Сравнительные физико-химические и морфологические свойства трубчатых (пястных) костей крупного рогатого скота и лосей 06. 02. 01 диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных
|
|
Скачать 377.2 Kb.
|
|
На правах рукописи Пименов Михаил Юрьевич Сравнительные физико-химические и морфологические свойства трубчатых (пястных) костей крупного рогатого скота и лосей 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Кострома 2011 Работа выполнена на кафедре анатомии и физиологии животных ФГОУ ВПО «Костромская государственная сельскохозяйственная академия» Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор Ложкин Эдуард Федорович. Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор Зеленевский Николай Вячеславович; доктор ветеринарных наук, профессор Сулейманов Фархат Исмаилович. Ведущая организация − ФГОУ ВПО «Вятская государственная сельскохозяйственная академия». Защита состоится “ 02 ” июня 2011 г. В 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.01 при ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, Черниговская ул., 5. Тел/факс 388-36-31. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины». Автореферат разослан “__02 _” апреля 2011 г. и размещен на сайте ФГОУ ВПО СПбГАВМ http: // spbgavm/ru. Ученый секретарь диссертационного совета доктор ветеринарных наук Крячко О.В. ^ Актуальность темы. Установление закономерностей адаптационных возможностей костной системы млекопитающих в условиях измененного внешнего механического поля является одной из актуальных проблем современной медико-биологической науки и сельскохозяйственной практики. В практике скотоводства (разведения крупного рогатого скота и лосей) животные в течение многих поколений оказываются в весьма ограниченных условиях подвижности и проявления других поведенческих реакций (Аврунин А.С., Иоффе И.Д., 2001; Мещеряк М.С., 1964; Мирзоян Э.И., 1961). Созданный искусственно режим содержания качественно отличается от природных условий, вследствие этого не может не сказаться на физиологическом состоянии животных, их физическом развитии, репродуктивных способностях и в конечном итоге на количественных показателях мясо-молочности. Изучаемый вопрос тесно примыкает к проблеме адаптации, в частности, здорового организма к экстремальным условиям внешней среды. Это имеет большое теоретическое и прикладное значение. В настоящее время этот вопрос еще не получил, четкой разработки. Сдерживающим фактором является не только отсутствие общей количественной теории гомеостаза, но и отсутствие информативных критериев оценки и прогнозирования состояния организма в конкретных ситуациях. Повышенный интерес к исследованию структуры и механического поведения компактной костной ткани, как представителя класса жестких биокомпозитных материалов, вызван двумя обстоятельствами: во-первых, благодаря познанию внутреннего строения и механических свойств костной ткани станет возможным использование полученных результатов для усовершенствования уже существующих, и создания некоторых новых схем армирования конструкционных материалов, в том числе и искусственной костной ткани, реологически соответствующей своему биопрототипу, во-вторых, исследование костной ткани, как адаптивной композитной структуры, способной перестраиваться под воздействием различных факторов, является, несомненно, важным фактором, при разработке методов диагностики ее физического состояния, как в нормальных, так и в экстремальных условиях. Костная ткань способна эффективно работать при различных видах нагружения и перестраивать свою структуру, благодаря особому ее строению. Основное место в этой структуре принадлежит двум составляющим - органической и минеральной компонентам, изучение механических свойств которых важно для объяснения работы костной ткани, как биокомпозита. ^ Изучить морфологические и физико-химические особенности пястной трубчатой кости крупного рогатого скота и лосей, в сравнительном и видовом аспекте. Для выполнения цели работы были поставлены следующие задачи: 1) Сопоставить анатомические особенности пястной трубчатой кости у крупного рогатого скота и лосей с целью выяснения уровня их адаптивных возможностей. 2) Изучить макроморфометрические характеристики пястной кости лосей и крупного рогатого скота в постнатальном онтогенезе. 3) Установить связь морфологических индексов пястных костей с их прочностными характеристиками в возрастном аспекте. 4) Определить содержание и влияние основного макроэлемента костной ткани – гидроксиапатита кальция на прочностные характеристики пястной кости у крупного рогатого скота и лосей. 5) Выявить направленность качественных и количественных изменений в структурной организации пястной кости в возрастном аспекте у крупного рогатого скота и лосей. 6) Провести сравнительный анализ влияния среды обитания на развитие трубчатых костей, в частности, пястной у крупного рогатого скота и лосей. ^ На основании макро - и микроморфологии, биомеханики, химии, многомерной статистики разработаны критерии количественной оценки адаптивных возможностей костной системы животных соответственно для крупного рогатого скота и лосей. Показано, что длительная гипокинезия инициирует замедление темпов остеопластического процесса и внутренней реконструкции кости. На основании оценки структурных адаптаций скелета у животных разных видов и находящихся в условиях различной биодинамики выявлено, что динамические механические нагрузки являются одним из факторов, определяющих уровень ростовых и реформационных процессов, протекающих в кости. В результате изучения структурных особенностей пястных костей крупного рогатого скота и лосей на микро уровне было выявлено, что преобладание биостатики ведет к формированию кости малоприспособленной к выдерживанию нагрузок (крупный рогатый скот), которые достаточно легко выдерживает кость, находящаяся в более длительном состоянии биодинамики (лось), степень преобладания которой формирует отличную картину микроархитектоники костной ткани. У этого животного впервые определены физико-химические и гистологические особенности трубчатой кости лосей разного возраста. ^ Установлено, что у лосей, отдельно взятые морфометрические показатели меняются (варьируют), но соотношения между ними остаются постоянными на всем периоде постнатального онтогенеза. Этот принцип является одним из свойств костного гомеостаза. Подтверждены положения о высокой мобильности костной системы, что служит теоретическим обоснованием практически значимому выводу о принципиальной возможности усиления адаптивных свойств разводимых животных путем целенаправленного воздействия на скелет. Разработано в процессе изучения свойств и особенностей пястных костей у крупного рогатого скота и лосей ряд модификаций к общепринятым методикам по проведению исследований на пястных трубчатых костях в условиях лаборатории.
Полученные результаты могут быть использованы для прогнозирования физиологического состояния опорно-двигательного аппарата животных, рационализации режимов содержания в промышленном животноводстве с целью повышения его экономической эффективности. Найденная сравнительная (крупный рогатый скот, лось) адаптационная особенность микроструктур кости, подтвержденная при помощи микроморфологии архитектоники костной ткани, учитывающая особенности структурной организации и адаптивного ремоделирования кости при действии биодинамического и статического факторов, является существенным вкладом в морфологию опорно-двигательного аппарата животных. Они представляют интерес для общей физиологии скелета, для теории и практики, для спортивной медицины и физиологии труда. ^
^ Основные положения и результаты исследований используются в учебном процессе Омского, Оренбургского Ставропольского, государственных аграрных университетов, Брянском государственном университете имени академика И.Г. Петровского, Рязанском государственном аграрном университете имени Костычева, Ивановской государственной сельскохозяйственной академии, Чувашской государственной сельскохозяйственной академии, Вятской государственной сельскохозяйственной академии, Ярославской государственной сельскохозяйственной академии, Витебской государственной академии ветеринарной медицины, Санкт-Петербургской академии ветеринарной медицины, Уральской государственной академии ветеринарной медицины. ^ Отдельные результаты проводимых исследований были доложены, обсуждены и одобрены на 60-й и 61-й международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы АПК» (Кострома, 2009 и 2010). ^ По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 2 - в рецензируемом издании, рекомендованном ВАК России. ^ Диссертационная работа изложена на 131 странице компьютерного текста и включает разделы: общая характеристика работы, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения, список литературы. Список использованной литературы включает 160 источников, в том числе 55 - зарубежных. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 41 рисунками (фотографиями, микрофотографиями, диаграммами). ^ Материал и методы исследования В настоящее время развитие сельскохозяйственных животных изучается в довольно широких масштабах и различными методами. При этом изучается в основном постнатальное развитие, в котором основное внимание уделяется влиянию морфологическому и физико-химическому составу костной ткани трубчатых костей крупного рогатого скота и лосей. Перед тем, как приступить к более обстоятельному изучению пястных костей были определены макроморфометрические показатели животных, трех возрастных групп, как у крупного рогатого скота, так и у лосей, а именно: длина пястной кости, проведение промеров трех участков пястной кости. Для определения макроморфометрических показателей использовалось измерительная лента - полуавтомат максимальной длиной 3 метра (с миллиметровой градуировкой). В соответствии с поставленной задачей, мы исследовали развитие крупного рогатого скота и лосей (n=30) в процессе их онтогенеза (три возрастных периода) на примере изучения пястных костей. В отношении крупного рогатого скота исследования проводили на примере костромской породы. Биоматериал по крупному рогатому скоту (n=15) был взят с убойной площадки в ОАО племенном заводе «Караваево». Были взяты пястные трубчатые кости от животных различного возраста: 6- мес., 12- мес., и 18- мес. Следует отметить, что в «Караваево» действует привязная система содержания взрослых животных крупного рогатого скота. Костный биоматериал лосей (n=15) брался от диких животных, как от павших животных, так и при отстреле в период охоты их в Костромской области. Так же как и у крупного рогатого скота, пястные трубчатые кости были взяты от животных трех возрастных периодов: 6-мес., 12-мес. и 18-мес. При определении возраста лосей мы исходили из довольно определенных сроков гона их (1 сентября - 15 октября), времени рождения лосят (май месяц). Отобранный костный материал тщательно упаковывался в полиэтиленовые пакеты, которые в последующем укладывались в специальный контейнер. Крупные кости взвешивались на весах до 10 кг с точностью до одного грамма, а мелкие – на весах до 100 г с точностью до 1 мг. Измерялась длина и периметр (обхват) костей. Учитывая неодинаковую выраженность мышечных бугров костей у животного даже одного и того же возраста, за длину кости мы принимали расстояние между ее сочленовными поверхностями. Для сохранения и последующего изучения трубчатые кости лосей и крупного рогатого скота подвергались легкому, в течение 30 минут вывариванию и в последующем были помещены в холодильную установку. В дальнейшем, измеряя длину каждой кости в отдельности, при помощи листовой пилы пястные кости разрезали на равные отрезки. По завершению подготовки биоматериала, отрезки пястной кости были отсортированы по ее участкам: диафизу и эпифизам (проксимальному и дистальному). В диафизарном участке по два отрезка, в эпифизарных – проксимальных и дистальных по одному. Отобранный материал, был подвергнут исследованию в нескольких направлениях: определение физических свойств костной ткани, пястных трубчатых костей на прессовальной машине (ПМ-3), определение содержания неорганического вещества путем помещения костного материала в муфельную печь, также проводилось определение плотности и порозности костной ткани пястной трубчатой кости, изучение гистологической структуры трубчатых костей крупного рогатого скота и лосей, а также изучалась микроморфология кристаллов гидроксиапатита кальция (рис.1.). Для каждого вида исследования были подобраны и тщательно проработаны методические программы. Практически во все общепринятые методики были нами внесены соответствующие типу исследования модификации.  Рис. 1. Методы исследования пястной кости крупного рогатого скота (n=15) и лосей (n=15) При определении свойств упругости пястной кости у крупного рогатого скота и лосей придерживались строгих правил и подходов на пути осуществления данного исследования. Сущность этих требований заключается в следующем:
Перед тем как приступить к определению упругости костных участков кости крупного рогатого скота и лосей, из цельных костей, при помощи листовой пилы были выпилены костные отрезки от каждого отдела пястной кости. Перед выпиливанием цельная кость прочно фиксировалась в тисках специального фиксирующего устройства, чтобы избежать возникновения неровностей при спиливании, которые могли бы существенно повлиять на результаты исследования. Подготовленные таким образом костные отрезки имели одинаковую оптимальную длину 4,5 см и гладкие ровные поверхности. Затем, все костные отрезки пястной кости предварительно измерили на аналитических весах их изначальную массу, положили в фарфоровые тигли и поместили в термостат для сушки при температуре 180º С на 45 минут. а) Проведение испытаний
б) Испытание на сжатие
Определение плотности и порозности трубчатой (пястной) кости у крупного рогатого скота и лосей. Среднюю плотность образца костной ткани определяли отношением его массы к объему. Для чего высушенную до постоянной массы и обезжиренную костную ткань взвешивали на аналитических весах. Геометрические размеры определяли микрометром или путем взвешивания в жидких средах: воде. Кость или ее фрагмент помещали в сосуд с жидкостью так, чтобы образец полностью был погружен в нее, и взвешивали на аналитических весах. Расчет объема производили по следующей формуле (в нашей модификации):  , где - объем; - разность массы кости в жидкости и массы кости на воздухе; – плотность жидкости.Для исследования степени порозности находили объем высушенного и обезжиренного образца костной ткани в инертных, по отношению к кости растворителе: ксилоле - это начальный объем кости. Затем выдерживали образец в растворителе в течение 7 суток при нормальных условиях для заполнения пор растворителем. При достижении максимальной массы рассчитывали объем по приведенной выше формуле. Это так называемый «чистый» объем кости. Разница между начальным и конечным объемами определяется как объем пор. Отношение «чистого» объема к начальному, отражает степень порозности костной ткани. Воздействие высокой температуры на трубчатые (пястные) кости крупного рогатого скота и лосей с целью определения содержания органических и неорганических веществ в различных участках кости. Для проведения эксперимента было взято 30 фарфоровых тиглей по числу отобранных костных участков (отрезков пястной кости) по каждому из двух видов животных. Костные отрезки отбирались из разных участков пястной трубчатой кости (диафиз, эпифиз проксимальный, эпифиз дистальный). Костные отрезки взвешивались на аналитических весах, как перед началом эксперимента (до сжигания), так и по завершению его (после сжигания). Исследование было поделено на две части, по очередности их следования. Первая часть заключалась в отмеривании навески костных отрезков пястной кости крупного рогатого скота, и помещение их в муфельную печь при температуре 600º С. Вторая часть исследования стало помещение в муфель 20 (в 2 партии) тиглей с уже отмеренной навеской костных отрезков пястной трубчатой кости лосей. Сжигание проводилось при температуре 600º С. Определение содержания неорганического вещества (гидроксиапатита кальция) в пястных костях крупного рогатого скота и лосей основывалась на сжигании пробы концентрированными кислотами (HNO₃, H₂SO₄, HClO₄). Особенность данного исследования заключалась в незначительной затрате времени, но постоянном слежении за ходом процесса, достаточно умеренном расходовании кислот и более качественном разложении исследуемого органического вещества. В нашей модификации этот метод был назван методом выделения кристаллов кальция. Применение цельной методики – без модификаций, вело к значительному увеличению времени проведения исследования, а также приводило к частой замене растворов кислот, для очищения от органических остатков во время проведения исследования, что увеличивало расход используемых кислот. Пробы выдержали при температуре 135° С в среднем от 1 часа 15 минут (крупный рогатый скот), до 1 часа 35 минут (лоси). После чего массу каждого из них измеряли повторно (разница в массе костных отрезков крупного рогатого скота и лосей учитывалась при подсчете результатов по окончании проведения исследования). Количество потерянной влаги составляло после сушки в среднем от 8 мл до 14 мл. Колебание в весе костных отрезков составляло друг от друга при этом от 3 до 6 грамм. Далее, исследуемый материал помещался в емкость из термостойкого стекла - объемом 250 мл, в которую прилили 75 мл - H₂SO₄, 75 мл - HNO₃, 35 мл - HClO₄, в соотношении 2:2:1. Длительность фиксации исследуемого материала в смеси кислот составило 35 минут для каждого из отрезков пястной трубчатой кости, как крупного рогатого скота, так и лосей. Заливка биологического материала происходила последовательно. По мере того, как у первых емкостей с исследуемым материалом процесс сжигания завершался, другие заливались смесью кислот и оставлялись в течение определенного времени (35 минут) для проведения фиксации. После этого на каждую электроплитку (использовалось 3 электроплитки) имеющую спираль, и закрытую закрыта асбестовым подносом, каркас которого составляла металлическая сетка ставилось по 4 термостойких стакана. Сжигание исследуемого материала производили, постепенно увеличивая температуру до тех пор, пока раствор не стал слегка желтоватым и на дне емкости не отложился беловатый осадок (гидроксиапатит кальция). По завершении эксперимента образовавшийся осадок промывался деионезированной водой с последующей фильтрацией. Отфильтрованный осадок высушивался при температуре 65° С в течение одного часа. По окончании сушки проводили измерение массы высушенного гидроксиапатита кальция. В последующем, отбирали по небольшой порции от подвергнутого исследованию костного материала (от каждого из участков пястной кости – диафиза, проксимального и дистального эпифизов) кристаллы гидроксиапатита кальция и помещали их под микроскоп с тем, чтобы изучить микроморфологию этих кристаллов. Данное исследование проводили в программе «Motic Images Plus 2,0». Проведение исследования декальцинации и гистоморфологии пястной кости крупного рогатого скота и лосей трех возрастных групп. Общепринятая методика была нами модифицирована. Преобразование методики относилось к подбору декальцинирующих жидкостей, по характеру чувствительности исследуемого костного материала в зависимости от возрастного периода (6; 12 и 18 месяцев) как для крупного рогатого скота, так и лосей. Применение цельной методики без модификаций ведет к ухудшению качества костного биоматериала: растворению костных отрезков в растворе декальцинирующей жидкости, увеличению времени пребывания в декальцинирующем растворе, некачественной (неполной) декальцинации объектов исследования. Для осуществления исследования было взято 30 специальных емкостей с плотно притертой крышкой, 1400 мл раствора 7,5 % - азотной кислоты, 600 мл – 17 % - соляной кислоты и 600 мл - уксусной кислоты; 1400 мл – 40 % спирта, 1400 мл – 70 % спирта, 1400 мл – 90 % спирта, 1400 мл - хлороформа, дистиллированная вода, парафин, воск пчелиный, квадратной формы картонные формочки размером 1,5  1,5 см, пинцет, препаровальные иглы - прямые и изогнутые. А также волосяная кисточка для снятия срезов с микротомного ножа, фильтровальная бумага, предметные (размером 7525 мм, толщиной 3 мм) и покровные стекла (0,15-0,2 мм толщины), карандаш по стеклу, чашки Петри, пипетки. Перед началом проведения эксперимента на рабочем столе, предназначенном для непосредственной работы по приготовлению препаратов, накрыли стеклом и расположили под ним небольшие (912 см) листы белой и черной бумаги. Первым этапом в данном исследовании стало проведение декальцинации.Декальцинация достигается обработкой костной ткани с помощью декальцинирующих жидкостей обладающих свойствами растворять неорганические соли, не повреждая структурные элементы кости. Декальцинация пястных костей проводилась в водном растворе азотной кислоты, концентрация которой была подобрана нами отдельно, как для крупного рогатого скота, так и лосей и составила 10 % и 7,5 % соответственно. Такая концентрация была подобрана для пястных костей, взятых от животных в возрасте 18 месяцев. Раствор азотной, соляной кислот и дистиллированной воды, в соотношении: 3:2:1 использовался для декальцинации костей отобранных от животных в возрасте 12 месяцев. В растворе соляной и уксусной кислот, в соотношении 2,5:1 декальцинировалась пястная кость 6-ти месячных лосят и крупного рогатого скота. Для приготовления рабочего раствора в мерную посуду наливалась 7,5-8,5 мл химически чистая концентрированная азотная кислота и доливалась до 100 мл дистиллированной водой. После того как, налив нужное количество жидкости в специальную стеклянную колбу объемом 100 мл с плотно притертой резиновой пробкой, подвешивался подготовленный к декальцинации костной осколок пястной трубчатой кости. Раствор сменялся ежедневно до наступления полной декальцинации. Средняя продолжительность декальцинации участков пястной трубчатой кости в азотной кислоте составляет 1-1,5 суток. По истечению определяемого временного отрезка костный осколок тщательно промывался в течение 1-2 суток в проточной воде. При декальцинации костных участков пястной трубчатой кости в растворе соляной и уксусной кислот в химический стакан приливалось 66 мл соляной кислоты и 34 мл уксусной кислоты. Продолжительность нахождения костного отрезка (участка кости) в этом растворе составила 9 часов. При применении раствора азотной, соляной кислот и воды, в соотношении 3:2:1 (50 мл - азотной кислоты, 33 мл - соляной кислоты и 17 мл - дистиллированной воды) продолжительность декальцинации костного отрезка (участка пястной кости) составила 11 часов. По окончании проведения декальцинации лишенный кальция костный материал зафиксировали этиловым спиртом, относящимся к группе простых фиксаторов. Цель фиксации – убить клетку, прекратить происходящие в ней процессы (прежде всего ферментативные) и по возможности, сохранить ее прижизненное строение. Фиксация проводилась нами в соответствии с общими правилами. Используемые нами кусочки пястной кости длиной 1,0 0,5 см и фиксировались в течение 6 часов от взрослых (18 месяцев) животных, как крупного рогатого скота, так и лосей. От животных в возрасте 12 и 6 месяцев фиксация длилась 4,5 часа. Разность в интервалах времени заключалась в особенностях тканевой структуры кости взятых для исследования от животных разного возраста. Следующим этапом исследования стало промывание. Цель этой процедуры - освободить исследуемый объект (костную ткань) от излишнего количества фиксатора. Промывание нами кусочков костной ткани производилось в проточной водопроводной воде. Исследуемый объект заворачивали в марлю, подвешивали за нитку и опускали в сосуд с проточной водой. Использование марли обеспечивает постоянную циркуляцию воды. Верх сосуда закрывали марлей и проделывали в ней небольшое отверстие. На водопроводный кран привязывали шнур (полоску бинта), свободный конец которого пропускали через марлю в сосуд и пускали по нему несильную струю воды. Время промывания кусочков костной ткани составило 24 часа.После промывания кусочки костной ткани подвергли дальнейшему уплотнению путем обезвоживания в спиртах увеличивающейся концентрации, применили так называемый гистологический ряд. Для проведения этой процедуры приготовили 30 колбочек с широкими горлышками и хорошо притертыми резиновыми пробками. Затем залили их спиртами возрастающей концентрации: 40 %, 50 %, 60 %, 70 % + раствор йода 5 % , 96 % (по две колбочки) и 100 % (две колбочки) абсолютный спирт. Такой последовательный ряд получил название гистологической батареи. Спирты нужной крепости приготавливали заранее, по специальной таблице разведения из 96 % этилового спирта. Для приготовления абсолютного этилового спирта использовали обычный спирт - ректификат, содержащий 96 % чистого спирта и 4 % воды. Главным условием для получения абсолютного спирта является извлечение воды. Нами применялось обезвоживание при помощи прокаленного медного купороса (сульфат меди). Для удаления спирта и подготовки к пропитыванию парафином материал обрабатывался хлороформом. Обезвоженные и уплотненные костные отрезки перекладывались из 90 % спирта в смесь 90 % с хлороформом (1:1) на 6 часов, а затем в чистый хлороформ, где они вначале плавали, выступая над поверхностью, а затем по мере пропитывания постепенно погружались. В процессе удаления спирта хлороформ меняли 3 раза каждые 20 минут часов при величине костного отрезка 1,0 0,5 см, его держали в хлороформе 60 минут. Затем соблюдая принцип постепенного замещения хлороформа парафином – отрезки пястной кости помещались в смесь равных объемов парафина и хлороформа, где находились при температуре 37° С 4,5 часа (крупный рогатый скот и лоси 18-ти месяцев) и 3 часа (крупный рогатый скот и лоси 12-ти и 6-ти месяцев). Для полного освобождения от парафина костные отрезки проводились через 3 порции расплавленного парафина. Время нахождения костных отрезков пястной кости, при величине 1,00,5 см колебалось от 5 часов для костей от взрослых животных (18 месяцев), до 3,5 часов для костей, взятых от животных в возрасте 12 и 6 месяцев.Следующим этап – это проведение пропитывания и заливки костных отрезков пястной кости крупного рогатого скота и лосей. Наиболее употребительным для этих целей является парафин. Нами применялся обычный продажный парафин. В таком парафине значительное содержание газообразных примесей, которые при заливке образуют пузырьки, придающие парафину повышенную ломкость и значительно ухудшающие качество резки исследуемого материала. Для избавления от этих примесей, свежий парафин оставили на 3,5 часа в расплавленном виде в 10 чашках Петри, для приготовления 120 парафиновых блоков (для каждого возрастного периода, как крупного рогатого скота, так и лосей по 20 блоков). Это делалось с тем, чтобы увеличить площадь для выделения газов при температуре 75º С. Для поддержания такой температуры чашки Петри поместили в сушильный шкаф, предварительно подложив под дно чашки два деревянных бруска длиной 10 см, шириной 2 см и толщиной 7 мм. Такая подготовка парафина к использованию велась в течение 2-х дней. После этого в расплавленный парафин добавили 12 % воска, для того чтобы придать парафину большую эластичность. Предназначенный для заливки парафин подогревался до 60° С и аккуратно наливался в подготовленную (из картона в виде квадрата 2,0 2,0 см) формочку заполняя ее до самых краев и избегая образования пузырьков воздуха. Затем подогревался пинцет и быстро переносился на нем подготовленный к заливке объект в формочку с парафином и ориентировался в необходимом положении (продольном или поперечном по отношению к поверхности разреза). После чего формочку, содержащую костный отрезок, залитый в парафин, постепенно опускался в сосуд с водой и оставался плавать до полного застывания парафина.Наклейку блоков производили на деревянные бруски, предварительно обрезав канцелярским ножом все лишние выступающую за объект толщу парафина, с тем, чтобы улучшить доступ к исследуемому объекту. Получение срезов осуществлялось при помощи санного микротома (МС-2) полученные срезы достигали в толщину 5-7 мкм. Чтобы получились качественные гистологические срезы, выбрали необходимый угол наклона ножа (17º) и подобрали угол резания (30º). Выбор такого угла наклона объясняется тем, что плоскость заточки ножа расположена параллельно верхней поверхности блока. Предпочтение такому углу резания связано со свойствами парафина. Следующим этапом стало приготовление гистологических срезов. Наклеенный на деревянную платформу (размерами 9 2,5 см) парафиновый блок прочно закрепляли в зажиме микротома, расположив длинной осью параллельно длиннику микротома. Затем, установив необходимый угол резания и правильный угол наклона ножа, его прочно закрепляли винтовыми зажимами и расположили над блоком. После этого, регулируя винтами, механизм подачи, блок устанавливали таким образом, чтобы верхняя его плоскость находилась в горизонтальном положении и не доходила до лезвия ножа на 0,5-1 мм. Когда предварительная подгонка блока к ножу закончена, установили микрометрическую шкалу на получение толстых (25-30 мкм) срезов и движением ножевых салазок начали подавать блок вверх до получения с него первых полных срезов. Затем производили моделирование блока: срезали скальпелем избыточный парафин, оставляя вокруг залитого объекта слой не более 2-З мм, и придавали блоку прямоугольную форму. После этого установили микрометрическую шкалу на нужную толщину среза и приступили к окончательной резке материала.При резке срезы часто закручивались. Чтобы избежать этого срезы придерживали и приподнимали кисточкой за передний край в процессе резки. Следили за тем, чтобы срез не был прижат к ножу, так как при этом происходит его приклеивание и повреждение. Готовый срез осторожно снимали с ножа влажной кисточкой, (в направлений от спинки к лезвию), и переносили либо на подготовленное предметное стекло, и в чашку с теплой (З5-40° С) дистиллированной водой. Применение последней манипуляции давало более качественные срезы по ряду свойств: более плотное прикрепление к предметному стеклу, более чистое (свободное от парафина). Последнее свойство способствовало улучшению окраски среза. Воду предварительно кипятили, чтобы предупредить появление на нижней поверхности срезов пузырьков воздуха (который может быть растворен в воде), мешающих равномерному приклеиванию срезов к стеклу. При приготовлении срезов внимательно следили, чтобы волоски от кисточки не попадали под режущий край ножа, так как это приводит к повреждению лезвия. Для наклеивания парафиновых срезов нами использовался метод, основанный на приготовлении раствора белка с глицерином. Использование желатина оказалось неприемлемым из-за снижения качества обзора в микроскопе гистологических срезов, в связи с неплотной фиксацией срезов на предметном стекле. К белку из свежего куриного яйца добавили равное (1:1) по объему количество химически чистого глицерина и хорошо взболтали. Приготовленный раствор профильтровали через влажный складчатый бумажный фильтр, вставленный в стеклянную воронку, которую поместили в чистый химический стакан. Во избежание гниения белка к фильтрату добавили 3 маленьких кусочка (размером с пшеничное зерно) формалина (1:100). И тщательно закупорили хорошо притертой резиновой пробкой, при тщательном соблюдении этого условия в закрытом сосуде раствор сохраняется длительное время. Подготовку предметных стекол к наклеиванию произвели до начала резки парафинового блока на микротоме, поместив на тщательно очищенную поверхность стеклянной палочкой небольшую каплю раствор белка с глицерином (1:1) и растерев ее до получения равномерного слоя. Растирание производили пальцем (предварительно протерев его ваткой, смоченной эфиром). Приготовив предметные стекла, приступили к резке парафинового блока. Нами использовался метод расплавления и наклеивания срезов: срезы были перенесены для расправления в теплую воду, а смазанное белком с глицерином предметное стекло подвели в наклонном положении под плавающие срезы, натянули их на стекло с помощью препаровальной иглы и придали им правильное положение. Срезы располагали на предметном стекле в два ряда. В среднем на предметном стекле помещалось по 12-14 срезов. Затем удалили излишнюю воду (наклонив стекло и осторожно придерживая срезы за парафиновую каемку), клали стекла на планшеты и поместили в термостат или сушильный шкаф (при 42-45° С) на 24 ч, где и произошло окончательное высушивание и приклеивание срезов. Окрашивание депарафинированных срезов велось при помощи гематоксилина-эозина по общепринятой методике. Используемые для окраски растворы сливались во флаконы, с тем, чтобы снова произвести окраску следующей серии срезов. В используемые растворы опускались срезы при помощи анатомического пинцета, на определенное время, предусмотренное общепринятой методикой. Микроморфометрические исследования проводили в программе «Motic Images Plus 2,0». Подсчет остеонов в пястной кости крупного рогатого скота и лосей в разных возрастных периодах (6; 12 и 18 месяцев) велся по следующей формуле (в нашей модификации, так как формул определяющих именно количество остеонов в пястной кости при анализе методик не было):  , где – количество остеонов в пястной кости; – количество остеонов на 1 см²; – толщина диафиза пястной кости; – обхват пясти.^ В ходе исследования анатомических особенностей пястной кости у лосей было выявлено, что длина этой кости у лося в возрасте 6-ти, 12-ти и 18-ти месяцев составила в среднем, соответственно: 22,3 см, 27,5 см и 33,5 см. Длина этой же кости у крупного рогатого скота в возрасте 6-ти, 12-ти и 18-ти месяцев составляет соответственно в среднем: 17,2 см, 20,5 см и 24,3 см. Это свидетельствует об увеличенном у лосей расстоянии между проксимальным и дистальным эпифизами, за счет увеличения относительной длины диафиза. Пястная 3-я и 4-я кость (os metacarpi) образуют цилиндр, слегка сплюснутый со спинковой стороны и имеющий достаточно хорошо развитый желоб (сухожильный желоб, увеличивающий свою ширину и глубину в проксимальном направлении) с волярной стороны, который, более всего выражен, как уже упоминалось, в проксимальном участке, а по направлению к дистальному, постепенно сужается и сливается с горизонтальной поверхностью кости. 3-я и 4-я пястная кость сросшись внешне проявляется короткими расщелинами на проксимальном и дистальном концах кости. Межкостная щель (spatium interosseum), выражена более всего в дистальной части кости на дистальной стороне, а менее отчетливо и отрывисто на проксимальном участке. На всем протяжении диафиза последняя, формирует стержневидный желобок. Головка кости расположенная на дистальном конце имеет хорошо выраженные гребешки на дорсальной и пальмарной стороне. 2 и 5 кости остаются недоразвитыми, и часто называются грифельными костями. На медиальной поверхности пястной кости имеется пястная шероховатость. Находятся они обособленно друг от друга, 2-я на медиальной стороне пястной кости, а 5-я на латеральной, и доходят до срединной части диафиза, достигая почти дистального эпифиза. Проксимальный конец каждой кости называется головкой и имеет суставную поверхность. Кроме того, около проксимального конца обе снабжены небольшими суставными фасетками для соединения с одной стороны с 3-й, с другой с 4-й пястными костями, и на всем протяжении тела до пуговчатой головки связываются с ней соединительной тканью. Нарастание пястной кости в длину идет в возрастном ранжировании равными долями, которое имеют небольшое колебание. Незначительное отклонение показателей, отмечаемое через равные возрастные промежутки (6 месяцев) связано с интенсивностью роста и началом влияния внешних условий среды, как одного из главных стимуляторов микроструктурных преобразований в костной ткани. Такие изменения наблюдаются в равной степени у обоих видов животных. Однако у лосей нарастание пястной кости в длину больше таковой у крупного рогатого скота в 1,6 раза. Это связано с особенностями процессов окостенения и питания костной ткани, именно в диафизе формируются значительное число точек окостенения, именно с него и начинается процесс замещения хрящевой ткани костной. В отношении концевых отделов пястной кости видно, что расширение их идет в 2 раза медленнее, чем в диафизе. К этому имеет непосредственное отношение более тонкий слой компактной ткани и более интенсивное замещение концевых отделов кости (проксимального и дистального эпифизов) губчатой костью. В третьем возрастном периоде (18 месяцев) у обоих видов животных отмечаются заметные различия в нарастании кости в ширину. У лосей этот показатель изменяется менее значительно, у крупного рогатого скота, напротив показатели обмеров в 2 раза ниже, чем в предыдущий возрастной период (12 месяцев). Из этого следует, что изменение условий внешней среды становится заметным фактором, оказывающим влияние на течение остеопластических процессов в костной ткани. Авторы: Бунак В.В., Клебанова Е.А. (1957); Заика С.В. (1985), единогласно свидетельствуют о том, что влияние условий внешней среды, в которой пребывают животные, заметно сказываются на показателях макроморфометрии. Отчего проведенное нами исследование подтверждает это заключение по нашим данным в сравнительном аспекте. Темпы роста пястной кости в ширину, у лосей в возрасте 12-ти месяцев меньше, чем у крупного рогатого скота в эпифизе проксимальном в 1,5 раза, в эпифизе дистальном в 2 раза. К 18-ти месяцам темпы роста пястной кости в ширину у лосей выше во всех участках пястной кости от 1,5 раз в диафизе, до 1,4 раза в эпифизах (проксимальном и дистальном). Такая особенность роста пястной кости в ширину у лосей в 12 месячном возрасте связана с активностью метаэпифизарной пластинки, за счет которой кость растет в длину. К 18 месячному возрасту темпы роста пястной кости как в длину, так и в ширину уравновешиваются, то есть нарастание костной ткани и в длину и в ширину идет прямо пропорционально. Проведенный нами анализ изменения площади поверхности среза у крупного рогатого скота и лосей в разных возрастных периодах, становится очевидным, что цифровые значения существенно разнятся в сравнительном аспекте. Превышение продольного и поперечного диаметра у крупного рогатого скота, свидетельствует о характере ее функционального роста. Пястная кость крупного рогатого скота, так же как и лосей растет несколько асинхронно. Особенность заключается в преобладании одного из двух наиболее важных макроморфометрических показателей – длины и ширины. У крупного рогатого скота пястная кость растет более в ширину, об этом свидетельствуют более массивные концы (эпифизы) этой кости, отмечала Криптофорова Б.В. (1981), а также Мельник К.П., Луценко В.Г., Клыков В.И. (1975). У лосей кость более всего растет в длину, о чем ярко свидетельствует тело пястной кости (диафиз) имеющее форму вытянутого цилиндра. Проведенный нами анализ, относительно механической плотности пястной кости крупного рогатого скота и лосей, путем сопротивления сжатию на прессовальной машине становится очевидным превышение таковой у лосей в 1,5-2 раза. Наличие высокой механической плотности у лосей, наблюдается во всех трех возрастных периодах. На основе результатов исследования можно сделать утверждение, что формирование пястной кости у лосей в отличие от таковой у крупного рогатого скота имеет несколько отличный уровень микроструктурных процессов. Сопоставляя данные по сопротивлению сжатию видно, что оно достаточно сильно варьирует у эпифизов, что связано с перераспределением нагрузки на конечность. В области диафизов такой сильной вариации не наблюдается, так как она более умеренна, что связано с ее ролью своеобразного передаточного звена при длительной статической нагрузке и очень короткой динамической при привязном содержании. У лосей вариабельность по сопротивлению сил сжатия значительно ниже таковой у крупного рогатого скота. Так как, учитывая подвижность лося и некоторые анатомические особенности его, видно, что вектор между биостатикой и биодинамикой смещен в сторону последней. Механическая плотность у крупного рогатого скота, меньше таковой у лосей в возрастном аспекте в следующих значениях: в диафизе, в возрасте 6-12 месяцев – 7 %, в 12-18 месяцев – 5 %, в проксимальном и дистальном эпифизах в возрасте 6-12 месяцев от 7 % до 10 %, в возрасте 12-18 месяцев от 2 % до 11 %. Авторы: Воложин А.И., Павлов М.П., (1976); Коваленко Е.А., (1980); Луценко В.Г., (1979); Березовский В.А. (1990) утверждают, что условия внешней среды оказывают существенное влияние на процессы моделирования и ремоделирования костной ткани. Помочь раскрыть этот механизм помогло в некоторой степени наше исследование по определению упругости пястной кости путем сжатия на ПМ-3. Общий объем костной ткани пястной кости, у крупного рогатого скота составил (6-ти, 12-ти и 18-ти месяцев) в среднем - 0,000053 см³г, а у лосей (6-ти, 12-ти и 18-ти месяцев) общий объем костной ткани пястной кости соответственно - 0,000088 см³г. Полученные результаты были необходимы для вычисления плотности костной ткани. Плотность у крупного рогатого скота во всех трех возрастных периодов превышает таковую у лосей в 1,5 раза. Объем пор в пястной кости (в различных ее участках), составил в среднем у крупного рогатого скота в 2,4 раза больше таковых у лосей. Степени порозности костной ткани, у крупного рогатого скота в 1,2 раза меньше, чем у лосей. Литературные данные об этом типе исследования у млекопитающих весьма отрывочны. Наше исследование помогло несколько систематизировать изучение особенностей плотности и порозности пястной кости в сравнительном аспекте, а также способствовало получению некоторых ориентиров в цифровом выражении, для дальнейшего изучения не только пястной, но и других трубчатых костей. Процентное содержание органического вещества составляющего в среднем около 50 % наблюдается, в 6-ти месячном возрасте во всех участках пястной кости, как у крупного рогатого скота, так и у лосей. Далее происходит довольно резкое снижение содержания органического вещества в кости. Наиболее сильно это выражено в диафизе. В отношении эпифизов (проксимального и дистального) также наблюдается изменения в постепенном преобладании в накоплении неорганического вещества. Наиболее активен в этом проксимальный эпифиз (крупный рогатый скот), что вполне может быть связано с низкой функциональной активностью, которая характерна для привязной системы содержания. У лосей такого различия в накоплении неорганических веществ в эпифизах не наблюдается, этот процесс в концевых участках пястной кости осуществляется практически равномерно. Колебание составляет от 0,20 % до 1,50 %. Содержание органических и неорганических веществ в пястной кости в разных ее участках (диафизе, проксимальном и дистальном эпифизах). В диафизе от 5,10 % до 8,25 %, у лосей от крупного рогатого скота, в проксимальном эпифизе до 3,26 %, у лосей от крупного рогатого скота, в дистальном эпифизе от 3,15 % до 6,17 %, у лосей от крупного рогатого скота. Систематизированных данных из литературных источников по содержанию органических и неорганических веществ именно в пястной кости не имеется, поэтому проведенное нами исследование позволило получить процентное содержание этих веществ. Особенности микроморфометрии кристаллов гидроксиапатита кальция, таковы: у лосей форма кристаллов вытянутая в виде узкой полоски один конец, которой имеет стрелообразное заострение, а другой, напротив небольшое контурированное углубление (вдавление). Такая особенность связана с тем, что кристаллы кальция в процессе фиксации, на органической матрице прилегают друг к другу, по типу примыкания «конец в конец». У крупного рогатого скота кристаллы гидроксиапатита кальция имеют округло-овальную форму, плоские полупрозрачные поверхности и уплотненный по периферии ободок. В процессе фиксации на органической матрице прилегают друг к другу по типу примыкания «бок о бок». Влияние условий среды обитания на процессы моделирования и ремоделирования костной ткани очень существенное. Подвижность крупного рогатого скота ограничена системой содержания. Это означает то, что процессы моделирования, происходящие в костной ткани будут иметь толчкообразный характер. Воздействие сил сжатия и растяжения будет происходить не одновременно, а с качественным и количественным преобладанием одной из них, утверждали Аврунин А.С., Иоффе И.Д., Емельянов В.Г., Корнилов Н.В. (2001). Такой характер микроархитектурных процессов позволит развить в костной ткани пястной кости какое-либо одно свойство из целого ряда свойств. Как правило, сильнее всего развивается плотность кости, за счет уплотнения органического остова. Кроме того, длительная гипокинезия (привязное содержание) способствует утолщению компактного слоя костной ткани, имеющего наибольшую толщину в диафизе (теле) пястной кости. Сама кость становится сравнительно короткой, оба ее конца (эпифизы) утолщаются, становятся массивными. Армирование костной ткани кристаллами гидроксиапатита идет довольно медленно, так как интенсивность процессов обновления костной ткани значительно снижена. У лосей находящихся в иных условиях обитания процессы моделирования костной ткани довольно значительны. Лоси - очень подвижные животные. В пястной кости процессы обновления микроструктурных элементов идут непрерывно. Воздействие сил сжатия и растяжения происходит прямопропорционально, а значит, формирование балочной структуры в эпифизах пястной кости идет по направлению действия этих сил. В диафизе происходит увеличение числа как ламелл в остеонах (гаверсовых системах), так и самих остеонов. Благодаря интенсивности процессов обновления костной ткани в пястной кости армирование органической матрицы (остова) кристаллами гидроксиапатита кальция идет весьма активно. В связи с этим упругость костной ткани значительно повышается, одновременно прямо пропорционально увеличиваются прочностные характеристики пястной кости. Крепость кости возрастает. Бунак В.В, Клебанова Е.А. (1957) отмечали, что условия внешней среды оказывают особое влияние на формирование внутриструктурных процессов и вместе с тем, способствуют увеличению крепости костяка. Изучение двух видов животных (крупный рогатый скот и лоси) в трех разных возрастных периодах в сравнительном аспекте, позволило выявить некоторые особенности. Во-первых, микроструктурная организация в пястной кости у крупного рогатого скота имеет существенные отличия от таковой у лосей. Отличительные особенности относятся к количеству остеонов (гаверсовых систем) на см², их диаметру, расстоянию, друг от друга, количеству и толщине костных ламелл, содержанию неорганических веществ в частности кристаллов гидроксиапатита кальция, характеру и микроморфметрии органического остова пястной кости. На протяжении трех возрастных периодов (6; 12 и 18 месяцев) у крупного рогатого скота наблюдается существенное отставание в интратканевой перестройке, а именно снижено количество остеонов на см², количество ламелл в гаверсовой системе также заметно отличается от числа последних в остеонах у лосей. Расстояние между ламеллами также увеличено. Остеоны имеют более растянутую форму (у лосей гаверсовы системы почти правильной округлой формы). Толщина костных ламелл в возрастном аспекте у лосей остается практически неизменной, тогда как у крупного рогатого скота, последняя довольно нестабильна. Утолщение костных ламелл, также как и увеличение расстояния между ними идет более значительно к периферии (от центра) остеона. Более точно это будет выражаться при таком анализе: диаметр остеона (гаверсовой системы) в возрастном аспекте у крупного рогатого скота больше такового у лосей от 1,2 до 2 раз. Расстояние между остеонами у крупного рогатого скота составляет от 1,3 до 1,8 раза больше такового у лосей. Количество же костных ламелл у лосей превышает в 1,4 раза количество таковых же у крупного рогатого скота. Толщина ламелл у лосей превышает таковую у крупного рогатого скота в 1,5 раза. Количество остеонов на 1 см² составляет в среднем: у крупного рогатого скота и лосей в возрасте 6 месяцев – 9 и 16, в 12 месяцев – 17 и 28, в 18 месяцев – 23 и 41. Разница в количестве гаверсовых систем (остеонов) составляет 1,5-2 раза, в сторону преобладания последних у лосей. ВЫВОДЫ 1. Пястная кость крупного рогатого скота в отличие от лосей имеет короткое тело (диафиз) и утолщенные, массивные концы (эпифизы). Такая особенность формируется вследствие потенцированного воздействия длительной статической нагрузки на кость. Это способствует усилению ее крепости. Удлинение тела пястной кости (лось) за счет непрерывной динамической нагрузки способствует повышению лабильности ее свойств: упругости, крепости и прочности. 2. Степень нарастания пястной кости в длину у лосей в 1,5 раза выше, чем у крупного рогатого скота. Степень нарастания пястной кости в ширину у крупного рогатого скота в 2 раза больше таковой у лосей. 3. Упругость пястной кости у крупного рогатого скота и лосей имеет обратно пропорциональную связь: чем короче кость и массивней ее концы, тем упругость ниже; чем компактней и умеренней размеры кости (лось), тем свойство упругости выше. В возрастном аспекте такая связь устойчива по отношению к лосям. У крупного рогатого скота наблюдается другая особенность: к 12-ти месячному возрасту упругость пястной кости существенно повышается, к 18-ти месячному возрасту, она увеличивается менее интенсивно. 4. Содержание в пястной кости гидроксиапатита кальция у лосей в 1,2 раза больше, чем у крупного рогатого скота. Особенности микроморфометрии кристаллов кальция способствуют их специфической фиксации на органической матрице по типам «конец в конец» (лоси), и «бок о бок» (крупный рогатый скот). Последний тип способствует более слабой сопротивляемости к сжатию. 5. С возрастом количество остеонов (структурно-функциональных единиц) в пястных костях лосей и крупного рогатого скота увеличивается. Варьирование толщины костных ламелл «от центра к периферии», имеет постоянное значение. У крупного рогатого скота разность в толщине ламелл в «центре» остеона превышает таковую на «периферии» остеона в 2 раза, у лосей соответственно в 1,5 раза. Количество ламелл в остеоне с возрастом (с 6 до 18 месяцев) возрастает до 2,3 раза, у лосей соответственно до 2,4 раза. Количество остеонов (гаверсовых систем) с возрастом (с 6 до 18 месяцев) у крупного рогатого скота увеличивается в 4,7 раза, у лосей соответственно в 5,3 раза. 6. У лосей совокупность анатомо-физиологических особенностей и особенностей среды обитания на основе динамической нагрузки определяет усиление физических свойств пястной кости: упругости и прочности, которые у крупного рогатого скота, при аналогичной совокупности особенностей, но уже при длительном воздействии статической нагрузки, с преимущественным акцентом сил сжатия, напротив, приводит к значительному снижению механо - физического потенциала этих свойств в пястной кости. ^ Результаты исследования макро - и микроскопических особенностей пястной трубчатой кости у крупного рогатого скота и лосей рекомендуется использовать: - полученные результаты и теоретические положения проведенных исследований могут быть использованы при написании методических рекомендаций, а также для дальнейшего изучения проблемы гипокинезии и нормокинезии в возрастной физиологии и экологии - в качестве нормативных критериев при изучении патологических изменений на микроструктурном уровне; - в учебных процессе на ветеринарных и зооинженерных факультетах высших учебных заведений; - при написании специальных разделов учебников и справочных руководств по возрастной и сравнительной морфологии, анатомии и гистологии. ^ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ Полученные результаты и теоретические положения настоящего исследования могут быть использованы в лаборатории НИИ разрабатывающие рекомендации по промышленному содержанию крупного рогатого скота в сравнительном аспекте с прилагаемыми научными выкладками по лосеводству, заключающихся прогнозами направления изменения биомеханических свойств костной ткани животных, по ее морфологическим и физико-химическим показателям; при изучении морфологии и общей физиологии скелета. При подготовке перспективных экспериментов, направленных на изучение полного цикла развития млекопитающих в условиях привязного содержания и свободно выгульной системы, а также при изучении фундаментальных проблем стресса в возрастном физиологии и экологии. А также при написании соответствующих разделов учебников и справочных руководств по возрастной, сравнительной морфологии, химии и биомеханики крупного рогатого скота и лосей. ^
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям