Биохимическая характеристика конденсата выдыхаемого воздуха у телят в норме и при респираторной патологии 03. 00. 04 биохимия
|
|
Скачать 465.52 Kb.
|
|
На правах рукописи ЧЕРНИЦКИЙ АНТОН ЕВГЕНЬЕВИЧ БиохимическАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА конденсата выдыхаемого воздуха у телят в норме и при респираторной патологии 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Воронеж-2009 Работа выполнена в отделе патобиохимии и патофизиологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН. Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор ^ � Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Артюхов Валерий Григорьевич кандидат биологических наук Алёхин Юрий Николаевич Ведущая организация: ^ медицинская академии им. Н.Н. Бурденко Защита состоится «25»декабря 2009 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета ДМ 006.004.02 в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН (394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114-б). С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН. Автореферат разослан «__»__________ 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Г.Н. Близнецова ^ Актуальность проблемы. Респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота занимают одно из ведущих мест в общей заболеваемости сельскохозяйственных животных, уступая лишь желудочно-кишечным заболеваниям (Аликаев В.А., 1986; Абрамов С.С., 1989; Красочко П.А., 1997; Грибко С.М., 1998 и др.) и наносят огромный ущерб сельскохозяйственному производству, являясь одной из причин высоких затрат на лечение, снижения продуктивности, вынужденного убоя и падежа телят (Красочко П.А., 1997; Шахов А.Г. с соавт., 2000; Пахмутов В.М. с соавт., 2006 и др.). Структурные изменения в органах дыхательной системы, сопровождающие развитие респираторной патологии, предваряются изменением интенсивности биохимических процессов, в частности, свободнорадикального окисления, представляющего собой универсальное неспецифическое звено развития патологии органов дыхания (Зенков Н.К. с соавт., 2001; Kharitonov S.A., Barnes P.J., 2001; Wood L.G. et al., 2003). При респираторных заболеваниях, сопровождающихся воспалением бронхов и паренхимы легких, изменяются биохимические свойства бронхоальвеолярной жидкости, которая содержит в своем составе, как нелетучие, так и более 200 испаряющихся веществ (Гельцер Б.И. с соавт., 2000; Анаев Э.Х., Чучалин А.Г., 2002), определение которых используется в медицине для ранней диагностики и прогнозирования развития респираторных заболеваний, а также для слежения за динамикой их течения (Kharitonov S.A., Barnes P.J., 2001; Mutlu G.M. et al., 2001). Состав конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ) отражает изменения, которые происходят в составе бронхоальвеолярной жидкости (Бестужева С.В., 1985; Яковлева О.А., 1990; Гельцер Б.И. с соавт., 2000; Mutlu G.M. et al., 2001; Hunt J., 2002). Поэтому большинство маркеров респираторных заболеваний, определяемых в бронхоальвеолярной жидкости, могут быть идентифицированы и в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ), исследование которого в настоящее время все шире используется в медицине для оценки функционального состояния дыхательной системы, диагностики респираторных заболеваний и оценки эффективности проводимого лечения (Анаев Э.Х., Чучалин А.Г., 2006; Kharitonov S.A., Barnes P.J., 2001). Однако на сегодняшний день данных о биохимическом исследовании конденсата выдыхаемого воздуха у сельскохозяйственных животных крайне мало (Reinhold P. et al., 1999, 2000), а в отечественной ветеринарной медицине подобные исследования практически не проводились, отсутствуют и сведения о возможности использования КВВ для ранней диагностики респираторной патологии у продуктивных животных. Это и определило общую направленность работы, выбор методологических подходов и экспериментальных моделей. ^ Основной целью данного исследования являлось изучение биохимического состава конденсата выдыхаемого воздуха, определение биохимических показателей, пригодных для диагностики и раннего прогнозирования патологии респираторного тракта и разработка метода ранней диагностики бронхолегочной патологии у телят. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: – изучить показатели, характеризующие метаболический и оксидантно-антиоксидантный статус здоровых телят и телят, больных субклиническим трахеобронхитом; – изучить влияние внутривенного введения раствора пероксида водорода на функциональное состояние респираторной системы, метаболический и оксидантно-антиоксидантный статус телят. – разработать способ ранней диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят при субклиническом течении респираторных заболеваний; – разработать устройство и способ получения конденсата выдыхаемого воздуха и изучить возрастную динамику биохимического состава КВВ у телят; – изучить биохимические параметры КВВ телят, больных субклиническим трахеобронхитом; – провести сравнительное изучение биохимических параметров конденсата выдыхаемого воздуха у здоровых и телят с клинически выраженной респираторной патологией; – изучить показатели конденсата выдыхаемого воздуха и крови, характеризующие метаболический и оксидантно-антиоксидантный статус телят при субклиническом трахеобронхите; – определить наиболее информативные биохимические показатели конденсата выдыхаемого воздуха, пригодные для ранней диагностики и прогнозирования респираторных заболеваний у телят. ^ Впервые в отечественной ветеринарной медицине разработана методика получения конденсата выдыхаемого воздуха у телят и изучена возрастная динамика его биохимического состава. Показана взаимосвязь показателей пероксидного окисления липидов, антиоксидантной системы и системы оксида азота в крови и КВВ телят в норме и при патологии респираторной системы. Даны качественные и количественные характеристики ряда соединений, отражающих повреждение дыхательных путей, воспалительные изменения и нарушения тканевых биохимических процессов. Впервые проведено исследование конденсата выдыхаемого воздуха у телят при субклиническом трахеобронхите и определены наиболее информативные показатели КВВ для диагностики респираторной патологии. Разработан способ определения воспалительного процесса в органах дыхания у телят для выявления субклинического течения трахеобронхита, основанный на внутривенном применении раствора пероксида водорода. Новизна проведенных исследований подтверждена положительным решением о выдачи патента РФ на изобретение «Способ ранней диагностики трахеобронхита у телят» по заявке № 2008124214/13(029363) от 08.07.2009. Практическая значимость. На основе анализа конденсата выдыхаемого воздуха определены и предложены критерии оценки состояния дыхательной системы и раннего прогнозирования возможности развития респираторных заболеваний у телят. Разработан способ, позволяющий диагностировать наличие воспалительного процесса в трахее и бронхах у телят на самых начальных стадиях, еще до клинического проявления трахеобронхита, что может быть использовано в ветеринарной практике для ранней диагностики и прогнозирования риска развития респираторной патологии у молодняка крупного рогатого скота. ^ Основные результаты исследований были представлены на Первом съезде ветеринарных фармакологов России (Воронеж, 2007), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях» (Воронеж, 2008); XII Международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2008); Международной научно-практической конференции «Образование, наука, практика: инновационный аспект» (Пенза, 2008). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ: 6 статей и 2 тезиса докладов, в том числе 2 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК. ^ Диссертация изложена на 203 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и практических предложений. Список использованной литературы содержит 445 источников, из них 144 отечественных и 301 иностранных. Иллюстративный материал включает 7 рисунков, 2 фотографии и 22 таблицы. ^ 1. Состояние оксидантно-антиоксидантного статуса и системы оксида азота у телят при субклиническом трахеобронхите. 2. Использование внутривенного введения раствора пероксида водорода для выявления субклинического течения респираторных заболеваний у телят. 3. Биохимические параметры конденсата выдыхаемого воздуха и крови, характеризующие метаболический и оксидантно-антиоксидантный статус у здоровых телят и при субклиническом трахеобронхите. 4. Биохимические показатели конденсата выдыхаемого воздуха, наиболее информативные для ранней диагностики и прогнозирования респираторных заболеваний у телят. ^ Работа выполнена в отделе патобиохимии и патофизиологии государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельскохозакадемии в 2006-2009 гг. в соответствии с планом НИР по теме 08.04.01 «Разработать методы ранней диагностики, эффективные средства и способы профилактики и лечения массовых незаразных и вызываемых условно-патогенными микроорганизмами заболеваний у молодняка высокопродуктивных животных» (№ гос. регистрации 15070.3666026906.06.8.001.2). Исследования проведены совместно с сотрудниками отдела клинической биохимии А.И. Золотаревым, Г.Н. Близнецовой, Т.Г. Ермоловой, отдела физико-химических методов исследований В.И. Шушлебиным и Г.Г. Чусовой и отдела микробиологии, вирусологии и иммунологии А.Г. Шаховым и Ю.Н. Бригадировым ГНУ ВНИВИПФиТ РАСХН, за что автор выражает им благодарность. Таблица 1 Схемы основных опытов
Опыты проведены в производственных условиях животноводческого хозяйства ОАО «Воронежпищепродукт» Новоусманского района Воронежской области на 162 телятах (табл.1). На протяжении всех опытов за телятами велось постоянное клиническое наблюдение: учитывалось состояние слизистой оболочки, мышечного тонуса, рефлекторной возбудимости, сосательного рефлекса, появление уверенной позы стояния, количество резцов, регистрировалась температура тела, частота сердечных сокращений и дыхательных движений. Для выявления телят с субклиническим трахеобронхитом применяли пальпацию последнего трахеального кольца (Золотарев А.И. с соавт., 2008) и внутривенное введение 0,6% раствора пероксида водорода на 0,9% растворе хлорида натрия в дозе 0,4 мл/кг массы тела. При этом регистрировали реакцию телят на введение 0,6% раствора пероксида водорода, определяли температуру тела, количество дыхательных движений, чувствительность гортани и трахеи, наличие или отсутствие одышки, носовых истечений, кашля, хрипов, чувствительности последнего трахеального кольца. Для исследования использовали стабилизированную гепарином венозную кровь, полученную из яремной вены животных в одинаковые промежутки времени в утренние часы до кормления. Конденсат выдыхаемого воздуха у животных получали по разработанной нами методике в утренние часы до кормления. Кровь и конденсат выдыхаемого воздуха транспортировали в сосудах с тающим льдом при температуре 0-4 С в течение одного часа после его взятия. При необходимости кровь, сыворотку крови и конденсат выдыхаемого воздуха замораживали и хранили при температуре –20С. Содержание в сыворотке крови и конденсате выдыхаемого воздуха глюкозы, холестерина, креатинина, мочевины, кальция, неорганического фосфора, активность -глутамилтрансферазы (-ГТТ), аспартат- (АсАТ) и аланинтрансферазы (АлАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ) определяли на биохимическом анализаторе «Hitachi-902» (Япония), содержание в крови цинка, меди, марганца, железа – на атомно-адсорбционном спектрофотометре «Perkin Elmer» модель 703 (США). В ряде опытов активность -ГТТ определяли с помощью наборов фирмы «Vital Diagnostic» (Россия). Для оценки интенсивности процессов пероксидного окисления липидов, состояния системы антиоксидантной защиты и интенсивности синтеза оксида азота у телят в крови и КВВ определяли: содержание малонового диальдегида (мкМ/л), содержание диеновых конъюгатов (ДК) (Е232/Е220) и кетодиенов (Е278/Е220) (Камилов Ф.Х. с соавт.,1999), активность каталазы (мкМ Н2О2/лмин) и глутатионпероксидазы (мМ восстановленного глутатиона/лмин) с использованием в качестве субстрата пероксида водорода, восстановленного глутатиона (мкМ/л) (Бузлама В.С. с соавт., 1997), супероксиддисмутазы (усл.ед./мг Hb) (Сирота т.в., 1999); содержание стабильных метаболитов оксида азота (мкМ/л) (Близнецова Г.Н. с соавт., 2002), S-нитрозотиолов (нМ/л) (Kubes P. et al., 1999; Moore K.P., Mani A.R., 2002), ферроксидазную активность церулоплазмина (мкМ бензохинона/лмин) (Антонов М. П. с соавт., 1985). Индекс эндогенной интоксикации (ИЭИ) рассчитывали в усл. ед. по содержанию в сыворотке крови веществ низкой и средней молекулярной массы (Гребнева О.Л. с соавт., 2006). Сорбционную способность эритроцитов (%) определяли по степени поглощения красителя метиленового синего эритроцитарной массой (Тогайбаев А.А. с соавт., 1988). Каждую пробу исследовали в 3-х аналитических повторностях. Обработку экспериментальных данных проводили методами математической статистики, принятыми в биологии и медицине, с использованием компьютерных прикладных статистических программ «Statistica 5.0» (Stat Soft Inc., 1998) и «Microsoft Excel» на РС IBM «Pentium IV». Достоверность различий оценивали методом парных сравнений, используя t-критерий Стъюдента. Статистически достоверными считали различия при уровне значимости р<0,05 (Лакин Г.Ф., 1990; Гельман В.Я., 1999). ^ 3.1. Оксидантно-антиоксидантный статус и состояние системы оксида азота у телят при субклиническом и клинически выраженном трахеобронхите Результаты проведенных исследований показали, что содержание малонового диальдегида в крови у телят, больных субклиническим трахеобронхитом в 1,36 раза (р<0,05) выше чем у здоровых животных (табл. 2). Таблица 2 Состояние системы ПОЛ-АОЗ в крови телят при субклиническом трахеобронхите
Примечание: * - р1-2,3 < 0,05; ▲ - р2-3 < 0,05 Повышение концентрации вторичных продуктов ПОЛ при неизменной активности основных биоантиоксидантов крови у телят, больных субклиническим трахеобронхитом, косвенно может указывать на повышенное образование активных форм кислорода. У телят с субклиническим трахеобронхитом в крови была статистически достоверно выше активность каталазы на 11,8% и глутатионпероксидазы – на 12,1%. Отмечена тенденция повышения активности СОД. Наиболее высокая положительная линейная взаимосвязь существует между каталазой и ГПО (r=+ 0,89, р<0,05), что вероятно связано с идентичностью субстрата (н2О2) для каталазы и селензависимой ГПО. С развитием клинических признаков трахеобронхита у больных телят происходило значительное снижение мощности ферментативного звена системы антиоксидантной защиты. Так, при клинически выраженном трахеобронхите активность СОД в крови у больных телят составляла всего 69,3% (р<0,05) от таковой у здоровых животных, а активность каталазы снижалась на 10,4% по сравнению со здоровыми и почти на 20,0% по сравнению с телятами с субклиническим течением трахеобронхита. В тоже время при клинически выраженном трахеобронхите активность ГПО в крови у телят по сравнению со здоровыми животными и телятами с субклиническим трахеобронхитом статистически достоверно не отличалась, хотя имела стабильную тенденцию к понижению. Ферроксидазная активность церулоплазмина крови телят при клинически выраженном трахеобронхите также снижалась, как по сравнению со здоровыми животными (на 26,5%, р<0,01), так и телятами с субклиническим течением заболевания (на 28,6%, р<0,01). С развитием симптомокомплекса трахеобронхита возникает отрицательная линейная взаимосвязь между СОД и каталазой (r = –0,67, р<0,05). У телят с клинически выраженным трахеобронхитом в парах СОД-ГПО и каталаза-ГПО статистически достоверных зависимостей не установлено, что свидетельствует об истощении функционального потенциала системы АОЗ. Это приводит к тому, что при клиническом проявлении трахеобронхита у телят уровень МДА в крови повышается у здоровых животных в 1,57 раза (р<0,01), и на 16,1 % - у телят с субклиническим трахеобронхитом. Между уровнем стабильных метаболитов оксида азота (NOx) в сыворотке крови у телят, больных субклиническим трахеобронхитом, и у здоровых животных статистически достоверных различий не установлено (табл. 3). Таблица 3 Содержание стабильных метаболитов оксида азота и S-нитрозотиолов в сыворотке крови у телят
Примечание: * - р < 0,05 по сравнению со здоровыми С развитием симптомокомплекса трахеобронхита, уровень NOx в сыворотке крови у телят возрастал до 82,4 ± 2,01 мкМ/л, или на 26,8% (р<0,05), по сравнению со здоровыми и на 20,3% (р<0,05) - по сравнению с телятами с субклиническим течением заболевания. Считается, что стабилизация оксида азота в форме S-нитрозотиолов может предотвращать локальную инактивацию NO, что позволяет переносить биологическое действие оксида азота на цели, отдаленные от места его образования (Stamler J.S. et al., 1992; Wink D.A. et al., 1996; Rassaf T. et al., 2002). Установлено, что содержание S-нитрозотиолов в сыворотке крови у телят, больных субклиническим трахеобронхитом, по сравнению со здоровыми было в 2,75 раз (Р<0,05) ниже. При этом между уровнем S-нитрозотиолов и NOx в сыворотке крови телят установлено наличие отрицательной корреляции (r = –0,74, P < 0,05), хотя по данным некоторых авторов (Feelisch M. et al., 2002) существует прямая зависимость между уровнем NO и содержанием S-нитрозотиолов в биологических жидкостях. Снижение уровня S-нитрозотиолов в сыворотке крови у телят при субклиническом трахеобронхите, по всей вероятности, указывает на истощение депо оксида азота в форме S-нитрозотиолов вследствие развития оксидативного стресса и воспаления в органах дыхательной системы. ^ При клиническом исследовании возможно выявление трахеобронхита у телят путем пальпации первого трахеального кольца. В случае повышенной чувствительности трахеи при воспалении это провоцирует у животных появление кашлевой реакции (Беляков И.М., 1975; Сноз Г.В., 2006). Однако повышенная чувствительность первого трахеального кольца и всей трахеи регистрируется лишь при выраженном трахеите и бронхите (сухой или влажный кашель, жесткое везикулярное дыхание, хрипы, экспираторная одышка и т.д.). Определение чувствительности трахеи пальпацией последнего трахеального кольца, предложенное Золотаревым А.И. с соавт. (2008), позволяет диагностировать трахеобронхит на более ранних этапах течения болезни, однако не дает возможности выявлять воспалительный процесс в нижележащих участках трахеи и бронхах. Основываясь на том, что в концентрациях, превышающих физио-логические, Н2О2 и ОН вызывают преобладающую контрактацию трахеи и бронхов (Olafsdóttir K. et al., 1991; Bannenberg G. et al., 1993 и др.), что при повышении чувствительности слизистой оболочки вследствие воспаления может проявляться в виде кашлевой реакции, нами разработан способ ранней диагностики субклинического трахеобронхита путем внутривенного введения клинически здоровым животным 0,6% раствора пероксида водорода на 0,9% растворе хлорида натрия в дозе 0,4 мл/кг массы тела. Для этого было отобрано 40 телят 1-1,5-месячного возраста, из них 14 с клинически выраженным трахеобронхитом (1 группа) и 26 клинически здоровых телят. Всем телятам внутривенно вводили раствор пероксида водорода в дозе 0,4 мл/кг массы тела. По характеру реакции на введение Н2О2 телята этой группы были разделены на две (2-я и 3-я группы). У телят с симптомокомплексом трахеобронхита (1-я группа), как при пальпации первого и последнего трахеального колец, так и при внутривенном введении раствора H2O2 отмечался кашель (от 3 до 9 кашлевых толчков) с выделением мокроты. У них сразу или через 1-2 минуты после введения раствора H2O2 происходило учащение дыхания и регистрировались первые кашлевые толчки. Кашель с выделением мокроты продолжался от 7 до 16 мин (в среднем 11,0±0,93 мин). Через 16,2±0,89 мин частота дыхательных движений возвращалась к исходным значениям. Как видно из данных, представленных в таблице 4, у клинически здоровых телят (2-я группа) температура тела, частота дыхательных движений и сердечных сокращений, а также чувствительность последнего кольца трахеи при пальпации по сравнению с клинически здоровыми телятами 3-й группы статистически достоверно не отличались. Таблица 4 Результаты клинического исследования телят
Примечание: * - р < 0,05 - 0,001 по сравнению с телятами 3-й группы У телят 2-й группы введение раствора Н2О2, вследствие повышения концентрации Н2О2 выше некоторого «порогового» значения, вызывало преобладающую контрактацию трахеи и бронхов, что, на фоне повышения чувствительности слизистой оболочки на самых начальных стадиях воспаления, провоцировало кашлевую реакцию. Телята этой группы на пальпацию последнего трахеального кольца реагировали в среднем только через 4,2±0,37 суток после выявленной кашлевой реакции на введения раствора Н2О2. У телят 3-й группы внутривенное введение того же количества Н2О2 не вызывало кашлевой реакции, поскольку дополнительное введение Н2О2 в кровяное русло, по всей вероятности, не приводило к превышению физиологической концентрации Н2О2 и, следовательно, не вызывало контрактации трахеи. Установлено, что метод пальпации последнего трахеального кольца позволяет определять повышение чувствительности слизистой оболочки трахеи и бронхов в среднем за 3,8±0,17 суток до развития клинических признаков трахеобронхита. Таблица 5 Сроки выявления чувствительности верхних отделов респираторного тракта на введение Н2О2 и пальпацию последнего трахеального кольца у телят (n=10)
В тоже время внутривенное введение 0,6% раствора пероксида водорода в дозе 0,4 мл/кг массы тела позволяет диагностировать повышение чувствительности верхних отделов респираторного тракта за 8,0±0,30 суток до развития симптомокомплекса трахеобронхита, то есть в среднем на 4,2±0,37 суток раньше, чем при пальпации последнего трахеального кольца. У здоровых телят концентрация МДА в крови после введения раствора Н2О2 достоверно не изменялась. В тоже время у телят с субклиническим трахео-бронхитом через 48 часов после введения 0,6% раствора Н2О2 концентрация МДА в крови снижалась по сравнению с фоном на 16,9% (р<0,05) (табл. 6). Таблица 6 Состояние системы ПОЛ-АОЗ в крови у телят после введения 0,6% Н2О2
Примечание: * - р < 0,05 – 0,01 по сравнению с исходным фоном до введения Н2О2 Анализ компонентов ферментативного звена системы АОЗ показал, что внутривенное введение раствора Н2О2 существенно не влияет на активность СОД и ГПО в крови телят. При этом у телят, больных субклиническим трахеобронхитом, активность каталазы крови начинала повышаться уже через 1 час после введения раствора Н2О2, а через 48 часов достигала своего максимума. У здоровых телят через 48 часов после введения раствора Н2О2 активность каталазы в крови по сравнению с исходным фоном достоверно не изменялась. У телят с субклиническим трахеобронхитом активность каталазы повышалась на 27,1% (Р<0,05), вероятно, за счет субстратной индукции фермента (Ланкин В.З. с соавт., 2001). Ферроксидазная активность церулоплазмина крови после введения раствора Н2О2 у телят обеих опытных групп по сравнению с фоном не изменялась. Через 48 часов после введения раствора Н2О2 в сыворотке крови телят с субклиническим трахеобронхитом снижалась на 31,9% концентрация мочевины (р<0,05) и на 17,3% ИЭИ (р<0,05). При этом повышался до оптимальных значений уровень глюкозы в крови, и несколько снижалась ССЭ – по сравнению с исходным фоном на 4,0 % (Р<0,05). Таким образом, введение 0,6% раствора пероксида водорода в дозе 0,4 мл/кг массы тела позволяет диагностировать повышение чувствительности слизистой оболочки трахеи и бронхов на самых начальных стадиях воспаления за 8,0±0,30 суток до развития симптомокомплекса трахеобронхита, то есть в среднем на 4,2±0,37 суток раньше, чем методом пальпации последнего трахеального кольца. ^ Результаты наших исследований показали, что использование конденсирующих систем со стеклянными контейнерами, рекомендуемых некоторыми авторами (Анаев Э.Х., Чучалин А.Г., 2002; Hunt J., 2002), для получения конденсата выдыхаемого воздуха у телят в условиях хозяйства нецелесообразно из-за непредсказуемости поведения животного во время процедуры получения КВВ и хрупкости материала контейнера. Для получения КВВ у животных больше подходят контейнеры из полипропилена (Анаев Э.Х. и Чучалин А.Г., 2002). Эти особенности были учтены нами при разработке системы для получения КВВ у телят. Разработанное и сконструированное устройство для получения КВВ у телят включает: 1) полипропиленовый контейнер-накопитель; 2) внешний контейнер со льдом; 3) маску с системой клапанов; 4) силиконовую трубку, соединяющую выдыхательный клапан с контейнером-накопителем (рис.1). У опытных телят при помощи сконструированного нами устройства собирали по три порции КВВ с интервалом в 30 минут (рис. 2).
Установлено, что средний объем КВВ, образующийся при спокойном равномерном дыхании телят в течение 15 минут, равен 1,8±0,5 мл (1,5-2,5 мл), коэффициент вариации составил 29-32%. Средний объем выдыхаемого воздуха за 15 минут составил 119,0±15,5 л (112-125 л, при 95% доверительном интервале) (табл.7). Таблица 7 Объем КВВ, взятого у телят в 3-х последовательных повторностях
Соотношение между объемом собранного КВВ и объемом выдыхаемого воздуха выражалось следующим уравнением: Vквв (мл) = 0,013×Vвыдых. возд..(л) + 0,255 (r = +0,65, р<0,01) Результаты исследований показали, что требуется, по крайней мере, 15 минут и приблизительно 120 л воздуха, чтобы собрать КВВ в объем, превышающий 1,5 мл, который достаточен для проведения анализов и определения физических (pH) и некоторых биохимические показателей. ^ Исследования проведены на клинически здоровых телятах, у которых получали КВВ в возрасте 1, 2, 3, 7, 15 и 30 суток по разработанной нами методике. Установлено, что в КВВ определяются некоторые метаболиты и активность ряда ферментов, но в количествах значительно более низких, чем в крови, и их содержание в КВВ после рождения значительно возрастает (табл.8). Таблица 8 Содержание ряда метаболитов в КВВ и сыворотке крови здоровых телят (n=18)
Примечание: в числителе – показатели КВВ, в знаменателе – сыворотки крови *- р < 0,05 - 0,001 по сравнению с уровнем в суточном возрасте. Выявлена различная возрастная динамика суммы стабильных метаболитов оксида азота (NOx) в крови и КВВ. Если в сыворотке крови клинически здоровых животных их уровень снижается к месячному возрасту по сравнению с первыми сутками после рождения более чем в 7 раз, то в КВВ – существенно не изменяется. Изменение активности ЩФ и -ГГТ в КВВ у здоровых телят (табл. 9), также как и в сыворотке крови (особенно в 1-2-е сутки жизни), связано, вероятно, со всасыванием этих макромолекулярных белков из молозива. При этом активность АсАТ и АлАТ существенно не изменяется до 2-недельного возраста и заметно увеличивается только в 30-суточном возрасте, что, может быть связано с интенсификацией процессов глюконеогенеза (Ferre P., Williamson D., 1978). Таблица 9 Активность ферментов в КВВ и сыворотке крови клинически здоровых телят, Е/л, (n=18)
Примечание: в числителе – показатели КВВ, в знаменателе – сыворотки крови * - р < 0,05 - 0,001 по сравнению с уровнем в суточном возрасте. ^ Установлено, что у телят, с клиническими признаками трахеобронхита, содержание глюкозы по сравнению со здоровыми уменьшалось в сыворотке крови на 64,4% (р<0,01), в – КВВ на 37,5% (р<0,05) (табл. 10). Корреляционный анализ показал наличие между уровнем глюкозы в КВВ и в сыворотке крови телят статистически достоверной прямой линейной взаимосвязи (r = +0,79, р<0,05). У больных телят отмечалась тенденция к повышению содержания мочевины в КВВ, что может указывать на развитие дистрофических процессов и нарушение микроциркуляции в слизистой оболочке бронхов вследствие воспаления (Соляник Е.В., 1996; Хасина М.А., 2004). Концентрация кальция в КВВ и сыворотке крови больных телят в сравнении с клинически здоровыми достоверно не изменялась, а неорганического фосфора повышалась в КВВ в 5,1 раза, в крови – на 27,2% (р<0,05). Активность определяемых ферментов в большинстве проб КВВ была выше границы обнаружения только для γ-ГГТ и АлАТ. Активность ЩФ и АсАТ удалось определить менее чем в 30% проб КВВ. Активность АлАТ как в КВВ, так и в сыворотке крови достоверно не изменялась. Если в крови отмечалась только тенденция к повышению активности γ-ГТ, то в КВВ у больных телят она достоверно возрастала в 3,36 раза (р<0,05). По мнению Хасиной М.А. и соавт. (2004), повышение активности ферментов различной субклеточной локализации (цитоплазматических – АлАТ и ЛДГ, мембраносвязанных – ЩФ и -ГТ, митохондриальной АсАТ) в КВВ при неспецифических заболеваниях легких отражает степень структурно-функционального повреждения клеток респираторного тракта (от нарушения проницаемости мембран до цитолиза) и связано выходом этих компонентов в бронхоальвеолярную жидкость. Таблица 10 Некоторые метаболиты и активность ферментов, определяемых в КВВ и сыворотке крови телят
Примечание: в числителе – показатели КВВ, в знаменателе – сыворотки крови * - р < 0,05 – 0,001 по сравнению с клинически здоровыми животными. ** - активность (концентрация) выше границы обнаружения менее чем в 30% проб. Результаты исследований показывают, что активность мембраносвязанной γ-ГТ в КВВ может быть использована в качестве маркера воспалительного процесса в органах дыхательной системы у телят. Содержание веществ низкой и средней молекулярной массы (ИЭИ) в крови у больных телят увеличивалось на 29,3% (р<0,01), в то время как в КВВ остается без существенных изменений. Установлено, что содержание диеновых конъюгатов и кетодиенов в КВВ у больных и клинически здоровых телят статистически достоверно не отличалось (табл.11). В тоже время характер изменений содержания МДА в КВВ и в крови у телят с респираторной патологией имел разную направленность. Так, если в крови у больных телят отмечалась тенденция к повышению содержания МДА, то в КВВ концентрация МДА снижалась в 1,87 раза (р<0,001) по сравнению с клинически здоровыми животными (табл. 10). Корреляционный анализ показал, что между содержанием МДА в КВВ и крови у телят существует вероятная отрицательная линейная взаимосвязь (r = – 0,65, р<0,05). Таблица 11 Некоторые показатели системы ПОЛ-АОЗ, определяемые в КВВ и в крови телят
Примечание: в числителе – показатели в КВВ, в знаменателе – в крови * - р < 0,05 – 0,001 по сравнению с клинически здоровыми животными Результаты наших исследований показали, что содержание восстановленного глутатиона (GSH) в КВВ у клинически здоровых телят варьирует от 108,5 до 118,7 мкМ/л (в среднем 112,0±1,30 мкМ/л). У телят с респираторной патологией концентрация восстановленного глутатиона находилась в пределах от 104,6 до 109,2 мкМ/л, в среднем 108,0±0,71 мкМ/л, что ниже (р<0,05), чем у клинически здоровых животных. Ферроксидазная активность церулоплазмина и в КВВ, и в крови у больных телят по сравнению с клинически здоровыми животными статистически достоверно не отличалась. При патологии респираторного тракта в КВВ у телят происходит снижение содержания МДА и GSH. Полученные результаты согласуются с данными Игнатовой Г.Л. и соавт. (1998), которые указывают, что при обострении хронического бронхита отмечается снижение содержания продуктов ПОЛ в КВВ с одновременным падением антиоксидантной активности КВВ. В качестве интегрального показателя содержания NO и нитритов в КВВ и сыворотке крови у телят мы рассматривали сумму стабильных метаболитов оксида азота (NOх = NO2-+NO3-) (Близнецова Г.Н., 2004). Анализ полученных данных показал, что в сыворотке крови у больных телят содержание NOх возрастало по сравнению с клинически здоровыми животными на 17,5% (р<0,05) (рис. 3А), в то время как в КВВ уровень NOх уве-личивался в 3,61 раза (р<0,01) (рис. 3Б).
При этом повышение содержания NOх в КВВ у больных телят находилось в прямой зависимости от тяжести заболевания. Корреляционный анализ показал, что между содержанием NOх в КВВ и сыворотке крови у телят существует достаточно высокая положительная взаимосвязь (r = +0,74, р<0,05). Это свидетельствует о том, что повышение уровня NOх в КВВ у телят, по-видимому, связано с развитием явлений оксидативного стресса и воспаления в органах дыхательной системы, а результаты проведенных исследований указывают на возможность использования показателя содержания суммы стабильных метаболитов NO в КВВ в качестве маркера острого воспалительного процесса в органах дыхания у телят. ^ Установлено, что еще до развития клинических признаков патологии респираторного тракта, уже в возрасте 2-х суток у впоследствии заболевших телят (как правило, в 3-4-недельном возрасте) по сравнению с оставшимися здоровыми в КВВ в 1,53 раза была повышена активность АлАТ, в 1,64 раза – -ГТ, в 1,58 раза – ЩФ, в 2,47 раза – содержание холестерина, в 1,63 раза – кальция и в 1,57 раза – Noх (табл. 12). При этом в сыворотке крови не отмечалось существенных различий в активности ферментов и содержании метаболитов у оставшихся здоровыми и впоследствии заболевших телят. Более высокий уровень холестерина, активности ферментов различной субклеточной локализации (цитоплазматической АлАТ, мембраносвязанных – ЩФ и -ГТ) и уровня стабильных метаболитов оксида азота в КВВ у телят, предрасположенных к развитию респираторной патологии, по всей вероятности, связан со структурно-функциональным повреждением клеток респираторного тракта и выходом этих компонентов в бронхоальвеолярную жидкость (Хасина М.А. с соавт., 2004). В целом, изменения в составе КВВ свидетельствуют о начинающемся воспалительном процессе в слизистой оболочке трахеобронхиального дерева (Хасина М.А. соавт., 2004; Kharitonov S.A., Barnes P.J., 2001). Таблица 12 Биохимический состав КВВ у телят в 2-суточном возрасте
Примечание: *- р < 0,05 – 0,001 по сравнению с оставшимися здоровыми животными Концентрация глюкозы, мочевины, неорганического фосфора как в КВВ, так и в сыворотке крови у телят с субклиническим трахеобронхитом по сравнению со здоровыми животными достоверно не изменялась. У телят, с субклиническим трахеобронхитом, отмечалась тенденция к снижению концентрации кальция в КВВ, в то время как в сыворотке крови она оставалась без изменений. Полученные данные согласуются с результатами исследований Анаева Э.Х. и Чучалина А.Г. (2006), которые показали, что концентрация кальция в КВВ у здоровых людей выше, чем у пациентов с заболеваниями легких. Корреляционный анализ показал отсутствие статистически достоверной взаимосвязи между активностью γ-ГТ в КВВ и в сыворотке крови у телят (r = +0,01). У телят с субклиническим трахеобронхитом отмечалась тенденция к повышению содержания веществ низкой и средней молекулярной массы в крови, в то время как в КВВ показатель содержания МСМ оставался без изменений. Это может указывать на нарушение процессов утилизации МСМ, которые у здоровых животных протекают в различных клеточных структурах органов дыхания от эндотелиоцитов до альвеолоцитов и клеток интерстиция (Симбирцев С.А. с соавт., 1987; Martelli M., Colasanti R., 1983; Staddy P.R. et al., 1983).
Содержание диеновых конъюгатов и кетодиенов в КВВ у телят с субклиническим трахеобронхитом и у здоровых животных статистически достоверно не отличались. Характер изменений содержания МДА в КВВ и в крови у телят с респираторной патологией имел разную направленность. Так, если в крови у телят с субклиническим трахеобронхитом содержание МДА возрастало в 1,36 раза (р<0,05), то в КВВ концентрация МДА, напротив, снижалась в 1,60 раза (р<0,05) по сравнению со здоровыми животными. При субклиническом трахеобронхите концентрация GSH в КВВ снижается по сравнению со здоровыми животными на 4,0% (р<0,05). Ферроксидазная активность церулоплазмина в КВВ и в крови у телят, больных субклиническим трахеобронхитом, по сравнению со здоровыми животными, статистически достоверно не отличалась (табл. 13). Таблица 13 Некоторые показатели системы ПОЛ-АОЗ, определяемые в КВВ и крови телят
Примечание: в числителе – показатели КВВ, в знаменателе – сыворотки крови * - р < 0,05 - 0,001 по сравнению со здоровыми животными Полученные данные позволяют рассматривать снижение содержания вторичных продуктов ПОЛ в КВВ с одновременным уменьшением антиоксидантной активности КВВ (в том числе снижение содержания GSH, как основного компонента системы АОЗ легких) в качестве диагностического критерия воспалительного процесса в органах дыхания. В конденсате выдыхаемого воздуха содержание NOx у телят, больных субклиническим трахеобронхитом, возрастало по сравнению со здоровыми животными на 63,1% (Р<0,05) (рис. 5). При этом в сыворотке крови у больных телят отмечалась лишь незначительная тенденция к повышению их уровня. При этом корреляционный анализ показал слабую прямую взаимосвязь между уровнем NOx в КВВ и в сыворотке крови у телят (r = +0,20; р>0,05).
уровня стабильных метаболитов оксида азота в КВВ может быть информативным для оценки степени структурно-функционального повреждения клеток респираторного тракта и представлять интерес для раннего прогноза и выявления бронхолегочной патологии еще до развития ее клинических симптомов. ВЫВОДЫ 1. Разработаны устройство и способ получения конденсата выдыхаемого воздуха у телят. Средний объем конденсата выдыхаемого воздуха, образующегося у телят при спокойном равномерном дыхании за 15 минут равен 1,8±0,5 мл (1,5-2,5 мл). Для определения биохимических показателей требуется не менее 1,5 мл конденсата выдыхаемого воздуха. 2. В 1-2-е сутки жизни в конденсате выдыхаемого воздуха и сыворотке крови у здоровых телят установлен наиболее высокий уровень активности ЩФ и -ГТ. Высокая активность ЩФ и -ГТ в КВВ и сыворотке крови в начале неонатального периода связана, по всей вероятности, со всасыванием этих макромолекулярных белков из молозива. Активность АсАТ и АлАТ в конденсате выдыхаемого воздуха у телят с 1-2-х суток жизни до 2-недельного возраста существенно не изменяется, и заметно увеличивается только к 30-суточному возрасту, что, вероятно, связано с интенсификацией процесса глюконеогенеза. 3. Установлена различная возрастная динамика содержания в крови и в конденсате выдыхаемого воздуха стабильных метаболитов оксида азота у оставшихся здоровыми и заболевших телят. В сыворотке крови клинически здоровых телят уровень стабильных метаболитов оксида азота к месячному возрасту, по сравнению с первыми сутками после рождения, снижается более чем в 7 раз, а в конденсате выдыхаемого воздуха уровень стабильных метаболитов оксида азота статистически достоверно не изменяется. 4. В возрасте 2-х суток (за 3-4-недели до развития клинических признаков патологии респираторного тракта), у впоследствии заболевших телят по сравнению с оставшимися здоровыми в конденсате выдыхаемого воздуха повышена активность -глутамилтрансферазы – в 1,64 раза, аланинамино-трансферазы – в 1,53 раза, щелочной фосфатазы – в 1,58 раза, содержание холестерина – в 2,47 раза, кальция – в 1,63 раза, стабильных метаболитов оксида азота – в 1,57 раза. При этом достоверных различий в содержании стабильных метаболитов оксида азота и активности ферментов в сыворотке крови у оставшихся здоровыми и впоследствии заболевших телят в этом возрасте не установлено. 5. Более высокий уровень холестерина, активности ферментов различной субклеточной локализации (цитоплазматической – АлАТ, мембраносвязанных – ЩФ и -ГТ) и уровня стабильных метаболитов оксида азота в конденсате выдыхаемого воздуха у телят, предрасположенных к развитию респираторной патологии, связан со структурно-функциональным повреждением клеток респираторного тракта и выходом этих компонентов в бронхоальвеолярную жидкость. Изменения в составе конденсата выдыхаемого воздуха свидетельствуют о начинающемся воспалительном процессе в слизистой оболочке трахеобронхиального дерева. 6. У телят, больных субклиническим трахеобронхитом, по сравнению со здоровыми животными выше содержание в крови малонового диальдегида в 1,36 раза, активности каталазы – на 11,8%, глутатионпероксидазы – на 12,1%, отмечается тенденция повышения активности СОД. При субклиническом трахеобронхите у телят по сравнению со здоровыми животными содержание глюкозы в сыворотке крови ниже в 1,43 раза, а концентрация мочевины выше в 1,63 раза, при этом отмечается тенденция к повышению содержания в сыворотке крови веществ низкой и средней молекулярной массы. 7. У здоровых телят в возрасте 30-45 суток активность γ-ГТ в конденсате выдыхаемого воздуха составляет от 0,90 до 1,30 Е/л, содержание суммы стабильных метаболитов оксида азота – от 1,19 до 4,64 мкМ/л. Изменения в составе конденсата выдыхаемого воздуха отражают характер изменений состава бронхоальвеолярной жидкости на самых ранних стадиях развития болезни. В среднем за 8,0±0,33 суток до развития симптомокомплекса трахео-бронхита в конденсате выдыхаемого воздуха у телят в 2,78 раза повышена активность γ-ГТ, в 1,63 раза – содержание стабильных метаболитов оксида азота, нарушается процесс утилизации молекул средней массы клетками бронхолегочного аппарата. 8. С развитием клинических признаков трахеобронхита у телят происходит снижение мощности ферментативного звена системы антиоксидантной защиты. При клинически выраженом трахеобронхите активность СОД в крови у больных телят составляет всего 69,3% от таковой у здоровых животных, активность каталазы снижается на 10,4%, а активность ГПО в крови больных трахеобронхитом и здоровых животных существенно не отличаются. При этом содержание малонового диальдегида в крови у телят повышается по сравнению со здоровыми животными на 57,5%. 9. При клинически выраженном трахеобронхите у телят изменяется состав конденсата выдыхаемого воздуха. Содержание глюкозы в конденсате выдыхаемого воздуха, по сравнению со здоровыми животными, снижается на 37,5%, в 5,1 раза повышается содержание неорганического фосфора, в 3,59 раза – уровень стабильных метаболитов оксида азота, в 3,36 раза – активность γ-глутамилтрансферазы, на 3,7% снижается содержание восстановленного глутатиона и в 1,87 раза – малонового диальдегида. 10. Наиболее информативными для диагностики и прогнозирования респираторных заболеваний у телят являются изменения активности γ-глутамил-трансферазы и содержания стабильных метаболитов оксида азота в конденсате выдыхаемого воздуха. В возрасте 2-х суток (за 3-4-недели до развития клинических признаков патологии респираторного тракта) у впоследствии заболевших телят содержание NОх и активность γ-глутамилтрансферазы в конденсате выдыхаемого воздуха повышены по сравнению с животными, оставшимися здоровыми, в 1,57 и 1,64 раза соответственно. При субклиническом трахеобронхите за 6-9 суток до клинического проявления болезни, содержание NOx в конденсате выдыхаемого воздуха у телят повышено по сравнению со здоровыми животными в 1,63 раза, а активность γ-ГТ – в 2,78 раза. При клинически выраженном трахеобронхите повышение уровня NОх и активности γ-глутамилтрансферазы в конденсате выдыхаемого воздуха у телят находятся в прямой зависимости от тяжести заболевания. 11. Внутривенное введение 0,6% раствора пероксида водорода на 0,9%-ном хлориде натрия в дозе 0,4 мл/кг массы тела телятам при субклиническом трахеобронхите приводит к повышению активности ферментативного звена системы АОЗ и снижению содержания вторичных продуктов ПОЛ в крови, повышению до оптимальных значений уровня глюкозы и снижению содержания мочевины в сыворотке крови. Введение раствора пероксида водо-рода в указанных дозах способствует улучшению энегетического обмена, уменьшению явления эндогенной интоксикации и улучшению состояния биологических мембран у телят. 12. Применение способа, основанного на оценке реакции телят на внутривенное введение 0,6% раствора пероксида водорода на 0,9%-ном хлориде натрия в дозе 0,4 мл/кг массы тела, позволяет диагностировать повышение чувствительности слизистой оболочки трахеи и бронхов на самых начальных стадиях воспаления, в среднем за 8,0±0,30 суток до развития симптомокомплекса трахеобронхита. В случае возникновения кашлевой реакции через 1-7 минут после введения 0,6% раствора пероксида водорода на 0,9%-ном хлориде натрия в указанных дозах у телят диагностируют субклинический трахеобронхит. ^ 1. Для выявления воспалительного процесса в органах дыхания у телят рекомендуется применение способа, учитывающего реакцию телят на внутривенное введение 0,6% раствора пероксида водорода на 0,9% растворе хлорида натрия в дозе 0,4 мл/кг массы тела. В случае возникновения кашлевой реакции через 1-7 минут после введения 0,6% раствора пероксида водорода на 0,9%-ном хлориде натрия в указанных дозах у телят (в среднем за 8,0±0,30 суток до развития симптомокомплекса трахеобронхита) диагностируют субклинический трахеобронхит. 2. Для раннего прогноза и выявления бронхолегочной патологии у телят рекомендуется определение в конденсате выдыхаемого воздуха активности γ-глутамилтрансферазы и уровня стабильных метаболитов оксида азота. Повышение активности γ-ГТ более 1,30 Е/л и содержания суммы стабильных метаболитов оксида азота выше 4,7 мкМ/л в КВВ может указывать на наличие воспалительного процесса в органах дыхания. ^ 1. Черницкий А.Е. Конденсат выдыхаемого воздуха как тест-объект для оценки состояния легких у сельскохозяйственных животных // Материалы Первый съезд ветеринарных фармакологов России.– Воронеж, 2007.– С.628–631. *2. Близнецова Г.Н., Ковалев А.А., Черницкий А.Е. и др. Система антиоксидантной защиты телят при бронхопневмонии// Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук.– 2008.– №1.– С.76-78. *3. Близнецова Г.Н., Черницкий А.Е., Ковалев А.А. и др. Биохимические параметры конденсата выдыхаемого воздуха телят // Ветеринария.– 2008.– №3.– С.44-47. 4. Черницкий А.Е. Конденсат выдыхаемого воздуха в диагностике и прогнозировании респираторных болезней у телят // Биология – наука XXI века: тез. докладов 12-й Пущинской международной школы-конференции молодых ученых. Пущино, 2008. С.114. 5. Черницкий А.Е. Способ определения воспалительного процесса в органах дыхания у телят // Биология – наука XXI века: тез. докладов 12-й Пущинской международной школы-конференции молодых ученых. Пущино, 2008. С.159. 6. Черницкий А.Е. О возможности использования пероксида водорода для ранней диагностики трахеобронхита у телят // «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях». Материалы Международной научно-практической конференции. Воронеж: изд-во "Истоки", 2008. С.264–268. 7. Черницкий А.Е., Чусов Д.Б. Биохимические параметры конденсата выдыхаемого воздуха у телят при острой бронхолегочной патологии //«Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях». Материалы Международной научно-практической конференции.Воронеж: изд-во "Истоки", 2008. С.668–672. 8. Черницкий А.Е., Ермолова Т.Г. Состояние системы ПОЛ-АОЗ у телят при трахеобронхите // Образование, наука, практика: инновационный аспект: Сб. материалов международной конференции, посвященной памяти профессора А.Ф. Блинохватова. Пенза: РИО ПГСХА, 2008. – С.481. * издания из Перечня ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Рис. 4. Активность γ-ГТ в КВВ у телят, (Е/л)
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям