Методические рекомендации к лабораторным работам по курсам «Основы микробиологии», «Микробиология», «Общая биология и микробиология» для студентов всех форм обучения специальностей 240901, 260204
|
|
Скачать 361.83 Kb.
|
|
Министерство образования и науки РФ Бийский технологический институт (филиал) государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова» Е.П. Каменская МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ Методические рекомендации к лабораторным работам по курсам «Основы микробиологии», «Микробиология», «Общая биология и микробиология» для студентов всех форм обучения специальностей 240901, 260204, 080401  Бийск Издательство Алтайского государственного технического университета им. И.И. Ползунова 2011 УДК 663.1:579.6 (076)
^
В настоящих методических рекомендациях рассмотрены вопро-сы, касающиеся различных методов стерилизации питательных сред, посуды, инструментов и приборов. Приводятся примеры различных режимов стерилизации в зависимости от стерилизуемого материала и метода стерилизации. УДК 663.1:579.6 (076)
© Каменская Е.П., 2011 © БТИ АлтГТУ, 2011 СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ Стерилизация является одним из важнейших и необходимых приемов в микробиологической практике. Слово «стерилизация» в переводе с латинского означает «обеспложивание». В практической работе под стерилизацией понимают методы, применяемые для уничтожения всех форм жизни, как на поверхности, так и внутри стерили-зуемых объектов. Микробиологи стерилизуют питательные среды, посуду, различные инструменты и другие необходимые предметы с целью не допустить развитие посторонних микроорганизмов в исследуемых культурах. Термин «стерильность» имеет абсолютное значе-ние. Можно говорить только либо о стерильности, либо о нестерильности, но не может быть состояния «частичной или неполной стерильнос-ти», «близкого к стерильному», «почти стерильного». Различают термическую и холодную стерилизацию. В микробиологии находят применение следующие способы термической сте-рилизации: прокаливание в пламени и обжигание, сухожаровая стерилизация (горячим воздухом), стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование), дробная стерилизация (тиндализация), кипячение. Из методов холодной стерилизации микробиологи используют стерилизацию фильтрованием, газообразными средствами, ульт-рафиолетовыми лучами и другими видами излучений. Возможность и целесообразность применения того или иного способа определяются в первую очередь физико-химическими свойствами материала, подлежащего стерилизации, а иногда и целью иссле-дования. ^ 1.1 Стерилизация насыщенным паром под давлением – автоклавирование Данный способ стерилизации питательных сред является наиболее надежным и чаще всего применяемым. Он основан на нагревании материала насыщенным водяным паром при давлении выше атмосферного. Известно, что температура пара возрастает при повышении его давления (таблица 1). Таблица 1 – Температура насыщенного пара при разном давлении
Совместное действие высокой температуры и пара обеспечивает особую эффективность этого процесса. При этом погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Установлено, что споры большинства микроорганизмов не выдерживают и 5-минутную экспозицию в насыщенном паре при 121 ºС. Лишь споры некоторых поч-венных бактерий погибают при 1 ати только через 30 мин. Стерилизацию паром под давлением осуществляют в специальных герметически закрывающихся толстостенных аппаратах – авто-клавах. Автоклавы разнообразны по форме, размерам, рабочему давлению, конструкции и другим показателям. Они могут быть с ручным управлением, полуавтоматические и автоматические, но поскольку все автоклавы предназначены для выполнения одной и той же задачи – стерилизации, то основной принцип их устройства один и тот же. На рисунке 1 показана схема вертикального автоклава с ручным управлением. Автоклав представляет собой металлический двустенный резервуар, способный выдержать высокое давление. Его внутренняя часть является стерилизационной камерой 1. В нее помещают стери-лизуемый материал. Стерилизационная камера снабжена краном 2 для выхода воздуха, манометром 3 для определения давления пара и предохранительным клапаном 4 для выхода пара при повышении давления сверх необходимого и для предотвращения разрыва автоклава. Пространство между стенками, называемое водопаровой камерой 5, заполняется через воронку 6 водой (лучше дистиллированной, чтобы не образовывалась накипь) до определенного уровня, который отмечен на специальной водомерной трубке автоклава 7. Выше этого уровня воду наливать не следует, так как при бурном кипении вода может попасть в трубку, ведущую к манометру, и исказить его показания. В верхней части внутренней стенки водопаровой камеры имеются отверстия 8, через которые пар поступает в стерилизационную камеру. Паровой котел сверху покрыт защитным кожухом 9. Он предохраняет котел от механических повреждений, а работающего около автоклава – от ожогов. Для создания герметичности автоклав плотно закрывают массивной крышкой 10 с резиновой прокладкой. Стерилизуемые предметы помещают на специальную подставку 11.  1 – стерилизационная камера; 2 – кран для выхода воздуха; 3 – манометр; 4 – предохранительный клапан; 5 – водопаровая камера; 6 – воронка для заполнения автоклава водой; 7 – водомерная трубка; 8 – отверстия для поступления пара в стерилизационную камеру; 9 – защитный кожух; 10 – крышка автоклава; 11– подставка для размещения стерилизуемых предметов Рисунок 1 – Схема автоклава 1.1.1 Процесс автоклавирования Отдельные операции процесса стерилизации в автоклавах разных типов могут быть несколько различными. Соответственно несколько различается и техника работы с ними, однако, общий принцип проведения стерилизации в разных автоклавах одинаковый. Перед работой осматривают автоклав и контрольно-измерительную аппаратуру. При наличии любой неисправности (смещение стрелки манометра с нуля, трещина на водомерной трубке и др.) работать с прибором нельзя. После осмотра автоклава в водопаровую камеру наливают воду до верхней отметки на водомерной трубке. В стерилиза-ционную камеру на специальную подставку из дерева помещают стерилизуемый материал. Предметы следует размещать не слишком плотно, так как пар должен свободно проходить между ними, иначе они не нагреются до нужной температуры и могут остаться нестерильными. Загрузив стерилизационную камеру, устанавливают и плотно завинчивают крышку (дверь) автоклава. Затем открывают кран, соединяющий стерилизационную камеру с наружным воздухом, и включают нагрев. После начала парообразования удаляют воздух из стерилизационной камеры. Это необходимое условие стерилизации, так как при одном и том же давлении температура чистого пара выше температуры смеси пара и воздуха. Если в автоклаве останется воздух, материал может не простерилизоваться. Наиболее простой и очень распространенный способ освобождения автоклава от воздуха – вытеснение воздуха паром. Пар и конденсат отводят либо в сосуд с водой, либо в специальное устройство, соединенное с канализацией. В первом случае на кран (2) надевают резиновый шланг, который опускают в воду. Началом продувания считается появление устойчивой непрерывной струи чистого пара. Пока в автоклаве еще имеется воздух, смесь воздуха и пара, проходя через воду, издает сильный треск. Чистый пар выходит с равномерным шипящим звуком. Его пропускают в течение 10 мин. В целом вся операция с момента появления пара с воздухом должна занимать не более 15…20 мин, иначе в автоклаве останется мало воды и он может испортиться. Чтобы уменьшить расход пара (воды), кран открывают не полностью. Степень открывания крана устанавливают на практике при эксплуатации автоклава. В наиболее совершенных автоклавах воздух из стерилизационной камеры удаляют с помощью вакуумного насоса. Когда воздух вытеснен, закрывают пароотводной кран и давление пара доводят до показания, соответствующего режиму стерилизации. Режим автоклавирования часто выражают в единицах избыточного давления, указывая при этом длительность его поддержания, например, стерилизация при 1 ати в течение 20 мин. На манометре автоклава обозначается именно то избыточное давление, которое создается в авто-клаве сверх нормального. Нередко режим автоклавирования характеризуется температурой и временем. Как только стрелка манометра дойдет до указателя определенного дополнительного давления и, следовательно, температура пара достигнет соответствующего значения, этот уровень давления пара поддерживают в течение необходимого времени путем ручного или автоматического регулирования подачи пара. В автоматических автоклавах подачу пара регулируют электроконтактным манометром. По окончании времени стерилизации выключают нагрев автоклава. Давление в автоклаве постепенно падает и сравнивается с атмосфе-рным. Лишь после этого открывают кран, выводящий пар. Преждевременное открывание крана недопустимо, так как перегретые среды при резком снижении давления сразу же бурно закипают, смачивают и даже иногда выталкивают ватные пробки, что нарушает стерильность материала. Когда пар выйдет, открывают крышку (дверь) автоклава, соблюдая при этом осторожность во избежание ожога паром лица и рук. Удаление пара из стерилизационной камеры автоклавов, оснащенных вакуумным насосом, осуществляют с помощью насоса. Одновре-менно происходит подсушивание стерильного материала. Поскольку автоклав работает при высоких давлениях и температурах, то неправильное обращение с ним может быть причиной несчас-тных случаев. Установка автоклава и работа с ним производятся при точном и строгом выполнении правил, указанных в прилагаемой к автоклаву инструкции. К работе допускаются только подготовленные лица, имеющие специальное разрешение. При необходимости проконтролировать температуру в автоклаве пользуются разными веществами, плавящимися при определенной температуре. Эти вещества предварительно смешивают с нейтральными красителями и помещают в автоклав до начала стерилизации. В качестве индикаторов температуры используют фенантрен (температура плавления от 98 °С до 100 °С), бензаурин (115 ºС), серу (119 °С), бензойную кислоту (от 121°С до 122°С), мочевину (132 °С), глюкозу (146 °С), тиомочевину (180 °С), аскорбиновую кислоту ( от 187 °С до 192 °С). На 100 г этих веществ берут 0,01 г красителя (фуксин, мети-леновый синий), тщательно смешивают, рассыпают в стеклянные трубочки с одинаковым диаметром и толщиной стенок, запаивают и в вертикальном положении раскладывают между стерилизуемым материалом в автоклаве. По достижении в сосуде соответствующей темпе-ратуры эти вещества расплавляются и окрашиваются в цвет добавленного в них красителя. 1.1.2 Подготовка сред к стерилизации При автоклавировании от 3 до 5 % жидкости теряется в результате испарения, поэтому рекомендуется в приготавливаемые среды доба-влять сверх объема примерно 5 % дистиллированной воды. Тогда после стерилизации среда (раствор) будет иметь требуемую концентра-цию. Среды обычно стерилизуют в пробирках, колбах, бутылях. Емкости заполняют средой не более чем на половину их высоты, чтобы предотвратить смачивание пробок. Сосуды со средами закрывают ватными пробками. Они предохраняют среду от заражения микроорга-низмами, находящимися в окружающем воздухе. Пробки должны быть достаточно плотными, чтобы выполнять эту функцию, но с достаточно равномерным распределением волокон ваты, так как через них происходит газообмен культур с окружающей средой. Слишком плотные пробки затрудняют снабжение культур воздухом. Для приготовления пробки плоский кусок ваты, взятый вдоль волокна, скатывают валиком. Чтобы придать пробке прочность, ее про-катывают между ладонью и чистым стеклом, лежащим на столе. Длина пробки для обычной пробирки примерно 4 см. Пробка должна входить в пробирку на 1,5…2,0 см. Для сохранения формы пробку вынимают из горлышка, слегка вращая. Удобно обернуть пробку чистой марлевой салфеткой. Перед стерилизацией пробки можно прикрыть бумажными колпачками. Нельзя обертывать пробки сосудов, которые будут стерили-зоваться в автоклаве, целлофаном, фольгой или другими материалами, не пропускающими пар, так как пар должен проникать через пробку в сосуд, иначе среды не нагреются до нужной температуры и не простерилизуются. При использовании стеклянных, резиновых, корковых и других пробок их завертывают в двойной слой оберточной бумаги и стерилизуют привязанными к склянке, закрытой ватной пробкой. Про-бки в сосуде меняют стерильно около пламени горелки. 1.1.3 Выбор режима автоклавирования В микробиологической практике стерилизацию в автоклавах осуществляют при температуре от 111 °С до 138 ºС, т.е. от 0,5 до 2,5 ати. Температура ниже 111 °С не может считаться надежной; температура выше 138 ºС, как правило, не является необходимой, к тому же чем выше давление пара, тем сложнее условия эксплуатации автоклава. При использовании автоклавов без вакуумных насосов наиболее надежными считают следующие режимы стерилизации: от 15 до 45 мин при температуре 121 ºС (1 ати) и от 10 до 30 мин при температуре 128 °С (1,5 ати). Микробиологи чаще всего стерилизуют среды при 0,5 и 1 ати. Температура и длительность автоклавирования питательных сред определяются, прежде всего, их составом, термоустойчивостью или термолабильностью компонентов. Такие легко разрушающиеся субстраты, как молоко или желатиновые среды, а также субстраты, содержащие сахара, витамины (пивное сусло, соки, дрожжевой автолизат и др.), обычно стерилизуют при 0,5 ати в течение 15…30 мин. Мясопептонные среды можно стерилизовать при 1 ати 20 мин. Среды, содержащие агар, стерилизуются труднее, потому что стерилиза-ция начинается фактически после того, как агар расплавится. Но и расплавленный агар требует для стерилизации в два раза больше времени, чем тот же объем воды. С трудом поддаются стерилизации в автоклаве различные порошки (тальк, мел) и вязкие жидкости (глицерин, вазелиновое масло), поскольку они плохо передают тепло и очень медленно прогреваются. Их лучше стерилизовать в сушильных шкафах при 160 ºС в течение 2 ч или 1 ч при 170 °С. Слой масла или порошка в сосуде не должен превышать 1,5 см. Имеются субстраты, в которых могут быть споры, отличающиеся особой термостабильностью. К ним относится почва, причем она, кроме того, нагревается с замедленной скоростью. Ее обычно стерилизуют при 1 ати либо один раз 2 ч, либо два дня подряд по 1 ч, а иногда 2 ч при 2 ати. Выбирая режим стерилизации, необходимо учитывать рН среды. При кислой реакции многие вещества, входящие в ее состав, могут подвергнуться гидролизу. Чем ниже значение рН, чем выше температура и продолжительнее время стерилизации, тем интенсивнее проис-ходит гидролиз. В результате после стерилизации перестают застывать среды с желатиной и даже с агаром. Если реакция среды щелочная, то при стерилизации выпадают в осадок соли железа; они карамелизуются и сахара становятся непригодными для использования бактериями. В некоторых случаях в процессе стерилизации изменяется рН среды. Так, если рН среды с углеводами выше 7,0, то может произойти ее подкисление до рН 6,0. Чтобы избежать таких явлений, рекомендуется угле-воды, фосфаты, соли железа автоклавировать отдельно в виде более или менее концентрированных растворов в дистиллированной воде при том значении рН, которое обеспечивает целостность вещества. После стерилизации растворы объединяют в нужном соотношении. Таким приемом раздельной стерилизации в микробиологии пользуются довольно часто, поскольку многие компоненты сред нельзя стерилизо-вать одним и тем же способом. Режим автоклавирования в значительной степени зависит от объема стерилизуемого субстрата. Чем больше объем, тем больше времени при одной и той же температуре (давлении) требуется для обеспечения надежности стерилизации. Имеет значение толщина стенок и форма емкостей (таблица 2). Это нужно учитывать в практичес-кой работе. Таблица 2 – Зависимость продолжительности стерилизации жидкости от объема сосудов
Например, не следует стерилизовать термочувствительный субстрат одновременно в пробирках и больших бутылях. Если среда стерилизуется по режимам, рекомендуемым для малых объемов, то содержимое бутыли может не простерилизоваться. Если же стерилизация проводится с расчетом на большой объем, то среда в пробирке прогревается намного дольше и может испортиться. После автоклавирования среды для проверки стерильности выдерживают от 2 до 3 сут. в термостате при температуре 30 °С. Если в средах обнаруживается рост микроорганизмов, их готовят заново. ^ Тиндализация, или дробная стерилизация, была предложена в 1877 г. Дж. Тиндалем. Она применяется для сред, портящихся при действии температур выше 100 °С. Тиндализацию осуществляют текучим паром в автоклаве с незавинченной крышкой или в кипятильнике Кoxa (рисунок 2). Среды прогревают несколько раз по 10…15 мин. Между прогреванием среды ставят в термостат при температуре 30 °С на 8…12 ч для прорастания жизнеспособных спор. Среды, не выдерживающие нагревания при 100 ºС, прогревают более осторожно: при температуре от 60 ºС до 80 °С через каждые 8…12 ч 4…5 сут подряд.  Рисунок 2 – Кипятильник Коха 1.3 Пастеризация Однократный прогрев материала при температуре ниже 100 °С известен под названием пастеризация. Этот метод, предложенный Пастером, предназначен для уничтожения только бесспоровых форм микроорганизмов. Следовательно, в подавляющем большинстве случаев он не обеспечивает стерильности. Пастеризацию проводят при тем-пературе от 60 ºС до 80 °С в течение от 10 до 30 мин. Считается, что пищевая ценность продуктов при пастеризации практически не изменяется, так как сохраняются вкусовые качества и ценные компоненты (витамины, ферменты и др.). В промышленных масштабах пастеризации подвергают молоко, вино, пиво и др. жидкости, а также пищевые продукты, которые после пастеризации рекомендуется хранить при низкой температуре, чтобы избежать прорастания бактериальных спор. В настоящее время в зависимости от вида и свойств пищевого сырья используют разные режимы пастеризации. Различают длительную (при температуре от 63 °C до 65 °C в течение 30…40 мин), короткую (при температуре от 85 °C до 90 °C в течение 0,5…1 мин) и мгновенную пастеризацию (при температуре 98 °C в течение нескольких секунд). Пастеризация не может применяться в консервировании продуктов, так как герметично закрытая тара является благоприятной средой для прорастания спор анаэробной микрофлоры. Пастеризацию осуществляют в пастеризаторах. Распространены центробежные, трубчатые и пластинчатые пастеризаторы (для молока, сливок, фруктовых и овощных соков, напитков), в которых обеспечивается быстрый кратковременный нагрев до сравнительно высоких температур (до 100 °С) продукта, непрерывно протекающего тонким слоем между греющими поверхностями. После пастеризации продукт разливают в герметически укупориваемую тару. Для пастеризации продуктов, заранее расфасованных в тару (бутылки, консервные банки), имеются пастеризаторы, в которых продукты нагреваются паром при постоянном вращении. Перспективны пастеризаторы с высокочастотными источниками нагрева продуктов в таре. 1.3.1 Пастеризация и ультрапастеризация молока Пастеризация сырого молока осуществляется при различных режимах (температура, время) при температуре от 63 °С до 120 °С с выдержкой, обеспечивающей снижение количества любых патогенных микроорганизмов в сыром молоке и продуктах его переработки до уровней, при которых эти микроорганизмы не наносят существенный вред здоровью человека. Низкотемпературная пастеризация осуществляется при температуре не выше 76 °С и сопровождается инактива-цией щелочной фосфатазы. Высокотемпературная пастеризация осуществляется при различных режимах (температура, время) при температуре от 77 °С до 100 °С и сопровождается инактивацией как фосфатазы, так и пероксидазы. Контроль эффективности пастеризации осуществляется одним из следующих методов: а) биохимическим методом (в зависимости от температуры пастеризации проба на фосфатазу или проба на пероксидазу, ферментные пробы) путем испытания проб молока или продуктов его переработки. Отбор таких проб осуществляется из каждого резервуара после его наполнения пастеризованным продуктом; б) микробиологическим методом путем испытания проб молока или продуктов его переработки на наличие санитарно-индикаторных микроорганизмов. Отбор таких проб осуществляется после охлажде-ния продуктов, прошедших термическую обработку. Периодичность контроля эффективности пастеризации устанавливается программой производственного контроля. Ультрапастеризация – процесс термической обработки сырого молока и продуктов его переработки. Ультрапастеризация осуществляется в потоке в закрытой системе с выдержкой не менее чем две секунды одним из следующих способов: а) путем контакта обрабатываемого продукта с нагретой поверхностью при температуре от 125 °С до 140 °С; б) путем прямого смешивания стерильного пара с обрабатываемым продуктом при температуре от 135 °С до 140 °С. Ультрапастеризация с последующим асептическим упаковыванием обеспечивает соответствие продукта требованиям промышленной стерильности. Контроль эффективности ультрапастеризации осуществляется путем испытания проб молока и продуктов его переработки. ^ Фильтрованием стерилизуют синтетические среды строго определенного состава, которые содержат легкоразрушающиеся или летучие компоненты – витамины, аминокислоты (цистеин и цистин), белки, ароматические углеводороды, антибиотики и др. Фильтрование жидкостей осуществляют через мелкопористые материалы, легко адсорбирующие клетки микроорганизмов: асбест, целлюлозу, фарфор, каолин и т.д. Стерилизующими фильтрами теоретически считают такие, размер пор которых не превышает 0,7 мкм. В практике же пригодность фильтров для стерилизации устанавливают путем пробной фильтрации через них суспензии какого-нибудь мелкого микроорганизма, например Serratia marcescens. Для проверки на стерильность фильтрат в большом количестве высевают на питательную среду. Если в течение 5 сут. тест-организм не вырастет, фильтры могут быть использованы для стерилизации. Широкое распространение получили мембранные фильтры. Это диски разного размера, диаметра, напоминающие бумажные. Их готовят на основе нитроцеллюлозы. Мембранные фильтры, в зависимости от величины пор, применяют для фильтрования и стерилизации. Для стерилизации используют фильтры с номера 1 до номера 4 фирмы «Владипор» (Россия), фильтры с номе-ра 5 до номера 10 фирмы «СИНПОР» (Чехия) и марок VF, VM, VC, SLGS, SLHA, DA фирмы «МИЛЛИПОР» (США). Плотные диски, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой, называются фильтрами Зейтца. В зависимости от диаметра пор они обозначаются разными индексами: ЕК – поры диаметром 1,5…1,8 мкм; EKS – 1,2…1,5 мкм; EKS-1 – 1,0…1,2 мкм; ЕКР – 0,8…1,0 мкм. В России выпускают асбестовые фильтры марок Ф2 и СФ. Стерилизующими являются СФ-3 и СФ-4. Асбестовую пластинку помещают в специальный держатель, который обычно изготавливают из нержавеющей стали, и крепко зажима-ют винтами между верхней (цилиндрической) и нижней (воронкообразной) частями держателя. Трубка нижней части держателя через резиновую пробку проходит в колбу Бунзена. Нередко весь этот прибор в собранном виде называют фильтром Зейтца. Для стерилизации используют стеклянные пористые фильтры, а также изготовленные из каолина с примесью кварцевого песка – «свечи» Шамберлана и из инфузорной земли – «свечи» Беркефельда. По-ристость первых обозначается буквой L с цифрами от 1 до 13 соответ-ственно уменьшению диаметра пор фильтра от 9 до 1,2 мкм. Мелкопористые «свечи» обозначаются маркой В, крупнопористые – F. Фильтры Беркефельда обозначают буквами V, N, W, что соответствует следующим размерам пор (мкм): 8–12, 5–7, 3–4. «Свечи» и специальные держатели с закрепленными в них асбестовыми фильтрами герметически соединяют с колбой Бунзена для фильтрации в вакууме (рисунок 3). Перед употреблением фильтры, их держатели и приемник фильтрата должны быть простерилизованы.  а – со стеклянным держателем; б – с металлическим Рисунок 3 – Приборы для стерилизации фильтрованием Мембранные фильтры стерилизуют автоклавированием при 1 ати 15 мин или длительным кипячением. Держатель вместе с резиновой пробкой заворачивают в бумагу и автоклавируют при давлении 1 ати от 20 до 30 мин. Фильтры Зейтца автоклавируют в собранном виде. «Свечи» стерилизуют вместе с резиновыми пробками в автоклаве. Колбу Бунзена закрывают ватной пробкой, в отводную трубку вставляют тампон и стерилизуют горячим воздухом – сухим жаром. ^ Основной способ стерилизации стеклянной посуды – обработка сухим горячим воздухом при температуре не выше 180 ºС в течение 1…3 ч (таблица 3). При этом погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Стерилизацию осуществляют в специальных суховоздушных (сухожаровых) стерилизаторах и сушильных шкафах, при-способленных для стерилизации. Они различаются по форме и способам обогрева, но имеют сходное устройство. Их делают из термостой-ких материалов – обычно из металла и асбеста. Внутри стерилизатора имеются полки для размещения посуды, а наверху – отверстие, в котором с помощью пробки укрепляют термометр. У стенки стерилизатора (шкафа) или вблизи греющей поверхности температура всегда значительно выше, чем внутри, поэтому ртутный шарик термометра должен находиться внутри шкафа на расстоянии от 6 до 8 см от верхней стенки. В верхней части сушильных шкафов имеется также отверстие для вентиляции, которое при стерилизации закрывают. Стерилизаторы и шкафы с электрическим обогревом снабжены терморегулятором, обеспечивающим автоматическое поддержание необходимой температуры. Таблица 3 – Условия стерилизации стеклянной посуды сухим жаром
^ Посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта, высушена и завернута в бумагу для сохранения стерильности после прогревания. Посуду развертывают непосредственно перед употреблением. В верхние концы пипеток вставляют ватные тампоны. Торчащие из пипеток волокна ваты сжигают в пламени горелки. Пипетки заворачивают в длинные полоски бумаги шириной 4…5 см. Обмотку начинают с оттянутого конца и постепенным движением бумаги по спирали заканчивают у конца с ватным тампоном. Завернутые пипетки для предохранения бумаги от загрязнения и разрывов перед стерилизацией упаковывают по несколько штук вместе или помещают в специальные металлические или картонные пеналы. Чашки Петри обычно заворачивают в пакеты по 2…4 штуки, шпатели – по отдельности, но затем, как и пипетки, их объединяют в общий сверток. Колбы, пробирки и трубки Бурри закрывают ватно-марлевыми пробками. На пробки можно надеть бумажные колпачки, предохраняющие горлышко от пыли. 2.2 Стерилизация Посуду, подготовленную для стерилизации, загружают в стерилизатор (или сушильный шкаф) не слишком плотно, чтобы обеспечить циркуляцию воздуха и равномерный надежный прогрев стерилизуемого материала. Стерилизатор (сушильный шкаф) во время работы должен быть плотно закрыт. При отсутствии терморегулятора необходимо строго следить за температурой, так как при ее понижении не осуществится стерилизация, а при нагреве выше 180 °С бумага и пробки начинают обугливаться. По окончании стерилизации шкаф не открывают до тех пор, пока температура в нем не упадет до 80 ºС, поскольку при резком охлаждении иногда нарушается стерильность материала, а сильно нагретое стекло может растрескаться. Лучше всего выгружать посуду, когда температура в стерилизаторе сравняется с комнатной. Посуду можно стерилизовать и в автоклаве. Режим стерилизации в этом случае существенно зависит от объема сосудов и толщины стекла (см. таблицу 2). Для автоклавирования посуду готовят, как и для сухожаровой стерилизации. Следует иметь в виду, что в автоклаве посуда увлажняется. ^ Мелкие металлические инструменты: петли, иглы, пинцеты, ножницы, шпатели – стерилизуют прокаливанием в пламени (т.е. фламбируют) непосредственно перед использованием. На пламени кратковременно обжигают предметные и покровные стекла, стеклянные шпатели и палочки, фарфоровые ступки и пестики, горлышки колб, пробирок, бутылок, а также ватные пробки при пересевах культур и разливах сред. В пламени погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Наряду со стерильными одноразовыми шприцами в лабораторной практике широко распространены традиционные шприцы многократного использования. Их лучше всего стерилизовать сухим жаром при 160 °С в собранном либо в разобранном виде. В первом случае длите-льность стерилизации 15 мин, во втором – 60 мин. Собранные шприцы вместе с иглой стерилизуют в пробирке, закрытой ватной пробкой, ра-зобранные заворачивают в бумагу или ткань. Можно стерилизовать шприцы и в автоклаве при давлении 1 ати в течение 15…20 мин. Автоклавируют их только в разобранном виде, иначе они повреждаются. Прокаливать шприцы нельзя, так как от этого они портятся. Термостойкие приборы для культивирования микроорганизмов, а также детали к этим приборам, резиновые пробки и шланги стерилизуют в автоклаве. При этом емкости завертывают в бумагу. Режим автоклавирования выбирают в соответствии с термостойкостью материала, из которого сделан прибор. Некоторые предметы (металлические инструменты, мелкие стеклянные детали, мембранные фильтры) иногда стерилизуют длитель-ным (в течение от 20 до 30 мин) кипячением в дистиллированной воде. Металлические и стеклянные предметы лучше всего кипятить в специальных закрытых сосудах – стерилизаторах. Можно использовать для этой цели и металлическую посуду. Мембранные фильтры обычно кипятят в колбе или химическом стакане, закрытых ватными пробками. Однако этим способом стерилизации в микробиологической практике пользуются редко в связи с тем, что длительное кипячение может повредить обрабатываемый материал, а сокращение времени кипячения может не обеспечить стерильность, так как споры некоторых микроорганизмов способны сохранять жизнеспособность, даже после длитель-ного кипячения. Надежность стерилизации при кипячении может быть увеличена внесением в воду какого-либо бактерицидного средства: 2 %-ного формальдегида, 1 %-ной бриллиантовой зелени или 0,1 %-ной сулемы. Но в этом случае возможно загрязнение биоцидами стерилизуемых предметов. ^ Аппаратуру, имеющую зеркальное, оптическое и радиоэлектронное оборудование, а также изделия из термолабильных пластмасс, например, центрифужные пробирки, стерилизуют газовым методом. Для газовой стерилизации применяются только те соединения, которые обладают спороцидными свойствами, – оксид этилена, метилбромид, оксид пропилена, формальдегид, глутаральдегид, бета-пропиолактон, озон и др. Особенно эффективна смесь оксида этилена и бромистого метила в массовом соотношении 1:1,44 (смесь «ОБ»). Газовую стерилизацию проводят в специальных герметически закрывающихся аппаратах. Стерилизуемые объекты, помещаемые в камеру, упаковывают как при стерилизации в автоклаве или сушильном шкафу. Для упаковки используют материалы, не портящиеся в газовой среде и пропускающие газ и влагу, – оберточную бумагу, хлор-виниловые и нейлоновые пленки и др. Перед введением в камеру биоцида из нее как можно полнее удаляют воздух, чтобы обеспечить тес-ный контакт активно действующего вещества со стерилизуемым объектом. При стерилизации строго контролируют концентрацию газа, давление, влажность, температуру и длительность экспозиции. В боль-шинстве случаев процесс проводят в сочетании с некоторым повышением температуры (до 45…70 °С). Режимы стерилизации разными га-зами неодинаковы. Они определяются, прежде всего, свойствами био-цида. Имеет значение и конструкция стерилизационного аппарата. Оптимальный режим стерилизации смесью «ОБ» при температуре 50 °С в аппарате вместимостью 100 л и более следующий: концентрация смеси 3,36 г/л (давление 1,2 ати), относительная влажность от 80 до 100 %, продолжительность 24 ч. По окончании стерилизации удаляют газы из камеры с помощью вакуумного насоса и на некоторое время камеру оставляют под вакуумом для десорбции газов из стерилизованных предметов. После этого камеру заполняют стерильным воздухом. Предметами, простерилизованными газами, рекомендуется пользова-ться не ранее чем через 24 ч после стерилизации. Это необходимо для полного удаления из них газа. Целесообразно на данный период поме-стить их в вытяжной шкаф или оставить в хорошо проветриваемом помещении. Некоторые изделия из пластмасс требуют дополнительной аэрации до 9 суток. При проведении газовой стерилизации строго соблюдают правила работы с ядовитыми газообразными веществами. ^ Для стерилизации помещений, оборудования, некоторых медицинских принадлежностей, пищевых продуктов используют разные виды излучений: инфракрасное, ультрафиолетовое, рентгеновские лучи, α-, β-, γ-лучи радиоактивных элементов. Единицей дозы облучения является рад (1 рад = 0,01 Гр), который эквивалентен поглощенной энергии примерно в 100 эрг/г. Стерилизующими являются дозы облучения от 2 до 3 Мрад. Чаще других в микробиологи-ческой практике используют ультрафиолетовое облучение. Следует отметить, что все большее распространение получают посуда и инструменты одноразового использования. Основные способы стерилизации питательных сред, посуды и других лабораторных материалов обобщены в таблице 4. Следует отметить, что все большее распространение получают посуда и инстру-менты одноразового использования. Таблица 4 – Способы стерилизации питательных сред, посуды и других лабораторных материалов
Продолжение таблицы 4
Продолжение таблицы 4
^ Цель работы: приготовление питательной среды для выращивания микроорганизмов, знакомство с методами стерилизации сред, по-суды, инструментов. Время выполнения работы – 6 часов. Задания 1. Сделать ватно-марлевые пробки для пробирок и колб. 2. Приготовить глюкозо-пептонную среду (глюкоза – 40,0 г; пеп-тон – 10,0 г; агар – 38,0 г; вода водопроводная 1000 мл). Последовательность приготовления питательной среды – Необходимые навески агар-агара, глюкозы и пептона растворяют в водопроводной воде и перемешивают. Среду варят на водяной бане при постоянном помешивании до полного растворения агара. Готовую среду фильтруют через двойной слой марли, вложенный в воронку, и разливают в горячем виде по колбам. – Колбы закрывают ватно-марлевыми пробками, накрывают сверху бумагой и завязывают суровыми нитками. Среду стерилизуют 30 мин при давлении 1 атм. Если среду необходимо хранить продолжительное время, её помещают в холодильник при температуре от 2 ºС до 4 ºС. 3. Подготовить к стерилизации в автоклаве (для каждой пары студентов): – чашки Петри – 4 шт. (по 2 в пачку); – пробирки обычные – 8 шт. (по 4 в пачку); – пипетки на 1–2 мл – 2 шт.; – стеклянные шпатели (Дригальского) – 2 шт. 4. Налить по 100 мл водопроводной воды в одну колбу на 250 мл. Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой, сверху надевают бумажный колпачок и стерилизуют в автоклаве. Стерильную воду используют затем для приготовления суспензий микроорганизмов. 5. Написать отчёт о проделанной работе и ответить на контрольные вопросы. Оборудование и материалы – стерильные чашки Петри; – колбы емкостью 250 мл; – пробирки; – глюкозо-пептонная среда; – стерильная вода; – шпатели Дригальского; – пипетки, градуированные на 1– 2 мл; – спиртовки; – вата; – марля; – бумага для обертывания чашек, пробирок и пипеток; – воронка; – суровые нитки; – фломастер; ^ 1. Дайте определения терминов: – стерилизация; – пастеризация; – тиндализация; – фламбирование. 2. Приведите примеры методов термической и холодной стерилизации. 3. Расскажите об устройстве автоклава и правилах работы с ним. 4. От чего зависит выбор режима автоклавирования? 5. Как необходимо готовить среды к стерилизации автоклавированием? 6. Как проверяют питательные среды после автоклавирования на стерильность? 7. В каких аппаратах проводят тиндализацию и при каких режимах? 8. Какие режимы пастеризации Вы знаете, в чем особенности пастеризации и ультрапастеризации молока? 9. В чем состоит подготовка стеклянной посуды к стерилизации? 10. Правила и условия стерилизации стеклянной посуды сухим жаром. 11. В каких случаях используют стерилизацию фильтрованием? 12. Приведите примеры фильтров, используемых для стерилизации. Как определяют их пригодность для стерилизации? 13. В чем особенность фильтров Зейтца? 14. Назовите способы стерилизации мембранных фильтров. 15. Назовите основные методы стерилизации инструментов и приборов. 16. В каких случаях применяют стерилизацию газовым методом? 17. В чем состоит подготовка стерилизуемых объектов к газовой стерилизации? 18. От чего зависят режимы газовой стерилизации? 19. Какие виды облучений используют в микробиологической практике? 20. Назовите единицу дозы облучения, какие дозы облучения являются стерилизующими? 21. Как может быть увеличина надежность стерилизации при кипячении? 22. Подберите соответствующие пары: 1) автоклавирование; 2) дробная стерилизация а) нагревание до температуры 60…80 ºС; б) температура 105…130 ºС при давлении от 1 до 2 атм; в) трехкратная обработка текучим паром; г) обработка в сушильном шкафу при температуре от 140 ºС до 180 ºС. 23. На микроорганизмы и их споры губительно действуют: а) видимая часть солнечного спектра; б) ультрафиолетовое излучение; в) γ-лучи; г) ультрафиолетовое излучение, γ-лучи. 24. Стерилизацией называется: а) выделение бактерий и природного источника; б) уничтожение патогенных микроорганизмов; в) уничтожение всех микроорганизмов и их покоящихся форм. 25. Каким методом стерилизуют жидкие и агаризованиные среды, не содержащие сахаров и других веществ, разлагающихся при температуре 120 ºС: а) дробной стерилизацией; б) горячим воздухом; в) автоклавированием; г) кипячением? 26. Режим стерилизации чашек Петри горячим воздухом: а) 160 °С, 1 ч; б) 160…170 °С, 2 ч; в) 3 раза по 30…40 мин через сутки; г) 1 атм, 30 мин. ЛИТЕРАТУРА 1. Градова, Н.Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии / Н.Б. Градова [и др.]. – М.: ДеЛи принт, 2001. – 131 с. 2. Лаптев, С.В. Химия, микробиология и экспертиза молока и мо-лочных продуктов: учебное пособие / С.В. Лаптев, Н.И. Мезенцева, Е.П. Каменская; Алт. гос. техн. ун-т, БТИ. – Бийск: Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, 2009. – 237 с. 3. Нетрусов, А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов [и др.]. – М.: Академия, 2005. – 608 с. 4. Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева. – М.: Дрофа, 2004. – 256 с. 5. Трушина, Т.П. Микробиология, гигиена и санитария в торговле / Т.П. Трушина. – Ростов н/Д: Феникс, 2000. – 320 с. Учебное издание Каменская Елена Петровна ^ Методические рекомендации к лабораторным работам по курсам «Основы микробиологии», «Микробиология», «Общая биология и микробиология» для студентов всех форм обучения специальностей 240901, 260204, 080401 Редактор Малыгина И.В. Технический редактор Малыгина Ю.Н. Подписано в печать 29.12.10. Формат 6084 1/16 Усл. п. л. 1,57. Уч.-изд. л. 1,69 Печать – ризография, множительно-копировальный аппарат «RISO ЕZ300» Тираж 50 экз. Заказ 2011-29 Издательство Алтайского государственного технического университета 656038, г. Барнаул, пр-т Ленина, 46 Оригинал-макет подготовлен ИИО БТИ АлтГТУ Отпечатано в ИИО БТИ АлтГТУ 659305, г. Бийск, ул. Трофимова, 27 |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям