Карпова анна Валерьевна сочетанный анализ аллельного полиморфизма генов цитокинов tnfa, il4, il5 и hla-drb1, -dqa1, -dqb1 при различных вариантах клинического течения атопического дерматита
|
|
Скачать 265.99 Kb.
|
|
На правах рукописи КАРПОВА Анна Валерьевна СОЧЕТАННЫЙ АНАЛИЗ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ TNFA, IL4, IL5 и HLA-DRB1, -DQA1, -DQB1 ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТАХ КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ АТОПИЧЕСКОГО ДЕРМАТИТА. 14.00.36 - Аллергология и иммунология 14.00.11 - Кожные и венерические болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Новосибирск - 2009 Работа выполнена в Учреждении РАМН Научно-исследовательском институте клинической и экспериментальной лимфологии и Учреждении РАМН Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН ^ академик РАМН, профессор, доктор медицинских наук Владимир Иосифович Коненков доктор медицинских наук Наталья Николаевна Свечникова ^ доктор медицинских наук, профессор Константин Валентинович Гайдуль доктор медицинских наук, профессор Александр Иванович Новиков ^ Сибирский государственный медицинский университет Защита состоится 24 декабря 2009 г. в 14-00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 при НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г.Новосибирск, ул.Ядринцевская, 14 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН (630099, г.Новосибирск, ул.Ядринцевская, 14) Автореферат диссертации разослан "______"____________ 2009 г. Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Ольга Тимофеевна Кудаева ^ Актуальность темы: Атопический дерматит – хроническое заболевание, начинающееся в раннем детском возрасте, продолжающееся в течение всей жизни или до пубертатного периода и характеризующееся стадийностью развития воспалительного процесса кожи. Болезнь сопровождается поражением не только кожи, но и многих других органов и систем, существенно влияет на качество жизни больных (Lewis–Jones M.S. et al., 2001, Hanifin J.M., 2002). Уровень заболеваемости атопическим дерматитом остается высоким. Возросло количество больных тяжелыми, инвалидизирующими формами (Торопова Н.П., и др., 1997, 2000, Hanifin J.M., 2002). В последние годы появились работы, характеризующие состояние опорно-двигательного аппарата у детей, больных атопическим дерматитом, тогда как у взрослых больных состояние опорно-двигательного аппарата и причины его изменений остаются мало изученными (Торопова Н.П., 2000). В последнее десятилетие подробно освещена роль цитокинов в возникновении клинических проявлений атопического дерматита. Различными исследователями изучались ассоциации полиморфизма аллельных вариантов генов цитокинов с атопическим дерматитом. Выявлены как положительные ассоциации (Tanaka K. et al., 2001, Novak N. et al., 2002, Wilkowska A. et al., 2003, Oiso N. et al., 2000), так и их отсутствие (Reich K., 2003, Elliot K. et al., 2001, Oiso N., et al. 2000). В связи с этим целесообразно проанализировать аллельный полиморфизм генов цитокинов, принимающих непосредственное участие в развитии атопического дерматита - IL4, IL5, TNFА. Обнаружена связь атопических заболеваний с определенными антигенами главного комплекса гистосовместимости, в частности установлена положительная ассоциация атопического дерматита с антигенами HLA A24, -В5, -В9, -В12 и -В27 (Leung D.Y.M, 1996). ^ Оценить информативность сочетанного выявления аллелей генов цитокинов IL4, IL5, TNFА и HLA-комплекса для прогноза развития различных вариантов течения атопического дерматита. ^
Научная новизна: Впервые получены данные о распределении аллельных вариантов промоторных регионов генов TNFА, IL4, IL5 в точках полиморфизма TNFА G-308A, IL4 C-590T, IL5 C-703T в популяции сибирских европеоидов и проведён сравнительный анализ характера их распределения с другими европеоидными популяциями по данным литературы, осуществлён анализ неравновесного сцепления аллелей генов TNFA и генов HLA-DRB1, -DQA1 и –DQB1, расположенных на одном участке короткого плеча хромосомы 6q. Установлено, что генетические факторы риска развития атопического дерматита ассоциированы не только с аллелями генов HLA-комплекса, но и с SNP полиморфизмами промоторных регионов генов цитокинов с про- и противовоспалительной активностью. Выявлены ассоциации клинического полиморфизма атопического дерматита, вариантов его течения, связанных с наличием или отсутствием дисплазий соединительной ткани, с развитием в коже морфологических элементов пролиферативного характера, с уровнем IgE с аллельными вариантами исследованных генов и их комбинаций. ^ : Полученные данные об ассоциированности аллельных вариантов генов цитокинов и HLA-комплекса с атопическим дерматитом позволяют использовать их в качестве дополнительных скрининговых тестов для выявления генетических факторов риска развития болезни в педиатрической практике и в семейной медицине. Наличие ассоциированности аллельных вариантов исследованных генов с вариантами течения атопического дерматита может быть использовано в дерматологии для прогноза варианта течения болезни на ранних этапах возникновения заболевания. ^
^ : Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением материалов и методов исследования с описанием клинической характеристики обследуемых больных, главы результатов собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Список литературы включает 218 источников (из них 81 отечественных и 137 зарубежных). Работа изложена на 118 страницах машинописного текста. ^ : По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 2 статьи в журналах, определённых ВАК РФ для опубликования результатов соискателей учёной степени кандидата медицинских наук. ^ Характеристика обследованных групп. Обследовано 120 больных атопическим дерматитом, находившихся на лечении в городе Новосибирске, из них 55 мужчин и 65 женщин. В группе исследованных при оценке анамнеза получены данные о характере и начале течения заболевания, частоте обострений, наличии сопутствующих заболеваний. Группу контроля составили 210 здоровых европеоидов, проживающих в Западной Сибири, в возрасте от 18 до 45 лет, средний возраст составил 31 год. ^ Клинико-диагностические критерии установления диагноза соответствовали общепринятым методам. Интенсивность поражения кожи оценивалась по бальной системе SCORAD и вносили в индивидуальную карту. Больные были разделены на 3 группы в соответствии с тяжестью поражения кожи: в 1-ой группе интенсивность поражения кожи составила до 30 баллов SCORAD (36 человек). Во 2-ой группе - от 30 до 50 баллов (56 человек), в 3-ей группе - более 50 баллов (28 человек). Клинические формы в зависимости от преобладания отдельных морфологических элементов определяли по классификации Т.А. Гариной и К.Н. Суворовой и соавт. (1989). Эритематосквамозная без лихенификаций встретилась у 32, эритематосквамозная с лихенификациями – у 28, лихеноидная – у 37, и пруригинозная – у 23 пациентов. По степени тяжести больных атопическим дерматитом разделили на 3 группы - легкого течения (36 пациентов), средней тяжести (56 пациетов) и тяжелого течения (28 человек). По уровню IgE в сыворотке крови больных атопическим дерматитом разделили на две группы - 1 группа – с нормальным уровнем IgE (65 человек), 2 группа – с повышенным IgE (55 человек). По степени выраженности дисплазии соединительной ткани больных разделили на две группы: первая – имеющих 1-2 признаков дисплазии соединительной ткани (53 человека) и вторая – больше двух признаков (67 человек). ^ Для количественного определения общего IgE в сыворотке человека использовали набор «Тест-система для определения общего IgE». ^ Геномную ДНК выделяли из цельной венозной крови методом высаливания с протеиназой К (Green E.D., 1990, Savage D., 1993). ^ Исследованы полиморфные варианты генов цитокинов: IL4 C-590T, IL5 C-703T, и TNFA G-308A. Генотипирование аллельных вариантов осуществляли методом рестриктного анализа продуктов амплификации (ПДРФ - анализ), используя последовательности праймеров и параметры температурных циклов, описанные в литературе и учитывая рекомендации производителя использованного в работе амплификатора “i-Cycler“ (“BioRad”, США) (табл.1). Таблица 1. ^
^ Генотипирование DRB1, DQA1, DQB1 осуществляли методом аллель-специфической амплификации с сиквенс-специфическими праймерами (PCR-mSSP) (Alexeev A. et al. 1996), с использованием тест-систем АО ”ДНК-технология”, Москва. Панели позволяют тестировать 13 аллелей гена DRB1, 12 аллелей гена DQB1 и 8 аллелей гена DQA1. ^ Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга (РХВ) с помощью точного теста Фишера. Для сравнения частот аллелей между различными группами использовали критерий χ2. Уровень статистической значимости принимали р≤0,05. Обработка результатов генетических исследований осуществлялась с использованием критерия отношения шансов OR [Mehta C.R., 1985]. Все расчеты проводили с помощью программ «STATISTICA for Windows 6.0» и «Microsoft Excel XP». ^ Распределение аллелей гена TNFА в позиции G-308A среди здоровых лиц и больных атопическим дерматитом. Исследование проведено среди 120 здоровых европеоидов Западной Сибири (55 мужчин, 65 женщин). Выявлено преобладание частоты гомозиготного варианта GG (84,2%) над гетерозиготным AG (14,2%) и гомозиготным AA (1,6%). Полученные нами результаты исследования характера генотипов TNFA у здоровых лиц отражает закономерности, полученные как в европеоидных, так и в монголоидных популяциях, среди которых генотип GG также является преобладающим. Исследование проведено у 52 больных атопическим дерматитом (22 мужчины, 30 женщин). Среди больных атопическим дерматитом выявлено преобладание лиц, имеющих гомозиготный вариант GG гена TNFА, гетерозиготный вариант GA имели 5,75% больных, гомозиготный вариант – AA имели 5,75% пациентов. Выявлена близкая к достоверной (р=0,06) тенденция к снижению частоты встречаемости гетерозиготного варианта GA у пациентов с атопическим дерматитом за счёт увеличения обоих гомозиготных вариантов гена TNFА. Характеристики распределения аллелей и генов TNFА в позиции G-308A среди пациентов с различными вариантами клинического течения атопического дерматита. Исследование проведено в группе 52 больных атопическим дерматитом (22 мужчин и 30 женщин). Таблица 2. Частота встречаемости генотипов и аллелей G-308A TNFА среди больных атопическим дерматитом с легким и тяжелым вариантами течения.
Примечание: достоверные отличия результатов при p < 0, 05. Выявлена ассоциированность аллеля -308 G гена TNFА с тяжелым вариантом течения атопического дерматита (табл.2), в то время как носительство «мутантного» аллеля 308А гена TNFА играет протективную роль в развитии тяжелого характера течения атопического дерматита. Распределение аллельных вариантов гена IL4 в позиции С-590Т среди здоровых лиц и больных атопическим дерматитом. Анализ распределения генотипов IL4 в позиции С-590Т среди 140 здоровых лиц европеоидного происхождения, проживающих в Новосибирской области, выявил преобладание гомозиготного CC варианта (61.42%) над гетерозиготным CT (34.29%). Аллель -590Т (h=0.2143) встречается в данной группе в 3,5 раза реже, чем аллель -590С (h=0.7857). Исследование проведено среди 31 больных атопическим дерматитом (14 мужчин и 17 женщин). Выявлено статистически значимое снижение частоты аллеля -590С в группе больных атопическим дерматитом по сравнению с контрольной группой. Частота аллеля -590Т среди больных атопическим дерматитом более чем в 2,5 раза превосходит частоту данного аллеля в группе практически здоровых лиц. Установлено статистически значимое преобладание гомозиготного генотипа ТТ (32,26%) и достоверное снижение частоты гомозиготного генотипа СС среди больных атопическим дерматитом (22,58%), по сравнению с контрольной группой. Таблица 3. Частота встречаемости генотипов и аллелей С-590Т IL4 в группах больных атопическим дерматитом и здоровых европеоидов Западной Сибири.
Примечание: достоверные отличия результатов при p < 0, 05. Можно предположить, что ассоциированность аллельного варианта Т в данной точке полиморфизма регуляторной зоны гена ^ и высоким уровнем его продукции во внеклеточную среду, приводит к тому, что носители данного аллельного варианта являются лицами с высоким содержанием в тканях этого Th2 цитокина с противовоспалительной активностью. Распределение аллельных вариантов гена IL5 в позиции С-703Т среди здоровых лиц и больных атопическим дерматитом. Среди 137 здоровых европеоидов Западной Сибири, из них 65 мужчины и 72 женщины установлено преобладание генотипа СС(55%), СT составил 38%, и 7% - TT. Подобное соотношение генотипов выявлено в европеоидных популяциях. Исследование распределения С-703Т промоторного участка гена IL5 проведено в группе 35 больных атопическим дерматитом (18 мужчин и 17 женщин).  Рисунок 1. Частота встречаемости генотипов С-703T IL5 среди больных атопическим дерматитом и здоровых лиц. Результаты сравнительного анализа показали высоко достоверное снижение частоты выявления гомозиготных генотипов СС (17%) среди больных атопическим дерматитом по сравнению со здоровыми лицами (55%). Наряду с этим у пациентов достоверно чаще встречался гетерозиготный вариант СT (63%). Выявлена тенденция к повышению частоты встречаемости гомозиготного варианта TT по сравнению с контрольной группой, однако, выявленные различия не достоверны. Характеристика распределения гена IL5 в позиции С-703Т среди пациентов с различными вариантами клинического течения атопического дерматита. Проведен сравнительный анализ частоты встречаемости генотипов и аллелей С-703T IL5 среди 35 больных атопическим дерматитом с различными вариантами тяжести течения заболевания. В группе больных с лёгким течением (12 человек) заболевания по сравнению со среднетяжёлым течением (10 человек) достоверно чаще встречался генотип СТ (р=0,0433), и достоверно реже генотип ТТ(р=0,0287). Распределение аллельных вариантов HLA-комплекса среди здоровых лиц и больных атопическим дерматитом. Изучены особенности распределения аллельных вариантов HLA-комплекса 88 пациентов (42 мужчины и 46 женщин). Контрольную группу составили 210 здоровых европеоидов Западной Сибири (102 мужчины и 108 женщины). Выявлены достоверные различия в частоте встречаемости указанных генов в группе больных атопическим дерматитом и доноров: HLA-DQB1*0201 достоверно чаще встречали в группе доноров. Среди больных атопическим дерматитом и доноров выявлены следующие различия: аллели DQA1*0102, DQB1*0302, DR13, DQA1*0301, DQA1*0501 и генотипы DQB1*0301-DQB1*0302, DRB1*01-DRB1*11 достоверно чаще обнаруживали в группе больных атопическим дерматитом (таблица 4). Анализ частоты встречаемости показал, что двухлокусные гаплотипы DRB1*04-DQB1*0302, DQA1*0103-DQB1*0602-8 и DQA1*0301-DQB1*0302 встречаются достоверно чаще в группе больных атопическим дерматитом. Напротив, частота встречаемости ассоциации DRB1*15-DQA1*0102 была достоверно выше в группе доноров. Гаплотипы DRB1*04-DQA1*0301-DQB1*0302 и DRB1*15-DQA1*0103-DQB1*0602-8 достоверно чаще выявляли среди больных атопическим дерматитом по сравнению с группой здоровых доноров, тогда как гаплотип DRB1*15-DQA1*0102-DQB1*0602-8 доминировал в группе здоровых лиц. Таблица 4. Частота встречаемости (%) гаплотипов HLA локусов DRB, DQA, DQB в группах больных атопическим дерматитом и здоровых европеоидов Западносибирского региона.
Примечание: достоверные отличия результатов при p < 0, 05 Сравнительный анализ распределения генов HLA-комплекса II класса среди пациентов с различными вариантами клинического течения атопического дерматита. Изучены распределения генов HLA-комплекса II класса у 30 больных атопическим дерматитом. Эритематосквамозная форма заболевания без лихенификаций встречалась у 15 больных, эритематосквамозная с лихенификациями встретилась у 7 человек, лихеноидная – у 5 и пруригинозная – у 3 больных. Группы были объединены по выраженности пролиферативных процессов в эпидермисе на эритемато-сквамозную и пруригинозно-лихеноидную формы заболевания. Анализ полученных результатов показал, что аллели HLA-A3, DR11; генотип DR11/DR16; гаплотипы A2/B49, A3/B7, A9/B27, A0/DR11, A2/DR11, A3/DR16, A9/DR2, A9/DR11, B7/DR2 , B27/DR11 достоверно чаще выявляются у больных с эритематосквамозной формой заболевания по сравнению с лихеноидной и пруригинозной. Определение у больного аллелей HLA-A3, DR11, а также генотипов DR11/DR16; гаплотипов A2/B49, A3/B7, A9/B27, A0/DR11, A2/DR11, A3/DR16, A9/DR2, A9/DR11, B7/DR2, B27/DR11 свидетельствует о том, что у него будет эритематосквамозная форма заболевания. Напротив, клинические формы атопического дерматита, сопровождающиеся появлением на коже морфологических элементов, связанных с пролиферативными процессами в коже, ассоциированы с HLA-гаплотипами A0/B13, A2/DR3. Проанализирован характер распределения HLA-антигенов и их различных комбинаций у 81 больного с различной тяжестью течения заболевания. Выявлена следующая закономерность: для больных с легким течением болезни характерно достоверное увеличение частоты встречаемости HLA-антигена B13 (RR=7.0); гаплотипов A3/B7 (RR=2.10), A3/DR2 (RR=2.71), B7/DR2 (RR=2.53), B7/DR6 (RR=3.48) и уменьшение частоты встречаемости, по сравнению с контролем, антигена DR3 (RR=-6.25). Тяжелое течение заболевания негативно ассоциировано с такими комбинациями антигенов как A2/DR3 (RR=-4.02) и B7/DR5 (RR=-6.12). Сочетание HLA-антигена B7 с антигеном DR2 или DR6 характерно для легкого течения атопического дерматита, тогда как сочетание данного антигена с HLA-DR5 - для тяжелого течения. Проведён анализ ассоциированности HLA II с IgE у 34 больных атопическим дерматитом (18 женщин и 16 мужчин). Выделены две группы – первую группу с нормальным уровнем IgE составили 16 человек (12 женщин и 4 мужчин), вторую группу, с повышенным уровнем IgE составили 18 человек (6 женщин и 12 мужчин). При сравнительном анализе частоты встречаемости антигенов HLA-A, и -B достоверных ассоциаций выявлено не было. Для HLA -DR локусов в группе больных атопическим дерматитом выявлена достоверно значимая ассоциация HLA- антигена DRB1-0602-8 и повышенного уровня IgE -, а также HLA DQ B1 0602-8 - 31,25 и 64,71. В группах с минимальными и максимальными проявлениями дисплазий соединительной ткани отмечены следующие достоверные отличия: аллель HLA-DR2 и HLA-генотип DR2/DR3; HLA-гаплотипы A9/B15, A2/DR2, A2/DR3, A9/DR15, B13/DR2 чаще выявляются у больных с выраженными проявлениями дисплазии соединительной ткани. Отмечено достоверное преобладание HLA-DR7 и HLA-гаплотипов A2/B0, A2/DR7, A10/DR7, B0/DR5 , B13/DR5 у больных с минимальными проявлениями дисплазии соединительной ткани, что позволило рассматривать наличие указанных генов и гаплотипов как признаки благоприятного течения атопического дерматита. Неравновесное сцепление аллелей гена TNFА в позиции G-308A с аллелями генов HLA- DRB1, DQA1 и -DQB1 среди здоровых сибирских европеоидов и больных атопическим дерматитом. Анализ частоты встречаемости четырёхлокусных гаплотипов DRB1-DQA11-DQB1- ^ -308 A и DRB1*15-DQA1*0102-DQB1*0602-8- TNFA -308 G выше в контрольной группе по сравнению с группой больных атопическим дерматитом, что указывает на протективное значение данных гаплотипов в отношении развития атопического дерматита. Таблица 5 Частота встречаемости (h) гаплотипов HLA генов DRB1, DQA1, DQB1 и TNFA (-308) в группах больных атопическим дерматитом и здоровых европеоидов Западной Сибири.
^ Прогностическая значимость выявления в генотипе пациентов с атопическим дерматитм аллельных вариантов генов цитокинов TNFА, IL4, IL5 и генов HLA-комплекса. Исследование генотипа аллельных вариантов генов цитокинов TNFА, IL4, IL5 и генов HLA-комплекса может служить прогностическим признаком того или иного варианта течения заболевания. Выявление аллеля -308 G гена TNFА свидетельствует о высокой вероятности тяжелого варианта течения атопического дерматита. Тестирование аллеля -590Т IL4 у потомков больных атопическим дерматитом может свидетельствовать о наличии или отсутствии предрасположенности к данному заболеванию. Наличие HLA- антигенов DRB1-0602-8, HLA DQ B1 0602-8 - 31,25 и 64,71 свидетельствует о развитии варианта атопического дерматита с повышенным уровнем IgE. Ранним прогностическим признаком лёгкого характера течения атопического дерматита является сочетание HLA- антигена B7 с антигеном DR2 или DR6, а сочетание HLA-антигена B7 с антигеном DR5 характерно для тяжелого течения атопического дерматита. Наличие аллеля HLA-DR7 и HLA-гаплотипов A2/B0, A2/DR7, A10/DR7, B0/DR5, B13/DR5 следует рассматривать как ранние прогностические признаки развития диспластических процессов в соединительной ткани, не сопровождающихся системностью. Таким образом, выявление этих генов позволит прогнозировать и более благоприятное течение атопического дерматита, не сопровождающегося диспластическими процессами во внутренних органах. Сочетание гаплотипов DRB1*03-DQA1*0501-DQB1*0201- TNFA -308 A и DRB1*15-DQA1*0102-DQB1*0602-8- TNFA -308 G напротив, свидетельствует о малой вероятности развития атопического дерматита. ВЫВОДЫ 1. Факторами риска развития атопического дерматита в популяции сибирских европеоидов являются наличие в геноме пациента генотипа АА в промоторной зоне гена TNFA G -308A, ассоциированного с высоким уровнем продукции этого провоспалительного цитокина, аллеля Т и генотипа TT в полиморфной позиции C-590T гена IL4, аллеля Т и генотипа ТТ полиморфного участка С-703Т гена IL5, генотипов DRB1*04-DQB1*0302 и DRB1*15-DQA1*0103-DQB1*0602-8 генов HLA комплекса. 2. Протективную роль в развитии атопического дерматита играют: наличие в геноме пациента генотипа АG в промоторной зоне гена ^ IL4, аллеля С и генотипа СС полиморфного участка С-703Т гена IL5, генотипов DRB1*15-DQA1*0102 и DRB1*15-DQA1*0102-DQB1*0602-8 генов HLA комплекса. 3. Вариант длительного тяжелого течения атопического дерматита ассоциируется с наличием в геноме пациента аллеля G и генотипа GG в промоторной зоне гена TNFA G -308A, сцепленного с низким уровнем продукции этого провоспалительного цитокина, генотипа ТТ полиморфного участка С-703Т гена IL5 и HLA-специфичностей -A9, - DR3, A2-DR3, B7-DR5. 4. Среди пациентов с атопическим дерматитом в значительной части выявляются клинические проявления дисплазии соединительной ткани, ассоциированной с наличием в геноме генотипа ТТ полиморфного участка С-703Т гена IL5 и HLA-специфичностей - DR2, A2-DR3, А9-DR15, В13-DR2. 5. Среди пациентов с атопическим дерматитом установлено наличие неравновесного сцепление аллелей гена TNFА в позиции G-308A с аллелями генов HLA - DRB1, DQA1 и -DQB1, расположенными на одном участке хромосомы 6q по аллелям DRB1*13-TNFA-308G и DQA1*0101- TNFA -308, не характерное для здоровых лиц. 6. Комплексное типирование генов цитокинов с про- и противоспалительной активностью и генов главного комплеса гистосовместимости позволяет выявить генетическую предрасположенность к развитию атопического дерматита и развития болезни. ^
^
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям