Инструкция пользователя
Лейшмания IgG
DRG
 EIA-3492
 96 Wells
в
Русский
English
ведение
Набор для определения IgG антител к висцеральной лейшмании в сыворотке методом ELISA.
^
Висцеральный лейшманиоз (ВЛ) тяжелое заболевание с высоким уровнем смертельных исходов, вызываемое паразитами вида L. donovani (1,2). Переносчиками заболевания служат москиты. Основными их хозяевами являются собаки (3-6). Это заболевание распространено и является серьезной проблемой во многих развивающихся странах (7). Высокий коэффициент заболеваемости встречается в отдельных частях Латинской Америки, Восточной Африки, на Ближнем Востоке, в Индии и Китае. Также встречается в странах граничащих со Средиземноморьем, в таких как Италия, юг Франции, Испания, Португалия и Северная Африка. В Южной Европе, где распространен ВИЧ-1 , висцеральный лейшманиоз все чаще встречается как оппортунистическая инфекция.
Для диагностики острого ВЛ часто прибегают к аспирации костного мозга на прямое выявление паразитов. Данная процедура является инвазивной, болезненной и опасной и отмечается высокий уровень осложнений, в связи с невозможностью отделять паразитов от ткани. Альтернативно, широко используется серологическая диагностика, поскольку титр антител к лейшмании обычно высокий при острой фазе заболевания. ELIZA – это предпочтительный метод лабораторного исследования для серодиагностики ВЛ, хотя непрямой метод флуоресцирующих антител (НМФА) и прямой агглютинационный анализ (ПАА), для диагностики всех паразитов, все еще широко распространены в сочетании с ELIZA или самостоятельно.
^
Во время первой инкубации антитела в сыворотке пациента связываются с антигенами на поверхности лунки. При следующей инкубации связывается комплекс антиген-антитело с ферментным комплексом. Несвязанные ферменты удаляются после промывки лунок, и затем добавляется хромоген, который способствует окрашиванию в голубой цвет при наличии ферментного комплекса и пероксидазы. Стоп-раствор останавливает реакцию и меняется окрашивание с голубого на желтое.
Реагенты
Микротитровальные стрипы с антигенами лейшмании, на 96 тестов, вкл. 1 держатель для стрипов.
Ферментный конъюгат: 1 (один) флакон, содержащий 11 мл анти-Ig человека перокседазу (HRP) в стабилизируещем буфере с тимеросалом.
Положительный контроль: 1 (один) флакон, содержащий 1 мл разведенной положительной сыворотки человека в буфере с тимеросалом.
Отрицательный контроль :1 (один) флакон, содержащий 1 мл разведенной отрицательной сыворотки человека в буфере с тимеросалом.
Хромоген: 1 (один) флакон, содержащий 11 мл хромогенного тетраметилбензидина (ТМБ).
Концентрат промывочного раствора (20х): 1 (один) флакон, содержащий 25 мл концентрированного буфера и сурфактанта с тимеросалом.
Буфер для разведения: 2 (два) флакона, содержащих 30 мл буферный белковый раствор с тимеросалом.
Стоп-раствор:1 (один) флакон, содержащий 11 мл фосфорной кислоты 1М.
^
Контроли и буфер для разведения это буферные растворы с казеиновым основанием, как правило, мутные. Также на дне флакона может образоваться студнеобразная пробка. Это нормальное явление и не влияет на результаты анализа.
Промывочный концентрат кристаллизуется при температруре 4°С. Кристаллы исчезают после разведения до рабочего раствора.
Не использовать сыворотку, если она могла дать рост микроорганизмов. Не использовать мутную из-за высокого содержания липидов сыворотку. Перед постановкой анализа такую сыворотку осветлить.
Не добавлять азиды в образцы или другие реагенты.
Контроли и некоторые реагенты содержат тимеросал в качестве консерванта.
В целях безопасности следует обращаться с образцами как с потенциально инфицированными.
Все контроли были проверены на антитела к HBsAg, ВИЧ. Результат отрицательный, но в целях безопасности необходимо обращаться с калибраторами и образцами пациентов как с потенциально инфицированными.
^
Реагенты, стрипы и компоненты во флаконах:
Хранить при 2-8°С.
Гибкий флакон, содержащий разведенный промывочный раствор, хранить при комнатной температуре.
ПРОЦЕДУРА
1.Отделить необходимое количество лунок (две для контроля плюс для необходимого количества образцов) и поместите в держатель для лунок.
2.Добавить 100 мкл отрицательного контроля в лунку №1, 100 мкл положительного контроля – в лунку №2 и 100 мкл разведенных (1:40) образцов в оставшиеся лунки.
3. Примечание: отрицательные и положительные контроли поставляются предварительно разведенными. Не разводить.
4. Инкубировать при комнатной температуре (15-25° С) в течение 10 мин.
5. Вытряхнуть содержимое и промыть 3 раза разведенным моющим буфером*.
6. Добавить 2 капли ферментного конъюгата в каждую лунку.
7. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
8. Вытряхнуть содержимое и промыть 3 раза моющим буфером.
9. Добавить 2 капли Хромогена в каждую лунку.
10. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
11. Добавить 2 капли стоп-раствора, постукивая сбоку по штативу с лунками.
12. Настроить ELIZA на ноль, считать результаты при 450 нм с
*Промывка состоит из следующих этапов: разведенным моющим буфером наполняют каждую лунку до краев, вытряхивают содержимое и заново наполняют лунки, в общей сложности 3 раза.
13. Избегайте образования пузырей в лунках во время промывки.
14. Учитывать контроли каждый раз, когда истекает срок годности набора.
^
Серологические результаты используются как вспомогательное средство при диагнозе и не следует основываться только на данных результатах при постановке диагноза. Несмотря на отсутствие зарегистрированных специфических перекрестных реакций, необходимо учитывать реакции схожих организмов.
^
Спектрофотометр: Настроить прибор на ноль. Считайте результаты всех лунок бихроматически (фильтры 450 нм и 620-650 нм).
Положительный – Коэффициент абсорбции больше или равен 0,2 единиц ОП (оптической плотности).
Отрицательный - Коэффициент меньше 0,2 единиц ОП
Визуальный: Образец считается положительным, если степень реакции очевидна и значительна.
^
Использование положительного и отрицательного контролей позволяет легко определить стабильность набора. Для получения надежного результата положительный контроль должен быть около 0,3 ед. ОП, отрицательный контроль должен быть ниже 0,2 ед. ОП. Если показатели ниже указанных, набор не следует использовать.
^
Проблема: Отрицательный контроль имеет значительное окрашивание.
Исправление: Неверно проведенная стадия промывки. Повторить процедуру анализа с обильной промывкой.
ЛИТЕРАТУРА
1. WHO. 1990. Control of the Leishmaniases. Report of a WHO Expert Committee. Geneva : Health
Organization, Technical Report Series, no. 793.
2. Marsden, P.D. 1984. Selective primary health care: strategies for control of disease in the developing world.
XIV. Leishmaniasis, Rev. Inf. Dis. 6:736-744.
3. Ashford, D.A., R. Baduro, C. Eulalio, M. Freire, C. Miranda, M.G. Zalia, and J.R. David. 1993. Studies on
the control of visceral leishmaniasis: validation of the falcon assay screening test-enzyme-linked
immunosorbent assay (FAST-ELISA a) for field diagnosis of canine visceral leishmaniasis. Am. J. Med. Hyg.
48(1):1-8.
4. Neogy, A.B., Vouldoukis, A.S. Otamires, Y. Tselentis, J.C. Lascombe, T. Segalen, D. Rzepka, and L.Monjour.
1993. Serodiagnosis and screening of canine visceral leishmaniasis in an endemic area of Corsica:
Applicability of a direct agglutination test and immunoblot analysis. Am. J. Trop. Med. Hyg. 47:772-777.
5. Evans, T.G., I.A.B. Vasconcelos, J.N. Lima, J.M. Teixeira, I.T. McAullife, U.G. Lopes, R.D. Pearson, A.W.
Vasconcelos. 1990. Canine visceral leishmaniasis in northeast Brazil: assessment of serodiagnostic methods.
Am. J. Trop. Med. Hyg. 42:118-123.
6. Alvar, J., R. Molina, M. San Andres, M. Tesouro, J. Nieto, M. Vitutia, F. Gonzales, M.D. San Andres, J.
Boggio, F. Rodriguez, A. Sainz, and C. Escancena. 1994. Canine leishmaniasis: clinical, parasitological, and
entomological follow-up after chemotherapy. Ann. Trop. Med. & Parasit. 88(4):371-378.
7. Jeronimo S.M.B., R.M. Oliveira, S. Mackay, et al. 1994. An urban outbreak of visceral leishmaniasis in Natal,
Brazil. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 88(4):386-368.
8. WHO. Report of the consultative Meeting on HIV/Leishmania Co-infections. Rome, 1994.
9. Berenguer, J., S. Moreno, E. Cercenado, J.C.L. Bernaldo de Quiros, A. Garcia de La Fuenta, E. Bouza. 1989.
Visceral leishmaniasis in patients infected with human immunodeficiency virus (HIV). Ann. Intern. Med.
111:129-132.
10. Montalban C., R. Martinez-Fernandez , J.L. Calleja, J. Garcia-Diaz, R. Rubio, F. Dronda, S. Moreno, M.
Yebra, C. Barros, J. Cobo, M.C. Martinez, F. Ruiz, and R. Costa. 1989. Visceral Leishmaniasis (kala-azar) as
an opportunistic infection in patients infected with the human immunodeficiency syndrome (AIDS). Rev.
Infect. Dis. 2:655-660.
11. Condom, M.J., B. Clotet, G. Sirera, F. Milla and M. Foz. 1989. Asymptomatic Leishmaniasis in acquired
immunodeficiency syndrome (AIDS.) Ann. Intern. Med. 111(9):767-768.
12. Matheron, S., A. Cabie, F. Parquin, C. Mayaul, P. Roux, M. Antione, C. Chougnet, and J.P. Coulaud. 1992.
Visceral Leishmaniasis and HIV infection: unusual presentation with pleuropulmonary involvement and
secondary prophylaxis. AIDS. 6(2):238-240.
13. Gradoni, L., G. Guaraldi, M. Codeluppi, A. Scalone, and F. Rivasi. 1995. Gastric localization of Leishmania
in a patient with acquired immunodeficiency syndrome: A case report. APMIS (Den). 103(1):25-28.
14. Jimenez, M.I., B. Gutierez-Sola, A. Benito, A. Aguiar, E. Garcia, E. Cercenado, and J. Alvar. 1991.
Cutaneous Leishmania (L) infantum Zymodemes isolated from Bone Marrow in AIDS patients. Res. and Revs.
In. Parasitol. 51(1-4):95-99.
15. Gramiccia, M., L. Gradoni, and M. Troiani. 1995. Heterogeneity among zymodemes of Leishmania infantum
from HIV-positive patients with visceral leishmaniasis in South Italy. FEMS Micro Letts. 128:33-38.
16. Allain, D.S. and I.G. Kagan. 1975. A direct agglutination test for leishmaniasis. Am. J. Trop. Med. Hyg.
24:232-236.
17. Badaro, R., S.G. Reed, and E.M. Carvalho. 1983. Immunofluorescent antibody test in American visceral
leishmaniasis: sensitivity and specificity of different morphological forms of two Leishmania species. Am. J.
Trop. Med. Hyg. 32(3):480-484.
18. Reed, S.G., W.G. Shreffler, J.M. Burns, Jr., J.M. Scott, M. de G. Orge, H.W. Ghalib, M. Siddig, and R. Badaro.
1990. An improved serodiagnostic procedure for visceral leishmaniasis. Am. J. Trop. Med. Hyg. 43(6):632-
19. Burns, Jr. J.M., W.G. Shreffler, D.R. Benson, H.W. Ghalib, R. Baguro, and S.G. Reed. 1993. Molecular
characterization of a kinesin-related antigen of Leishmania chagasi that detects specific antibody in African and
American visceral leishmaniasis. Proc. Natl. Acad. Sci. 90:775-779.
20. Singh, S. et. al. Diagnostic and Prognostic Value of K39 Recombinant Antigen in Indian Leishmaniasis, J.
Parasitology, December 1995. 81(6):1000-1003.
21. 21. Badaro, R. et al. rk39: A Cloned Antigen of Leishmania chagasi that Predicts Active Visceral
Leishmaniasis. Journal of Infectious Diseases, 1996; 173 (March.): 758-762.
22. Qu, J.Q. et al. 1994. Serodiagnosis of Asian Leishmaniasis with a recombinant antigen from a repetitive
domain of a Leishmania kinesin. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. and Hyg. 88: 543-545.
|
