Drg антитела класса IgA к бета 2-Гликопротеину (eia-3884)
|
|
Скачать 173.53 Kb.
|
|
DRG DRG Антитела класса IgA к бета 2-Гликопротеину (EIA-3884) СЕ IVD RUO в США Редакция 15 июня 2007 г. Количественный иммуноферментный анализ для количественного определения антител класса IgA к бета 2-Гликопротеину ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ Все реагенты данного комплекта для тестирования предназначены для использования только в лабораторных условиях. В США данный комплект предназначен Только для Исследовательского Использования. Строго соблюдайте последовательность дозирования пипеткой, предусмотренную данным протоколом. Соблюдайте рекомендации по выполнению контроля качества в медицинских лабораториях путем анализа контролей и/или банков сыворотки. Все реагенты должны храниться охлажденными при 2-8оС в оригинальном контейнере. Не заменяйте компоненты комплекта компонентами из других комплектов. Необходимо соблюдать сроки годности, указанные на ярлыках отгрузочного контейнера и на всех пузырьках. Не используйте компоненты комплекта с истекшим сроком годности. Перед использованием все компоненты комплекта и образцы должны достичь комнатной температуры; тщательно перемешивайте их. Во время работы со всеми реагентами комплекта, контролями и пробами сыворотки соблюдайте действующие нормативы. При работе с потенциально инфекционными материалами следует соблюдать следующие меры предосторожности:
Комплект для тестирования содержит компоненты человеческого происхождения, которые при тестировании разрешенными FDA методами были обнаружены отрицательными к поверхностному антигену гепатита В и к антителу к ВИЧ. Ни один из известных тестов не может гарантировать, однако, что продукты, полученные из крови человека, не являются инфекционными. Поэтому со всеми реагентами и производными крови человека, такими как пробы плазмы и сыворотки, работайте так, как будто они способны передавать инфекцию. Избегайте контакта с ТМБ (3,3’, 5,5’-Тетраметилбензидином). При попадании ТМБ на кожу тщательно промойте водой с мылом. Стоп-реагент содержит соляную кислоту. При попадании его на кожу тщательно промойте водой с мылом и обратитесь к врачу. Избегайте контакта между буферным Раствором Перекиси и легко окисляемыми материалами; предельные температуры могут вызывать самовозгорание. ^
КОНТРОЛИ Набор из двух контролей предоставляется с комплектом. ^
^ Тест на антитела класса IgA к бета 2- гликопротеину I является непрямым твердофазным ферментным иммунометрическим исследованием (ELISA). Она предназначен для количественного измерения аутоантител класса IgА, направленных против к бета 2- гликопротеину I. Исследование основывается на полистироловых микропланшетах, g-облученных, с высоким связыванием и сенсибилизированных высоко очищенным бета 2-Гликопротеином человека. Микропланшеты могут разделяться на 12 стрипов по 8 лунок в каждом или могут использоваться полностью для 96 определений. Каждая лунка может быть отделена от стрипа. В течение трех различных фаз реакции происходит связывание имеющихся аутоантител, образование сандвичевых комплексов и ферментная цветовая реакция: Фаза 1: Калибраторы, контроли и предварительно разбавленные пробы исследуемых вносятся пипеткой в лунки микропланшета. После 30-минутной инкубации микропланшет промывается промывочным буфером. Фаза 2: Раствор ферментного конъюгата пероксидазы хрена с антителами класса IgА человека пипеткой вносится в лунки микропланшета. После 15-минутной инкубации промывочным буфером. Фаза 3: Раствор хромогенного субстрата, содержащий ТМБ (3,3’, 5,5’-Тетраметилбензидин), распределяется по лункам. В течение 15 минут инкубации цвет раствора меняется на синий. Добавление 1 М соляной кислоты в качестве стоп-реагента останавливает появление цвета. Цвет раствора меняется на желтый. Количество цвета прямо пропорционально концентрации IgА, присутствующих в первоначальной пробе. Для считывания оптической плотности требуется планшет-ридер с фильтром 450 нм. Рекомендуется бихроматическое измерение с эталоном 600-690 нм. Оптическая плотность для каждого калибратора может быть представлена в виде графика по концентрации IgA и неизвестных, экстраполированных от кривой 5. ^ Антитела к бета 2 гликопротеину I связаны с заболеваниями антифосфолипидного синдрома, такими как тромбообразование, тромбоцитопения или смерть плода в связи системной красной волчанкой. Бета 2-гликопротеин I (аполипопротеин Н) представляет собой бета 2-глобулин 50 кДа, присутствующий в плазме на уровне 200 мкг/мл. Было обнаружено, что бета 2-гликопротеин I (β2GPI) препятствует внутреннему каскаду коагуляции и, таким образом, участвует в регулировании свертывания крови. В живом организме β2GPI связан с отрицательно заряженными веществами, например, анионными фосфолипидами, гепарином и липопротеином. Область фосфолипидного связывания расположена в его пятом домене. В последнее время бета 2-гликопротеин I стал известен как кофактор для аутоантител кардиолипина. Несколько исследований подтвердили его незаменимую роль в надлежащем связывании антител к кардиолипину с иммобилизованным кардиолипином. Подробные исследования природы комплекса кардиолипин - β2GPI показали, что эпитопы на пятом домене β2GPI являются истинной мишенью «антител к кардиолипину» даже в отсутствие отрицательно зряженных фосфолипидов. β2GPI не только является обязательным условием связывания антител к кардиолипину; он был также определен как первичный антиген для этих антител. Пробы клинических пациентов с антифосфолипидным синдромом были испытаны на наличие антител к кардиолипину и β2GPI. Хорошие соотношения между значения антител к кардиолипину и β2GPI подтверждают приведенное выше утверждение. Аутоантитела к бета 2-гликопротеину I описаны для различных аутоиммунных заболеваний. Присутствие антител к β2GPI может быть связано с развитием артериального и венозного тромбоза, венозной тромбоэмболии, тромбоцитопении и смертью плода. Антитела к бета 2 – гликопротеину I находятся в иммуноглобулинах классов IgG, IgM и IgA. Определение антител класса IgM является ценным показателем в диагностике начала аутоиммунных заболеваний, в то время как антитела класса IgG будут присутствовать на стадиях прогрессирования проявляющихся аутоиммунных нарушений. Титры антитела класса IgG к β2GPI хорошо соотносятся с клиническим состоянием пациентов при тромбозе, тромбоэмболии и повторной смерти плода, в то время как антитела класса IgM к β2GPI демонстрируют значительную связь с тромбозом и тромбоцитопенией. Показаниями для определения присутствия антител к бета 2 – гликопротеину I являются: - системная красная волчанка - артериальные и венозные тромбозы - тромбоцитопения - смерть плода. ^ В исследовании нормального интервала проб сыворотки от здоровых доноров крови тестом на антитела класса IgA к бета 2-Гликопротеину I установлены следующие интервалы: Антитела к бета 2-гликопротеину I IgА [U/мл] нормальный: < 5 промежуточный 5 – 8 повышенный: > 8 Положительные результаты должны проверяться относительно полного клинического состояния пациента. Также индивидуально должно приниматься каждое решение о терапии. Каждой лаборатории рекомендуется установить собственные нормальные и патологические интервалы антител к бета 2-Гликопротеину I сыворотки. СПЕЦИФИЧНОСТЬ Микропланшет сенсибилизируется высокоочищенным бета 2 – Гликопротеином человека. Комплект для тестирования распознает только аутоантитела, специфичные к бета 2 – Гликопротеину I. Эндогенный бета 2-гликопротеин I и эндогенные отрицательно-заряженные фосфолипиды определяются в образцах, разбавленных в пропорции 1:100 на уровне, соответственно, приблизительно 2мкг/мл и приблизительно 1 мкг/мл. Не было замечено влияния на антитела к бета 2-гликопротеину I. КАЛИБРОВАНИЕ Вследствие отсутствия международного эталонного препарата для аутоантител к бета 2-гликопротеину I система количественного тестирования калибрована в относительно произвольных единицах. Калибрование осуществляется по международно признанным эталонным сывороткам от E.N. Harris, Луисвилл. Тесты этих сывороток положительны для аутоантител к бета 2-гликопротеину I. ТРЕБУЕМЫЕ МАТЕРИАЛЫ Оборудование
Подготовка реагентов
Дополнительно
СБОР И ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ Для определения антител к бета 2 – гликопротеину I предпочтительными матрицами проб являются сыворотка или плазма. Все пробы сыворотки и плазмы предварительно разбавляются в пропорции 1:100 буфером для разбавления проб. Таким образом, 10 мкл пробы могут быть разбавлены 1000 мкл буфера. Пациентам не требуется сдавать пробу на голодный желудок, специальных приготовлений не требуется. Соберите кровь венепункцией в вакуумные контейнеры и отделите сыворотку или плазму от клеток центрифугированием после образования сгустков. Пробы могут храниться охлажденными при 2-8оС в течение не менее 5 дней. Для более длительного хранения вплоть до шести месяцев пробы должны храниться замороженными при -20оС. Во избежание множественных оттаиваний и заморозок пробы должны быть разделены на несколько равных частей. Ни Билирубин, ни Гемолиз не оказывают значительного воздействия на процедуру. ^ Все компоненты данного комплекта для тестирования поставляются в жидком виде и готовыми к использованию, за исключением буфера для разбавления проб и промывочного буфера. При хранении в охлажденном виде при 2-8оС компоненты устойчивы в течение не менее 30 дней после вскрытия или до даты истечения срока годности, напечатанной на ярлыках. Остальные модули микропланшета должны храниться охлажденными при 2-8оС и защищенными от влаги; храните вместе с осушителем и тщательно запечатанными в пластиковый пакет. ^ Разведите содержимое каждого флакона концентрата буфера для разбавления проб (5х) дистиллированной водой до конечного объема 100 мл перед использованием. Храните в охлажденном виде: устойчив при 2-8оС в течение не менее 30 дней после приготовления или до даты истечения срока годности, напечатанной на ярлыке. ^ Разведите содержимое каждого флакона концентрата буферного промывочного раствора (50х) дистиллированной водой до конечного объема 1000 мл перед использованием. Храните в охлажденном виде: устойчив при 2-8оС в течение не менее 30 дней после приготовления или до даты истечения срока годности, напечатанной на ярлыке. ^ Контрольные сыворотки должны регулярно исследоваться как неизвестные для проверки эффективности реагентов и исследования. Для всех контролей соответствующие концентрации указаны на ярлыках каждого пузырька. Используя данные концентрации, можно рассчитать калибровочную кривую для считывания результатов проб пациента полуколичественным методом. ^ Для распределения проб выворотки и плазмы пользуйтесь микропипеткой с одноразовыми микродозаторами. Распределяйте пипеткой непосредственно на дно лунок. Во избежание загрязнений при переносе меняйте микродозатор между пробами. Пробы пациентов, в которых ожидается содержание высоких концентраций, должны быть дополнительно предварительно разбавлены буфером для разбавления проб. Дополнительные разбавления должны учитываться во время расчетов. ^ Не заменяйте компоненты компонентами из других комплектов. Все компоненты перед использованием должны иметь комнатную температуру. Перед анализом разбавьте все пробы пациентов в пропорции 1:100 буфером для разбавления проб. Таким образом, соедините 10 мкл пробы с 1000 мкл буфера для разбавления проб в полистироловой пробирке. Хорошо перемешайте. Калибраторы и контроли готовы к использованию, их разбавлять не нужно. 1. Подготовьте достаточное количество микропланшетных стрипов для размещения калибраторов, контролей и предварительно разбавленных проб пациентов в двойном экземпляре.
2.Раскапайте 100 мкл калибраторов, контролей и предварительно разбавленных проб пациента. 3. Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (20 – 28оС). 4. Удалите содержимое микролунок и промойте 3 раза 300 мкл промывочного раствора. 5. Раскапайте 100 мкл раствора ферментного конъюгата в каждую лунку. 6. Инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре. 7. Удалите содержимое микролунок и промойте 3 раза 300 мкл промывочного раствора. 8. Раскапайте 100 мкл раствора субстрата ТМБ в каждую лунку. 9. Инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре с защитой от света. 10. Добавьте 100 мкл стоп-реагента в каждую лунку модулей и оставьте на 5 минут. Считайте оптическую плотность при 450 нм и рассчитайте результаты. Рекомендуется бихроматическое измерение с эталоном на 600-650 нм. ^ За это время считайте оптические плотности. РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ Для теста на антитела класса IgА к бета 2-гликопротеину рекомендуется 4-Параметрическая Подгонка с линейно-логарифмическими координатами по оптической плотности и концентрации. Также пригодны Сглаженная Сплайн-Аппроксимация и билогарифмические координаты. ^ Сначала рассчитайте усредненные оптические плотности для каждой лунки калибратора. Воспользуйтесь линейно-логарифмической миллиметровой бумагой и постройте график усредненной оптической плотности каждого калибратора в сравнении с концентрацией. Проведите наиболее подходящую кривую, приближающуюся к маршруту всех точек калибратора. Точки калибратора также могут быть связаны прямолинейными сегментами. Концентрация неизвестных может в этом случае быть выведена по калибровочной кривой методом интерполяции. ^ Цифры ниже показывают типичные результаты для теста на антитела класса IgG/IgM к бета 2-гликопротеину ELISA. Эти данные носят только иллюстративный характер и не должны использоваться для расчета результатов другой серии.
ХАРАКТЕРИСТИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ Чувствительность Нижний предел обнаружения для антител класса IgА к бета 2-гликопротеину I был определен на 0.5 U/мл. Параллелизм В экспериментах с разбавлением сыворотки с высокими концентрациями антител разбавлялись буфером для разбавления проб и анализировались в комплекте теста на антитела класса IgА к бета 2 - гликопротеину I. Исследование демонстрирует линеарность на всем интервале исследования ЛИТЕРАТУРА 1. Roubey, R.A.S. Review Article: Autoantibodies to phospholipid-binding plasma proteins: a new view of Lupus Anticoagulants and other "antiphospholipid" autoantibodies. Blood 1994; Vol 84, No 9: 2854 - 2867. 2. Schousboe, I. β2-Glycoprotein I: a plasma inhibitor of the contact activation of the intrinsic blood coagulation pathway. Blood 1985; Vol 66, No 5: 1086 - 1091. 3. Lee, N.S. et al. β2-Glycoprotein I - Molecular properties of an unusual apolipoprotein, Apolipoprotein H. J. Biol. Chem. 1983; Vol 258, No 8: 4765 - 4770. 4. Kandiah, D.A. et al. Epitope mapping studies of antiphospholipid antibodies and β2GPI using synthetic peptides. Lupus 1995; Vol 4, Suppl 1: S7 - S11. 5. Matsuura, E. et al. Molecular studies on phospholipid-binding sites and cryptic epitopes appearing on β2-glycoprotein I structure recognized by anti-cardiolipin antibodies. Lupus 1995; Vol 4, Suppl 1: S13 - S17. 6. Koike, T. Anticardiolipin Antibodies and β2-Glycoprotein I. Clinical Immunology and Immunopathology 1994; Vol 72, No 2: 187 - 192. 7. Roubey, R.A.S. et al. "Anticardiolipin" autoantibodies recognise β2-Glycoprotein I in the absence of phospholipid. J. Immunology 1995; Vol 154: 954 - 960. 8. Wang, M.-X. et al. Epitope specificity of monoclonal anti-β2-Glycoprotein I antibodies derived from patients with the antiphospholipid syndrome. J. Immunology 1995; Vol 155: 1629 - 1636..7 9. Arvieux, J. et al. IgG2 subclass restriction of anti-β2-Glycoprotein I antibodies in autoimmune patients. Clin. Exp. Immunol. 1994; Vol 95: 310 - 315. 10. Matsuda, J. et al. Prevalence of β2-glycoprotein I antibody in systemic lupus erythematosus patients with β2- glycoprotein I dependent antiphospholipid antibodies. Ann. Rheum. Dis. 1995; Vol 54: 73 - 75. 11. Martinuzzo, M.E. et al. Anti β2-Glycoprotein I antibodies: detection and association with thrombosis. Brit. J. Haematol. 1995; Vol 89: 397 - 402. 12. Balestrieri, G. et al. Anti-beta2-glycoprotein I antibodies: a marker of antiphospholipid syndrome? Lupus 1995; Vol 4: 122 - 130. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям