 мл физиологического раствора внутривенно капельно в течение 1-2 часов) и мексикором (800 мг в сутки, разделенные на три внутривенных введения: 200-300-300 мг с интервалом в 8 часов на 100 мл 0,9% раствора NaCl). Данные клинические группы были стандартизированы по полу (мужчины), стадии хронической артериальной недостаточности (III), уровню атеросклеротической окклюзии. Средний возраст в группе сравнения составил 57,4±2,3 года, а в основной группе – 60,2±2,8 года. Сопутствующая соматическая патология диагностирована у 84,2% больных с преобладанием ишемической болезни сердца – 68,4%. В анамнезе острое нарушение мозгового кровообращения было у 7,6% пациентов. Значительный вес среди сопутствующей соматической патологии занимала артериальная гипертензия – 28,9%. В анамнезе оперативное лечение по поводу облитерирующего атеросклероза было выполнено у 44,7% пациентов, реконстуктивные вмешательства выполнялись у 26,3%, поясничная симпатэктомия 10,5%, ампутация конечности и пальцев стопы – 7,9%. У остальных 55,3% пациентов имело место многоуровневое атеросклеротическое поражение, верифицированное при ультразвуковом триплексном сканировании и ангиографии и препятствовавшее выполнению реконструктивных операций. Декомпенсация артериального кровотока у пациентов основной группы характеризовалась наличием болей в покое (100%), усиливающихся в ночное время с необходимостью опускания ишемизированной конечности с кровати для уменьшения их интенсивности (89%) и развитием отека стопы и голени (67%). У всех пациентов группы сравнения также отмечено наличие ишемической боли покоя, необходимость опускать нижнюю конечность с кровати вниз была у 85% человек, а отечность стопы – у 75%. Учитывая важную роль в развитии атеросклероза хронического иммунного воспаления, для оценки вклада начальных патогенетических изменений, необусловленных непосредственно ишемическим компонентом, в иммунный дисбаланс, при последующем прогрессировании процесса вплоть до стадии критической ишемии, на базе отделения сосудистой хирургии ГМУ «Курская областная клиническая больница» изучен иммунный статус у 17 пациентов с облитерирующим атеросклерозом, хронической артериальной недостаточностью I-IIА стадии (3 группа). Для сравнительной оценки клинической эффективности сочетанного использования серотонина адипината и мексикора ретроспективно по историям болезни отобрана группа больных в количестве 19 человек, находившихся ранее на лечении в отделении сосудистой хирургии ГМУ «Курская областная клиническая больница» с 2003 по 2007 год, получавших монотерапию серотонина адипинатом и удовлетворяющих критериям включения (4 группа). Критериями исключения из исследования были: наличие гангрены нижней конечности, отсутствие регистрируемого кровотока при ультразвуковой доплерографии одновременно в дистальных отделах передней и задней большеберцовых артерий, сахарный диабет, аутоиммунные заболевания, ревматологические болезни за исключением деформирующего остеоартроза, тяжелая сердечная недостаточность, острое нарушение мозгового кровообращения или острый инфаркт миокарда в клинике, выраженные нарушения функции печени и почек, острые тромбозы артерий и вен, бронхиальная астма, индивидуальная непереносимость препаратов, недавно перенесенные инфекционные заболевания, прием иммуностимулирующих препаратов. Контрольные значения иммунологических, биохимических, флоуметрических показателей были получены на группе из 25 практически здоровых добровольцев (5 группа) (табл. 2). Методы обследования больных включали осмотр пациентов с проведением регистрации клинической симптоматики, проб Оппеля, Коллинза-Виленского, Гольдфлама, изменение интенсивности чувства боли при сдавлении стопы, определение поверхностной температуры стопы. Инструментальные исследования были представлены реовазографией (Рео-Спектр НС 005, Нейрософт, Россия), ультразвуковой доплерографией (ALOKA-4000, Япония), лазерной доплеровской флоуметрией (ЛАКК-02, НПП “ЛАЗМА”, г. Москва), транскутанной оксиметрией («TСM 2», RADIOMETER, Дания). Оценивали среднее систолическое давление на уровне лодыжки или в первом межпальцевом промежутке и его отношение к систолическому давлению на плече – лодыжечно-плечевой индекс. Доплерометрически на ПББА и ЗББА определяли полуколичественные и количественные показатели регионарной внутрисосудистой гемодинамики: индекс периферического сопротивления; пульсационный индекс; пиковая систолическая скорость; средняя диастолическая скорость; усредненная во времени максимальная скорость кровотока; объемная скорость кровотока. Показатели локальной микроциркуляции исследовались с помощью реовазографии (до и после нитроглицериновой пробы) и лазерной доплеровской флоуметрии при проведении окклюзионной пробы (Куропаткин А.И., Сидоров В.В., 2005). Клиническую эффективность лечения оценивали по разработанному ранее на базе Курского государственного медицинского университета способу (Лазаренко В.А. и др., 2005). Таблица 2 ^
^ В работе фенотип лимфоцитов определялся методом иммунофлюоресцентного анализа с помощью моноклональных антител (ООО «Сорбент», г. Москва) к структурам CD3 (общие Т-лимфоциты), CD4 (Т-хелперы), CD8 (цитотоксические клетки), CD16 (NK-клетки), CD95 (индукторный фактор апоптоза), CD22 (В-лимфоциты). Содержание IgG, IgM, IgA в плазме крови методом радиальной иммунодиффузии по Манчини, используя диагностический набор ООО НПЦ «Медицинская иммунология» (г. Москва). Концентрацию циркулирующих иммунных комплексов в плазме крови определяли спектрофотометрическим методом по V. Haskova (1977). Количественная оценка уровней ФНО-α, ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-4, ИЛ-10, интерферона-α, интерферона-γ, С3, С4-компонентов системы комплемента, С1-ингибитора и фактора Н проводилась с помощью тест-систем (ООО «Цитокин», г. Санкт-Петербург) методом твердофазного иммуноферментного анализа. ФМА нейтрофилов, интенсивность ПОЛ, активность ферментов антиоксидантной защиты плазмы крови, сорбционные свойства эритроцитов оценивали по методикам, использованным в экспериментальной части работы. ^ Статистическую обработку результатов исследования проводили путем вычисления средней арифметической и ошибки средней (M±m). Гипотеза о нормальности распределения признаков внутри группы проверялась с использованием критериев Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова. Однородность групповых дисперсий проверялась с помощью критерия Ливиня. Достоверность статистических различий средних арифметических величин оценивалась при множественных сравнениях – с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA): критериев Ньюмена-Кейлса, Стьюдента с поправкой Бонферрони; Крускала-Уоллиса; при парных сравнениях – с использованием критериев Стьюдента, Манна-Уитни и Уилкоксона. Корреляционные взаимосвязи устанавливали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Сопряженность номинальных, порядковых переменных выявляли, применяя критерии χ2 Пирсона, Фишера. Статистически значимыми считали различия с p<0,05. ^ Гепатопротекторные, антиоксидантные и иммуномодулирующие эффекты мексикора и фосфоглива в условиях острого ишемического поражения печени. Двадцатиминутное пережатие ГДС приводило к развитию цитолитического синдрома, проявлявшегося резким увеличением активности трансаминаз (АСТ, АЛТ), ГГТП, билирубина. Максимальный подъем исследуемых показателей происходил на 5-е сутки после ишемического воздействия. Биохимические проявления цитолитического синдрома наблюдались в течение 15 суток после пережатия ГДС и коррелировали с сохранявшейся в эти же сроки стойкой иммуносупрессией и активацией ПОЛ в гепатоцитах. Выраженность и продолжительность синдрома гепатодепрессии была незначительной: к 5-м суткам отмечалось достоверное снижение концентрации фибриногена в 1,3 раза, ПТИ и общего белка 1,3 и 1,2 раза соответственно. Однако уже к 10-м суткам показатели не отличались от контрольных, за исключением уровня фибриногена. Острая тридцатиминутная ишемия печени приводила к развитию синдромов цитолиза, холестаза и гепатодепрессии, активации ПОЛ, возникновению вторичной иммуносупрессии, росту уровня мочевины, сохранявшимся на протяжении 15-20 суток после пережатия ГДС. К тридцатым суткам после операции происходила полная нормализация метаболических нарушений, возникающих вследствие острой ишемии печени (табл. 3). Максимальные изменения П  римечание: определение иммунологических и биохимических показателей проведено в лаборатории иммуноферментного анализа НИИ Экологической медицины Курского государственного медицинского университета и клинической лаборатории МУЗ ГКБ №4 г. Курска, за что выражаем сотрудникам соответствующих подразделений глубокую признательность.Т  аблица 3Динамика показателей иммунной реактивности, цитолитического, холестатического, гепатодепрессивного синдромов и ПОЛ в гепатоцитах при тридцатиминутной ишемии печени (М±m)
^ Здесь и в последующих таблицах: * - достоверность различий средних арифметических величин, р<0,05; цифры рядом со звездочкой обозначают по отношению к показателю какой группы эти различия достоверны. всех изучаемых показателей наблюдались в первые пять суток, при этом их абсолютные значения превышали аналогичные при двадцатиминутной ишемии печени. Таким образом, увеличение в 1,5 раза длительности ишемического воздействия на гепатоциты сопровождалось более выраженными иммунометаболическими нарушениями, что коррелировало с морфологическими перестройками, наблюдавшимися при гистологическом исследовании: в первые пять суток отмечалось расширение площади печеночной паренхимы с дистрофическими и некробиотическими изменениями и прогрессирующее углубление расстройств кровотока, усиление интерстициального отека. При нарастающей дискомплексации долек в зоне триад, в центральных зонах печеночных долек происходили разрывы стенок портальных и центральных вен. Цитоплазма гепатоцитов набухала, выявлялось сочетание гидропической, зернистой дистрофии и липоидоза. К пятым суткам в гепатоцитах практически отсутствовали ШИК-позитивные гранулы, появлялись отдельные клетки с явлениями коагуляционного некроза, а между печеночными балками и дольками появлялось большое количество лейкоцитов. На десятые сутки в препаратах встречались участки мостовидных некрозов, очаговая лейкоцитарная инфильтрация. К пятнадцатым суткам происходило появление ШИК-позитивных гранул в гепатоцитах, отмечалась организация некротических очагов. На двадцатые сутки увеличивалось количество ШИК-положительных веществ, формировались большие участки гидропической и зернистой дистрофии. В условиях двадцатиминутного ишемического поражения печени мексикор и фосфоглив независимо друг от друга предотвращали развитие нарушений иммунометаболического гомеостаза, при этом, снижая летальность к пятым суткам с 17 до 9% (p<0,05). Однако при тридцатиминутном пережатии ГДС изолированное применение изучаемых препаратов было не столь эффективным. Введение мексикора к пятым суткам после тридцатиминутной ишемии печени стимулировало развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа, уменьшало выраженность нарушений функционально-метаболической активности нейтрофилов и интенсивность ПОЛ в гепатоцитах: количество АОК в селезенке, РМЛ, ФРН и ИАФ увеличивались в 2,9; 2,2; 1,8 и 4,1 раза, а содержание ДК и МДА в ткани печени снижалось в 1,8 и 1,9 раза соответственно по сравнению с группой животных, которые не получали препарат, однако полной нормализации изучаемых показателей не отмечалось. Иммуномодулирующие и антиоксидантные эффекты фосфоглива были достоверно менее выраженными, по сравнению с мексикором (табл. 4). Мексикор у животных с ишемией печени уменьшал выраженность биохимических синдромов цитолиза, холестаза и гепатодепрессии: отмечалась нормализация содержания общего белка, холестерина, бета-ЛП, мочевины, активности ЩФ; достоверно снижался уровень билирубина в 1,9 раза и активность АСТ, АЛТ, ГГТП в 3,1; 2,2 и 2,8 раза соответственно, повышался протромбиновый индекс в 1,3 раза и содержание фибриногена в 1,5 раза по сравнению с группой животных, которые не получали препарат. Фосфоглив корригировал, но не нормализовал ни один из биохимических показателей, уступая в Т  аблица 4Влияние мексикора и фосфоглива на состояние иммунометаболического гомеостаза в условиях тридцатиминутной ишемии печени (пятые сутки) (М±m)
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям