В технологию продуктов питания” и спецкурсам для студентов всех форм обучения специальностей 070100, 270500, 171200, 170600, 061600 Бийск 2005
|
|
Скачать 0.56 Mb.
|
|
Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования “Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова” Бийский технологический институт (филиал) Ю.А. Кошелев, М.Э. Ламберова ВИТАМИНЫ Практикум по курсам “Органическая химия и химия биологически активных веществ”, “Биохимия”, “Микробиология”, “Химия пищи”, “Пищевая химия”, “Основы химии и технологии пищевых производств”, “Введение в технологию продуктов питания” и спецкурсам для студентов всех форм обучения специальностей 070100, 270500, 171200, 170600, 061600 Бийск 2005 УДК 576.8.(075.8) Кошелев Ю.А., Ламберова М.Э. Витамины: Практикум по курсам “Органическая химия и химия биологически активных веществ”, “Биохимия”, “Микробиология”, “Химия пищи”, “Пищевая химия”, “Основы химии и технологии пищевых производств”, “Введение в технологию продуктов питания” и спецкурсам для студентов всех форм обучения специальностей 070100, 270500, 171200, 170600, 061600. Алт. гос. тех. ун-т, БТИ. – Бийск. Из-во Алт. гос. техн. ун-та, 2005. – 57 с. В практикуме содержатся сведения о методах качественного и количественного анализа витаминов в различных пищевых продуктах, растениях и плодах. Рассмотрен и одобрен на заседании кафедры БТ протокол № 64 от 18.01.2005 г. Рецензент: начальник микробиологической лаборатории ЗАО “Алтайвитамины” Н.С. Соколова БТИ АлтГТУ, 2005 Ю.А. Кошелев, М.Э. Ламберова, 2005 СОДЕРЖАНИЕ 1 Общая характеристика витаминов......................................5 2 Витамин А (ретинол).......................................................................7 2.1. Качественные реакции на витамин А..........................................8 2.1.1 Реакция Друммонда....................................................................9 2.1.2 Реакция с сульфатом железа (II)................................................9 2.2 Количественное определение витамина А...................................9 2.2.1 Реакция с 1,3-дихлор-2-пропанолом........................................10 2.2.2 Определение содержания каротина в растительном материале методом хроматографии на колонке.............................10 3 Витамин В1 (тиамин).....................................................................14 3.1 Качественные реакции на витамин В1.......................... .............14 3.1.1 Диазореакция на тиамин.............................................. ...........15 3.1.2 Реакция окисления тиамина в тиохром....................... ...........15 3.2 Количественное определение витамина В1........... ...................15 3.2.1 Флюорометрическое определение витамина В1.......... ..........15 4 Витамин В2 (рибофлавин)......................................... ................18 4.1 Качественные реакции на витамин В2............................... ........18 4.1.1 Качественная реакция восстановления рибофлавина.... .......18 4.2 Количественное определение витамина В2................................19 4.2.1 Флюорометрическое определение витамина В2 (по Одинцовой) ................................................................................ 19 5 Витамин В6 (пиридоксин)...........................................................21 5.1 Качественные реакции на витамин В6........................................22 5.1.1 Феррихлоридная проба на пиридоксин.............. ....................22 5.1.2 Обнаружение пиридоксиловой кислоты в моче.....................22 5.2 Количественное определение витамина В6...............................23 5.2.1 Количественное определение 4-пиридоксиловой кислоты (по Хаффу и Перлцфейгу)............................................. .................. 23 6 Витамин Вс и В9 (фолиевая кислота, аминоптерин)..24 6.1 Определение содержания фолиевой кислоты в молоке...........25 7 Витамин В12 (цианкобаламин)................................................27 7.1 Качественная реакция на витамин В12.......................................29 7.1.1 Обнаружение кобальта в составе витамина В12.....................29 8 Витамин С (аскорбиновая кислота)...................................30 8.1 Качественные реакции на витамин С........................................31 8.1.1 Восстановление метиленовой сини аскорбиновой кислотой……………………………………………………………...31 8.1.2 Восстановление гексациано-(III)-феррата калия аскорбиновой кислотой.....................................................................31 8.1.3 Реакция с 2,6-дихлорфенолиндофенолом..............................32 8.2 Количественное определение витамина С................................33 8.2.1 Определение титра раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола.34 8.2.2 Приготовление экстракта из растительного материала........35 8.2.3 Определение содержания аскорбиновой кислоты в экстракте..........................................................................................35 9 Витамин D (кальциферол).........................................................36 9.1 Качественные реакции на витамины группы D........................38 9.1.1 Реакция с анилином..................................................................38 9.1.2 Бромхлороформная проба.......................................................39 9.2 Количественное определение витамина D................................39 10 Витамин Е (токоферол).............................................................40 10.1 Качественные реакции на витамин Е.......................................41 10.1.1 Реакция с концентрированной азотной кислотой............... 41 10.1.2 Реакция с хлоридом железа (III)...........................................41 10.2 Количественное определение витамина Е..............................42 11 Витамин К (филлохинон).........................................................43 11.1 Качественные реакции на витамин К......................................46 11.1.1 Реакция со щелочным раствором цистеина........................ 46 11.1.2 Реакция с диэтилмалоновым эфиром...................................47 11.1.3 Реакция с анилином...............................................................47 11.2 Количественное определение витамина К..............................47 12 Витамин Р ( цитрин)....................................................................48 12.1 Качественные реакции на рутин и кверцетин.........................50 12.1.1 Реакция с хлоридом железа (III)...........................................50 12.1.2 Реакция с концентрированной серной кислотой.................50 12.1.3 Реакция восстановления кверцетина................................. ..50 12.1.4 Реакция рутина с фелинговой жидкостью............................51 13 Витамин РР (никотиновая кислота).................................51 13.1 Качественные реакции на витамин РР.....................................53 13.1.1 Реакция с 2,4-динитрохлорбензолом....................................54 13.1.2 Реакция с роданбромидом.....................................................54 13.2 Количественное определение витамина РР.. ........................54 13.2.1 Реакция с роданбромидом.....................................................54 ЛИТЕРАТУРА…………………………………………………………….56 1 Общая характеристика витаминов Пища нужна живым клеткам и многоклеточным организмам для того, чтобы восполнить энергию и получить из ее белков, липидов, углеводов, витаминов и минеральных солей все необходимые компоненты для синтеза жизненно важных органических веществ. Вновь синтезированные клетками вещества составляют их структурные компоненты, обеспечивают все процессы жизнедеятельности для размножения и выполнения функций в организме. Витамины выполняют роль кофакторов при ферментах, которые катализируют все биохимические реакции в клетке. Витамины представляют собой низкомолекулярные органические вещества различной химической природы. По сравнению с другими питательными веществами они используются клетками организма в ничтожно малых количествах. Растения обладают способностью синтезировать все необходимые им витамины. Человек и животные получают их с пищей в готовом виде или в виде провитаминов, из которых в организме образуются витамины. Отсутствие их в пище приводит к развитию различных заболеваний, которые называются авитаминозами. К таким заболеваниям относятся рахит, цинга и другие. Недостаток витаминов способствует развитию гиповитаминозов. Причиной гиповитаминозов может быть не только недостаточное содержание витаминов в пище, но и нарушение их всасывания в желудочно-кишечном тракте. Некоторые заболевания, особенно инфекционные, сопровождаются нарушением обмена витаминов и вызывают усиленный распад и выделение их из организма. В таких случаях потребность в витаминах увеличивается. Введение некоторых лекарственных веществ типа антибиотиков и сульфаниламидных препаратов может отрицательно повлиять на обмен отдельных витаминов. Потребность в витаминах зависит также от условий труда. Чрезмерное введение в организм витаминов вызывает заболевание гипервитаминоз. Некоторые витамины получили свое название в зависимости от заболевания, которое развивалось по причине их отсутствия. В таких случаях к названию заболевания добавляли приставку "анти" антиксерофтальмический, антирахитичный и т.п. Позже стали обозначать витамины буквами латинского алфавита. Когда была исследована химическая природа ряда витаминов, стали вводить химические названия. В настоящее время используют все три вида номенклатуры витаминов. Простейшая классификация витаминов основана на их физико-химических свойствах. Витамины делят на растворимые в воде и растворимые в жирах. К водорастворимым относятся следующие витамины: - С (антискорбутный, антицинготный, аскорбиновая кислота); - Р (витамин проницаемости, цитрин); - Н (биотин); - N (липоевая или тиоктовая кислота); - Q (убихинон); - U (противоязвенный, метилметионин), а также витамины группы В: - В1 (антиневритный, тиамин); - В2 (рибофлавин); - В3 (антидерматитный, пантотеновая кислота); - В4 (аденин); - РР или В5 (антипеллагрический, никотиновая кислота или ниацин, никотинамид или ниацинамид); - В6 (адермин, пиридоксин, пиридоксаль или пиридоксамин); - В8 (мезоинозит); - Вс или В9 (фолиевая кислота, аминоптерин); - В12 (антианемический, цианкобаламин, оксикобаламин, фактор кроветворения); - В13 (оротовая кислота); - В15 (пангамовая кислота). В числе жирорастворимых следующие витамины: - А (антиксерофтальмический, ретинол); - Д (антирахитический, кальциферол); - Д2 (эргокальциферол); - Д3 (холекальциферол); - Е (антистерильный, витамин размножения, токоферол); - К (антигеморрагический, филлохинон, менахинон). Иногда физиологическим действием, характерным для того или иного витамина, обладает не одно, а несколько сходных по химическому строению соединений. Их называют витамерами. Для обнаружения витаминов в пищевых продуктах или других биологических объектах обычно пользуются качественными реакциями, основанными на образовании характерного окрашенного продукта реакции витамина с каким-либо химическим реактивом. ^ Жирорастворимый витамин А имеет несколько витамеров, из которых наиболее распространенным является А1 (ретинол или аксерофтол). Он был открыт в 1912 году в неомыляемой фракции жиров.  По химической природе витамин А1 представляет собой циклический ненасыщенный одноатомный спирт, содержит -ионовое кольцо и боковую цепь. В состав боковой цепи входят два остатка изопрена (метилбутадиена) и первичная спиртовая группа. Витамин А хорошо растворим в жирах и жирорастворителях бензине, хлороформе, ацетоне и т.д. Ретинол в форме сложных эфиров, обычно -глюкуроната, содержится в основном в животных продуктах, особенно в печени морских животных и рыб. Человек может удовлетворять свои потребности в витамине А и за счет растительной пищи. Провитамины А каротины, содержащиеся в свежих овощах и фруктах, могут подвергаться окислительному расщеплению в печени и слизистой оболочке кишечника до ретинола. При этом симметрично построенный -каротин дает две молекулы ретинола, а - и - каротины только по одной.  -каротин -каротин -каротинНедостаток ретинола или провитаминов А в пище особенно опасен для детей, так как практически отсутствует у новорожденных. У взрослых ретинол способен накапливаться в печени в количествах, обеспечивающих потребности организма в течение 2 лет. При недостатке витамина А в первую очередь страдает зрение и проявляются специфические заболевания. Ослабление зрения приводит к сумеречной или “куриной” слепоте, воспалению роговицы глаза (ксерофтальмия). У молодых растущих организмов происходит остановка роста, особенно костей, уменьшается вес, наступает общее истощение организма. Возникает сухость кожи и слизистых оболочек, что способствует проникновению в организм болезнетворных микробов, ведет к возникновению дерматитов, бронхитов, катаров верхних дыхательных путей, перерождаются клетки надпочечников, тканей центральной нервной и половой систем, слущиваются клетки эпителия. Механизм действия витамина А в поддержании нормального состояния эпителиальных тканей заключается в окислительно-восстановительных процессах, в которых активно участвует витамин А. Роль витамина А в поддержании остроты зрения заключена в том, что он входит в состав зрительного пурпура родопсина в палочках сетчатки глаз. Провитамины А каротины широко распространены в растениях листовой зелени шпината, салата, зеленого лука, а также в моркови и томатах. Много витамина А содержится в рыбьем жире, печени рыб, в говяжьей печени, желтках яиц, коровьем масле. Суточная потребность в ретиноле для взрослого человека равна 1,02,5 мг. ^ � Наличие витамина А в рыбьем жире можно выявить при помощи реакции Друммонда с концентрированной серной кислотой. При добавлении к рыбьему жиру концентрированной серной кислоты, обладающей водоотталкивающим свойством, появляется фиолетово-красное окрашивание, быстро переходящее в бурое. В основе реакции лежит способность серной кислоты отнимать от витамина А воду с образованием цветных продуктов реакции. Другой качественной реакцией может служить реакция с сульфатом железа (II). ^ Штатив лабораторный с пробирками; пипетки на 1 и 2 мл; рыбий жир; витамин А (0,05%-ный) в хлороформе; хлорид сурьмы (III) (насыщенный) в хлороформе; уксусный ангидрид; уксусная кислота ледяная; сульфат железа (II); серная кислота (концентрированная). ^ Ход работы В сухой пробирке смешивают 1 каплю рыбьего жира с 5 каплями хлороформа и добавляют 1 каплю концентрированной серной кислоты. Появляется голубое окрашивание, быстро переходящее в буро-красное. Рыбий жир можно заменить раствором ретинола. Жидкость приобретет фиолетово-красный цвет, переходящий в бурый. ^ Ход работы К 1 капле рыбьего жира или 0,05%-ного раствора витамина А в хлороформе добавляют 510 капель ледяной уксусной кислоты, насыщенной сульфатом железа (II), и 1 каплю концентрированной серной кислоты. Появляется голубое окрашивание, постепенно переходящее в розово-красное. Каротины дают при этой реакции зеленоватое окрашивание. ^ Метод основан на реакции витамина А с соляной кислотой в 1,3-дихлор-2-пропаноле. Соединение, полученное в результате этой реакции, имеет розово-фиолетовую окраску. Его содержание определяют колориметрически. ^ Фотоэлектроколориметр; водяная баня; ступка фарфоровая; делительная воронка на 100 мл; колба круглодонная с обратным воздушным холодильником на 25 мл; пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл; печень; хлороформ, освобожденный от влаги и свежеперегнанный; диэтиловый эфир; гидриновый реактив (2 мл концентрированной НСI смешивают с 98 мл 1,3-дихлор-2-пропанола, раствор хранят в темном прохладном месте); гидроксид калия (20%-ный спиртовой); стандартный раствор (10 мг метилового фиолетового и 2,3 мг сафронина растворяют в 1 мл дистиллированной воды, раствор можно хранить в течение 5 месяцев в темной склянке, из него готовят рабочий стандартный раствор, который используют в качестве эталона сравнения: к 12 мл рабочего стандартного раствора прибавляют 13 мл воды и тщательно перемешивают; 1 мл рабочего стандартного раствора по величине экстинкции (Е) соответствует 0,03 мг витамина А). ^ 5 г измельченной и растертой в фарфоровой ступке печени вносят в колбу с обратным воздушным холодильником, добавляют 10 мл 20%-ного спиртового раствора гидроксида калия, нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут до полного растворения ткани. Раствор переносят в делительную воронку и трижды экстрагируют порциями диэтилового эфира по 1015 мл. Эфирные вытяжки соединяют и отмывают от щелочи на делительной воронке дистиллированной водой. Вытяжку сушат безводным сульфатом натрия, фильтруют, фильтр дважды промывают эфиром по 5 мл. Эфир выпаривают на теплой водяной бане или в вакууме в струе углекислого газа, затем остаток растворяют в 5 мл хлороформа. В чистую сухую пробирку отмеряют 1 мл хлороформного раствора, прибавляют к нему 2 мл гидринового реактива. Энергично встряхивают и оставляют стоять в течение 5 минут при температуре 25 С, после чего колориметрируют. Расчет проводят по формуле:  , (1)где ^ 1 экстинкция испытуемого раствора; Е2 экстинкция стандартного раствора.
материале методом хроматографии на колонке Из растительного материала -, - и -каротины извлекают 96%-ным этиловым спиртом, а затем переводят их в бензин или петролейный эфир. Из бензинового раствора удаляют каротиноидные пигменты ксантофиллы, ликопин или другие методом хроматографической адсорбции на колонке с оксидом алюминия или оксидом магния. Количество каротина в очищенном бензиновом растворе или растворе в петролейном эфире определяют колориметрически. В качестве эталона сравнения используют раствор азобензола, который стандартизован по чистому каротину. ^ Фотоэлектроколориметр; колонка с адсорбентом; воронка делительная на 100 мл; колбы для фильтрования под вакуумом (Бунзена) 2 шт.; воронка Бюхнера с наружным диаметром 110 мм; колбы мерные на 50 мл и 100 мл; цилиндры измерительные с носиком на 50 мл 2 шт.; терка; морковь или другой растительный материал; оксид алюминия, просеянный через сито с отверстиями 0,25 мм, или оксид магния, доведенный до постоянной массы нагреванием в сушильном шкафу при температуре 100105 С; вата; кварцевый песок; стандартный раствор азобензола (растворяют 0,145 г перекристаллизованного азобензола в 100 мл 96%-ного этилового спирта и разбавляют в 10 раз 96%-ным спиртом); карбонат магния активированный (соль нагревают при температуре 200 С в течение 1 часа, рассыпают тонким слоем на стекле и оставляют на воздухе на 1718 часов); карбонат натрия безводный; сульфат натрия безводный. ^ 1020 г измельченной на терке моркови тщательно растирают в ступке с кварцевым песком и небольшим количеством безводного карбоната натрия. Затем в ступку приливают 50 мл 96%-ного этилового спирта и вновь растирают. После растирания материала со спиртом в ступку добавляют порциями 2030 мл бензина или петролейного эфира. Смесь снова тщательно растирают, после чего гомогенат фильтруют на воронке Бюхнера, ополаскивая дважды ступку бензином и промывая материал на фильтре небольшими порциями бензина до тех пор, пока не исчезнет окраска стекающего фильтрата. Бензиновый или петролейный фильтрат переносят в делительную воронку и смесь тщательно перемешивают. Пигменты, в том числе и каротины, переходят в верхний бензиновый или петролейный слой. Бензиновый раствор каротиноидов сушат безводным сульфатом натрия. Полученный бензиновый раствор пигментов пропускают через хроматографическую колонку (рисунок 1), представляющую собой стеклянную трубку длиной 1520 см и диаметром 1,01,5 см. Эту трубку вставляют в резиновую пробку, предварительно подобранную к колбе для отсасывания, соединенной с водоструйным насосом. В нижнюю часть адсорбционной колонки помещают небольшой кусочек ваты и заполняют колонку на 57 см небольшими порциями кашицы из адсорбента и бензина или петролейного эфира. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха между адсорбентом и стенками трубки и следить за тем, чтобы перед началом адсорбции и во время ее верхний слой кашицы был покрыт небольшим слоем бензина или петролейного эфира во избежание прохождения воздуха в адсорбционную колонку.  1 хроматографическая колонка; 2 колба Бунзена; 3 комочек из ваты; 4 адсорбент Рисунок 1 Установка для хроматографического разделения каротиноидов на оксиде алюминия К подготовленной таким способом колонке подключают насос. Его регулируют таким образом, чтобы бензин равномерно пропитал весь адсорбент, и скорость вытекания его из колонки составляла 2530 капель в 1 минуту. Затем в колонку наливают бензиновый раствор пигментов, не изменяя скорости отсасывания и следя за тем, чтобы на поверхности адсорбента постоянно был слой бензина. Бензин через колонку просасывают до тех пор, пока весь каротин не пройдет в приемник и вытекающий из колонки элюат перестанет быть окрашенным. Хроматографическое разделение каротиноидов на оксиде алюминия представлено на рисунке 2.  1 ксантофилл; 2 ликопин; 3 -каротин; 4 -каротин; 5 -каротин Рисунок 2 Хроматографическое разделение каротионоидов на оксиде алюминия Для количественного определения каротинов бензиновый элюат из колбы Бунзена количественно переносят в мерную колбу на 50 или 100 мл, в зависимости от объема жидкости, и доводят бензином до метки. Плотность окраски раствора каротинов сравнивают с таковой стандартного раствора азобензола с учетом, что 1 мл раствора азобензола соответствует 0,00235 мг - или -каротина. Содержание каротинов в исследуемом материале вычисляют по формуле:  , (2)где ^ объем бензинового раствора каротинов, мл; Е1 показание фотоколориметра для стандартного раствора азобензола; Е2 показание фотоколориметра для исследуемого раствора каротина; а масса материала, г. ^ Витамин В1 (тиамин, антиневритный витамин) является соединением, содержащим тиазоловое и пиримидиновое кольца:  Наличие серы и азота в молекуле дало основание назвать витамин В1 тиамином. Витамин В1 играет важную роль в процессах превращения углеводов, так как входит в состав фермента пируватдекарбоксилазы, расщепляющего образующуюся при диссимиляции углеводов пировиноградную кислоту на уксусный альдегид и СО2. Витамин В1 входит в состав пируватдекарбоксилазы в виде фосфорного эфира тиаминпирофосфата. Недостаток витамина В1 в пище человека приводит к накоплению в крови и тканях пировиноградной кислоты сильного яда для нервной системы. При В1-авитаминозе нарушаются также процессы декарбоксилирования таких кетокислот, как щавелевоуксусная, кето-глутаровая и другие, что также сильно сказывается на состоянии организма. При недостатке витамина В1 развивается заболевание, получившее название полиневрита (болезнь бери-бери), в основе которого лежат дегенеративные изменения нервов. В результате теряется кожная чувствительность, нарушается нормальная моторика желудочно-кишечного тракта, появляются сердечные боли и в итоге наступает паралич. В среднем суточная норма витамина В1 для взрослого человека составляет 23 мг. Витамином В1 богаты пшеничные и рисовые отруби, зародыши злаков, внутренние органы животных (печень, почки, сердце). Особенно много витамина В1 в дрожжах. ^ Оборудование и реактивы Облучатель ультрафиолетовый для обнаружения витаминов в растворе; пипетки с одной меткой на 1 мл (2 шт.); штатив лабораторный с пробирками; основной раствор сульфаниловой кислоты для получения диазореактива (0,9 г сульфаниловой кислоты растворяют в 9 мл концентрированной соляной кислоты с последующим разбавлением дистиллированной водой до 200 мл); нитрит натрия (5%-ный); бикарбонат натрия (10%-ный); тиаминхлорид; гидроксид калия (10%-ный); гексациано-(III)-феррат калия (5%-ный); изобутиловый спирт.
Для получения диазореактива к 5 каплям 1%-ного раствора сульфаниловой кислоты прибавляют 5 капель 5%-ного раствора нитрита натрия. К полученному диазореактиву добавляют на кончике стеклянной палочки небольшое количество тиаминхлорида в порошке, а затем по стенке наклоненной пробирки осторожно вносят 5-7 капель 10%-ного раствора бикарбоната натрия. На границе двух жидкостей появляется кольцо розово-оранжевого цвета.
Тиамин под действием железосинеродистого калия окисляется в тиохром пигмент желтого цвета, согласно уравнению: тиаминхлорид  тиохром^ При окислении тиаминхлорида гексациано-(III)-ферратом калия в щелочной среде (см. реакцию выше) образуется тиохром, обладающий сильной голубой флюоресценцией в ультрафиолетовых лучах. Для количественного определения тиамина сравнивают флюоресценцию окисленных стандартных растворов тиаминхлорида и испытуемых растворов на флюорометре. ^ Флюорометр; термостат на 45С; баня водяная; ступка фарфоровая; колба мерная на 100 мл; воронки делительные на 20 мл (2 шт.) и на 100 мл; пипетки, градуированные на 1 и 5 мл (по 2 шт.); пробирки с притертыми пробками; ферментный препарат фосфатазы (мицелий гриба Penicillium высушивают при температуре 45С и используют в качестве ферментного прапарата); 2%-ный раствор гексациано-(III)-феррат калия (готовится перед работой); 30%-ный раствор гидроксида калия; 0,1 N раствор серной кислоты; изоамиловый спирт; толуол; 2,5 М раствор ацетата натрия, содержащий ферментный препарат фосфатазы (100 мг сухого мицелия гриба настаивают с 10 мл 2,5 М раствора ацетата натрия в течение 1 часа, затем фильтруют); стандартный раствор тиаминхлорида (10 мг тиаминхлорида растворяют в 100 мл 0,01 N растворе соляной кислоты, 1 мл полученного раствора доводят водой до 10 мл. В 1 мл такого раствора содержится 1 мкг тиаминхлорида). ^ 510 семян гречихи или другого растительного материала тщательно растирают в фарфоровой ступке с 1015 мл 0,1 N раствора серной кислоты, добавляя ее небольшими порциями. Растертый материал количественно переносят в колбу на 100 мл и доводят объем смеси до 75 мл раствором 0,1 N серной кислоты. Содержимое колбы нагревают в течение 45 минут на кипящей водяной бане при частом помешивании. После охлаждения в колбу прибавляют несколько капель толуола и 5 мл 2,5 М раствора ацетата натрия, содержащего ферментный препарат фосфатазы (рН 4,04,5). Для высвобождения связанного тиамина колбу выдерживают 2 часа в термостате при температуре 4045С. После охлаждения содержимое колбы переносят в мерную колбу на 100 мл, доводят до метки, хорошо перемешивают и фильтруют. Для освобождения от примеси других флюоресцирующих веществ к 50 мл полученного фильтрата добавляют 25 мл изоамилового спирта и встряхивают в течение 2 минут. После расслаивания смеси в делительной воронке спирт отбрасывают. Повторяют эту операцию 2-3 раза. Дальнейшую работу ведут с водной вытяжкой. Количество гексациано-(III)-феррата калия, необходимого для окисления тиамина, подбирают эмпирически. С этой целью в шесть пробирок с притертыми пробками наливают по 2 мл 30%-ного раствора гидроксида натрия и по 5 мл полученной водной вытяжки тиамина, добавляя в пять из них окислитель в количестве 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 и 0,5 мл соответственно. Содержимое пробирок интенсивно встряхивают в течение 2 минут. В некоторых пробирках возникает желтая окраска. Тот объем окислителя, при добавлении которого появляется желтая окраска, не исчезающая в течение последующих 30 секунд после встряхивания, используют далее при проведении определения тиамина. В две делительные воронки наливают по 2 мл 30%-ного раствора гидроксида натрия и в одну из них (опытная проба) подобранное эмпирически требуемое количество 2%-ного раствора гексациано-(III)-феррата калия, после чего оба раствора тщательно перемешивают. Далее пипеткой в обе воронки быстро вносят по 5 мл исследуемого раствора и содержимое воронок вновь перемешивают. Затем в каждую воронку добавляют по 10 мл изоамилового спирта и в течение 2 минут интенсивно встряхивают. После расслаивания смеси слой воды удаляют, а изоамиловый слой промывают еще 5 мл воды. В воронки добавляют по 2 мл этилового спирта для осветления растворов. Опытную и контрольную смеси вновь встряхивают и измеряют их флюоресценцию. Стандартный раствор тиамина окисляют так же, как и испытуемый, используя для этого 0,05 мл окислителя. Для стандартного раствора находят поправку на флюоресценцию сопутствующих веществ, для чего 1 мл стандартного раствора тиамина обрабатывают описанным выше способом без добавления окислителя. Содержание тиамина в исследуемом материале находят по формуле:  , (3)где ^ показания флюорометра для испытуемого окисленного раствора; В показания флюорометра для испытуемого раствора без окисления; А1 показания флюорометра для 1 мкг окисленного тиамина; В1 показания прибора для 1 мкг неокисленного тиамина; V общий объем экстракта, мл; V1 объем экстракта, взятый для определения; а масса материала, г.
Витамин В2 представляет собой метилированное производное изоаллоксазина, к которому в положении 9 присоединен спирт рибитол. Его химическое название “рибофлавин” отражает наличие в молекуле остатка рибитола и желтый цвет окисленной формы препарата:  рибофлавин (6,7-диметил-9-рибитизоаллоксазин) В виде фосфорного эфира (по концевой гидроксильной группе рибитола) или в виде более сложных соединений (в частности, с нуклеотидами) рибофлавин входит в состав окислительно-восстановительных ферментов, участвующих в переносе водорода. В2-авитаминоз у человека выражается в прекращении роста, выпадении волос, поражении слизистых оболочек (особенно в уголках рта), быстрой утомляемости зрения, понижении работоспособности, нарушении нормального синтеза гемоглобина, патологических изменениях в нервной системе. Ежедневная потребность человека в витамине В2 составляет 24 мг. Наиболее богаты рибофлавином дрожжи, печень, почки, сердце, а также молоко и зеленые овощи. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям