Протоколы лабораторной диагностики инфекции, вызванной Chlamidia trachomatis (урогенитальной хламидийной инфекции): учеб метод пособие / И. Шиманская, О. Панк
|
|
Скачать 0.53 Mb.
|
|
Таблица 5. ^
Методы лабораторной диагностики ^ Принцип культурального метода основан на выделении C. trachomatis из биологического материала больных урогенитальной хламидийной инфекцией после заражения этим материалом чувствительных живых клеток тканевых культур (клеток линий L-929, McCoy, Hela и др.). До начала 1980-х годов культуральный метод был основным методом, диагноза хламидийной инфекции (20). Считалось, что этот метод имеет 100% специфичность, так как результат был очевидным при выявлении в клетках характерных для C. trachomatis включений. Таким образом, изначально это был «золотой стандарт», с которым сравнивали новые методы диагностики хламидийной инфекции, не связанные с выявлением жизнеспособного микроорганизма. Выделение хламидий методом культуры клеток сейчас редко используется для диагностики в Северной Америке и Западной Европе, и не рекомендовано для рутинной диагностики в странах Восточной Европы, за исключением случаев судебно-медицинской экспертизы, случаев сексуального насилия над детьми, или когда культура живых хламидий необходима для исследовательских целей, например для определения антибиотикорезистентности хламидий in vitro. Однако сохранение опыта работы с культуральным методом чрезвычайно важно. С использованием этого метода было обнаружено появление так называемого «шведского» мутантного типа C. trachomatis, который не удавалось обнаружить при помощи МАНК, основанных на определении плазмиды хламидий (21, 22). Метод рекомендован для работы в референс- лабораториях. Достоинства и недостатки метода. Преимущества метода диагностического выделения хламидий в культуре клеток заключаются в том, что данный метод обеспечивает выделение живого возбудителя, что является достоверным подтверждением диагноза. Проблема культуральной диагностики урогенитальной хламидийной инфекции состоит в том, что для ее осуществления необходима быстрая транспортировка клинического материала на холоде (6+2°С), чтобы сохранить жизнеспособность даже небольшого количества хламидий, которое находится в клиническом материале. Более того, это сложная и требующая времени процедура, для которой нет ни строго стандартизированных методов, ни питательных сред. Кроме того, при выполнении культурального исследования персоналу приходится постоянно работать с высококонцентрированным инфекционным материалом, получаемым в процессе культивирования C. trachomatis, что предъявляет высокие требования к биологической безопасности лабораторий. Трудность культуральной диагностики урогенитальной хламидийной инфекции обусловлена также многообразными факторами, которые могут оказывать негативное влияние на культивирование хламидий. Например, применение гинекологических любрикантов, спринцеваний, спермицидов, оказывающих бактериостатическое и бактерицидное действие, может отрицательно влиять на выделение хламидий. Вата, альгинат кальция, дакрон, входящие в состав тампонов для получения клинического материала, могут быть токсичными для культуры клеток и хламидий. Это происходит из-за того, что ненасыщенные жирные кислоты, находящиеся в ватных волокнах, хлорсодержащие отбеливатели, смола, входящая в состав деревянных палочек, клей, используемый для соединения тампонов со стержнями, также могут быть токсичными для клеточных культур. Чувствительность культурального метода диагностики, по данным разных авторов, колеблется в пределах 40 – 70%. При этом специфичность метода остается 100%. Источники ошибок при выявлении хламидий культуральным методом:
Оценка результатов. Результаты культурального исследования должны быть получены через 2-3 дня (48 – 72 часа). Результат считается положительным, если обнаруживается хотя бы одно хламидийное внутрицитоплазматическое включение и нет причин подозревать контаминацию другим положительным образцом. Если такое подозрение есть, исследование необходимо повторить, используя оставшийся клинический материал, кроме того, в этом случае желательно еще использовать другой альтернативный диагностический метод. Форма заключения лабораторного исследования на основании результатов культурального метода выделения хламидий: Chlamydia trachomatis выделены. ^ не выделены. Иммунологические методы диагностики Методы выявления антигенов Общие положения. Антиген C. trachomatis в клиническом материале определяется либо прямой микроскопией с использованием метода прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), либо опосредовано, методом иммуноферментного анализа (ИФА). Специфичность этих методов значительно возросла с появлением высокоспецифичных моноклональных антител. Вместе с тем, чувствительность этих методов значительно ниже по сравнению с методами, основанными на амплификации нуклеиновых кислот (23). ^ Принцип метода заключается в выявлении антигенов хламидий в соскобных препаратах урогенитального тракта больных урогенитальной хламидийной инфекциией путем обработки препаратов меченными флюоресцеином моноклональными антителами к родоспецифическим и видоспецифическим антигенам хламидий. Исследование препаратов осуществляют с использованием люминесцентного микроскопа. Коммерческие препараты моноклональных антител обычно содержат синьку Эванса или родамин, которые элиминируют неспецифическое свечение и окрашивают цитоплазму клеток в красный или оранжевый цвет. При просмотре препаратов антигены хламидий выявляются на красном или оранжевом фоне цитоплазмы эпителиальных клеток в виде округлых яблочно-зеленых элементарных телец. Чувствительность и специфичность. Чувствительность метода составляет 55-76%, специфичность - около 98%. Достоинства и недостатки метода Метод ПИФ отличается быстротой и прост в исполнении, но все же недостаточно чувствителен. К положительным качествам метода люминесцирующих антител относится высокая специфичность. К числу недостатков метода относятся: субъективизм оценки, необходимость присутствия квалифицированного исследователя, осуществляющего исследование препаратов, невозможность автоматизации процесса. Возможны значительные расхождения в выполнении процедуры фиксации препаратов, учета количества элементарных телец, необходимых для положительного заключения о наличии инфекции, используемых в работе антител. Главный недостаток метода – его низкая чувствительность при малых количествах элементарных телец в исследуемом материале. В этих случаях при использовании ПИФ возрастает количество ложноотрицательных результатов. Этот метод разработан исключительно для исследования клинических материалов, полученных из уретры или цервикального канала. Он не пригоден для исследования материалов, полученных неинвазивным способом (моча, эякулят, отделяемое влагалища). Источники ошибок:
Оценка результатов качества взятия клинического материала и результатов при постановке метода ПИФ Для оценки качества взятия материала просматривают не менее 10 полей зрения, используя увеличение люминесцентного микроскопа ×400. В одном поле зрения микроскопа должно быть более 5 клеток цилиндрического эпителия. Критерии, используемые для оценки, включают размер элементарных телец – 200-300 нм, их яблочно-зеленый цвет и правильную округлую форму. Если в препарате содержится достаточное количество эпителиальных клеток и видны специфические флюоресцирующие элементарные тельца (более 5 элементарных телец в препарате), результат считается положительным. Препарат не должен оцениваться если:
Форма заключения лабораторного исследования на основании результатов метода ПИФ:
Иммуноферментный анализ для определения антигена (ИФА-АГ) Принцип метода. Метод основан на выявлении в клиническом материале антигенов хламидий путем проведения ИФА с использованием моноклональных антихламидийных антител установленной специфичности. Существует ряд доступных коммерческих тест-систем для ИФА. Методы тестирования варьируют от прямого обнаружения антигена до захвата антигена с использованием или без использования ферментной амплификации с целью увеличения чувствительности метода. Чувствительность и специфичность метода колеблется от 20 до 85% и зависит от вида тест-системы. В современных коммерческих тест-системах чувствительность ИФА сравнима или немного выше, чем у культурального метода, а специфичность адекватна для использования метода в популяции со средней и высокой распространенностью инфекции, например, ≥5% (24). Чувствительность ИФА близка методу ПИФ, однако ниже, чем у методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот возбудителя (25). Достоинства и недостатки метода Иммуноферментный анализ может быть автоматизирован, что позволяет обрабатывать большое количество образцов, отличается относительно невысокой стоимостью. Недостатки: ИФА основан на определении липополисахарида (ЛПС) хламидий, который, как известно, перекрестно реагирует с ЛПС других микроорганизмов, что может приводить к ложноположительным результатам; метод может применяться только для материала, полученного инвазивным способом (соскоб цервикального канала шейки матки, уретры). Источники ошибок:
Оценка результатов. Визуально положительные пробы приобретают цветное окрашивание; интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству антигена хламидий. Результат исследования определяют с помощью специальных ридеров, позволяющих определять оптическую плотность образца при определенной длине волны (обычно – при 492 нм). Образцы, дающие значения оптической плотности выше или равные значениям отсекающего поглощения (cut-off), считаются положительными. Форма заключения лабораторного исследования на основании результатов метода ИФА:
Методы выявления антител к C. trachomatis Методы серологической диагностики хламидиоза, направленные на выявление антител к хламидиям, основаны на определении специфических антител в сыворотке крови, а также в других биологических жидкостях и секретах больных урогенитальной хламидийной инфекцией или имеющих хламидиоз в анамнезе. Для серодиагностики в настоящее время наиболее часто используют иммуноферментный анализ (ИФА на наличие антител). Общий принцип: антиген фиксируется на твердой поверхности, обрабатывается испытуемой сывороткой, а затем антивидовым иммуноглобулином, связанным с ферментом, визуализирующимся после добавления субстрата. Многочисленные исследования показали связь между хламидийной инфекцией, например, воспалительными заболеваниями органов малого таза, трубным бесплодием и присутствием высоких титров антител к хламидиям. Это привело к предположению, что обнаружение и количественный анализ антител к хламидиям полезны для диагностики хламидийной инфекции, даже с учетом того, что у здоровых людей также может наблюдаться присутствие высоких уровней антител. Однако выявление антител к хламидиям связано с рядом проблем. Воспроизводимость методов, таких как микроиммунофлюоресцентный тест, низка и нет никаких согласованных стандартов. У некоторых людей иммунный ответ на урогенитальную хламидийную инфекцию может быть отсрочен или даже отсутствовать после перенесенной хламидийной инфекции. В случаях, где ответ есть, антитела часто сохраняются в течение длительного времени после выздоровления. По этим причинам, несмотря на ряд очевидных достоинств иммунологических методов для выявления антител к возбудителю урогенитального хламидиоза (относительная дешевизна и простота постановки, возможность автоматизации), серологическое исследование для диагностики отдельных случаев урогенитальной хламидийной инфекции не рекомендуется. Диагноз должен быть основан на прямом выявлении этиологического агента. Определение антител к хламидиям может быть использовано в эпидемиологических исследованиях как совокупный показатель контакта исследуемой популяции с возбудителем. ^ Общие положения. Одним из актуальных направлений научно-технического прогресса в лабораторной практике является миниатюризация аналитических технологий, что в ряде случаев сопровождается радикальным изменением привычного формата исследования. Новой диагностической технологией является иммунохроматографический анализ, который иногда называют простым быстрым тестом. Принцип метода. В основу методов экспресс-диагностики хламидийной инфекции положены иммунохроматография и ферментспецифическая реакция. Метод позволяет выявлять в исследуемом материале антигены хламидий. В большинстве разработанных наборов применяются моно-или поликлональные антитела к антигену хламидий в том же качественном составе, что и в наборах реагентов для иммуноферментного анализа. Быстрые иммунохроматографические тесты, такие как Unipath Clearview и другие можно использовать у постели больного (Bed Side), при скрининговых исследованиях. Чувствительность и специфичность. Тесты у постели больного не обладают достаточной чувствительностью и специфичностью по сравнению с методами амплификации нуклеиновых кислот, хотя приемлемая чувствительность была доказана для Chlamydia Rapid Test (26). Достоинства и недостатки метода. К числу достоинств данных методов относится простота и быстрота процедуры исследования, отсутствие потребности в специальном оборудовании, когда возможность проведения других методов диагностики отсутствует (27). Недостаток: широкое применение тестов ограничивается ввиду недостаточно высокой чувствительности и специфичности по сравнению с методами амплификации нуклеиновых кислот (26). Оценка результатов Накопление в зоне учета результатов реакции иммунных комплексов, содержащих метки, приводит к образованию окрашенной полосы (розового цвета различной интенсивности), учитываемой визуально. При отсутствии антигенов хламидий в исследуемом образце окрашенной полосы не формируется. Правильность прохождения реакции проверяют по появлению цветной полосы в месте расположения контроля. Если окраска в этой зоне контроля не появляется, результат расценивают как «неопределенный», исследование повторяют с новой пробой клинического материала. Источники ошибок:
Форма заключения результатов быстрых тестов у постели больного:
МолекулярнО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ методы диагностики Общие положения. Развитие молекулярной биологии – открытие генетического кода, изучение структуры и роли нуклеиновых кислот ДНК и РНК, как хранилища генетической информации живой материи, - открыло новые возможности в изучении и диагностике микроорганизмов. Накапливаемые данные об организации геномов бактерий и вирусов, изучение генетического полиморфизма, идентификация уникальных и специфических для разных видов микроорганизмов участков генома послужили реализации идеи использования генетического материала в качестве мишени для диагностики возбудителей инфекций. В настоящее время для выявления нуклеиновых кислот хламидий в образцах биологического материала предлагается значительное количество тест-систем, основанных на различных молекулярно-биологических подходах. В этой связи выбор тест-систем для использования в конкретной лаборатории представляет собой достаточно трудную задачу. При этом решающими должны быть не такие очевидные параметры, как стоимость и удобство в повседневной работе, а чувствительность и специфичность. К сожалению, исследования, посвященные сравнительной оценке тест-систем отечественного производства немногочисленны (28, 29). В сложившейся ситуации резко возрастают требования к внутрилабораторной валидации тест-систем. Методы выявления нуклеиновых кислот можно разделить на две группы: связанные и не связанные с амплификацией нуклеиновых кислот. ^ К основным методам, не связанным с амплификацией нуклеиновых кислот, относятся различные варианты методов, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот-мишеней и комплементарных зондов, содержащих радиоактивные или другие метки. Лучшим примером такого метода является тест PACE® 2 CT (Gen-Probe, Inc. San Diego, CA), одобренный FDA 1988 году. Тест основан на гибридизации ДНК-зонда со специфическим участком 16S рибосомальной РНК C. trachomatis. В связи с относительно низкой чувствительностью указанный метод постепенно вытесняется амплификационными методами. Чувствительность и специфичность: чувствительность – 70-85%, специфичность приближается к 100%. Форма заключения:
Методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот Разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) явилась поворотным моментом в развитии молекулярной диагностики. Хотя этот метод амплификации нуклеиновых кислот и остается наиболее распространенным, в настоящее время предложены и другие способы амплификации. Все амплификационные методы можно разделить на три группы: основанные на амплификации сигнала, мишени и зонда. Амплификация сигнала. При использовании методов амплификации сигнала, в ходе реакции увеличения концентрации мишени или зонда не происходит. Значительное повышение аналитической чувствительности метода достигается за счет связывания с мишенью множества меченых молекул. Один из вариантов этого подхода (hybrid capture assay – метод захвата гибридных молекул) используется в коммерческих тест-системах для выявления C. trachomatis – HC2® CT ID (Qiagen Germantown, MD). Метод основан на гибридизации в растворе ДНК-мишени и РНК-зонда. Образовавшиеся гибридные молекулы захватываются иммобилизованными антигибридными антителами. Затем к иммобилизованным гибридным молекулам присоединяются антигибридные антитела, меченные щелочной фосфатазой. Реакция оценивается по интенсивности люминесценции, ее высокая чувствительность определяется тем, что к одной гибридной молекуле (ДНК+РНК) присоединяется множество молекул меченых антител. Амплификация зонда. При использовании этих методов продукт амплификации представлен только нуклеотидными последовательностями, входящими в состав зонда. Наиболее известным вариантом этого метода является лигазная цепная реакция, реализованная в коммерческом продукте LCx Probe System (Abbott), однако в 2003 г производитель отозвал тест-систему с рынка. Амплификация мишени. Все методы, относящиеся к этой группе, основаны на проведении энзиматических реакций, в процессе которых один или несколько ферментов синтезируют множественные копии нуклеиновой кислоты – мишени. ^ Принцип метода: Амплификация ДНК-мишени осуществляется в ходе повторяющихся циклов, каждый из которых включает:
По окончании цикла происходит удвоение фрагментов ДНК-мишени. При проведении n циклов количество фрагментов ДНК-мишени будет составлять 2n. На практике для получения продуктов амплификации (ампликонов) в количестве, достаточном для их детекции обычными аналитическими методами, проводят приблизительно 30 циклов амплификации. Первоначально в ходе ПЦР после каждого отжига праймеров в реакционную смесь приходилось добавлять новую порцию ДНК-полимеразы, так как ранее внесенный фермент инактивировался при высокой температуре на этапе денатурации. Высокую скорость реакции амплификации удалось получить при использовании термостабильной ДНК-полимеразы и благодаря созданию программируемых термоциклеров, обеспечивающих быстрое и точное изменение температуры реакционной смеси. Для детекции продуктов амплификации применяют несколько методов. Наиболее распространенным методом детекции является горизонтальный электрофорез образца реакционной смеси, полученного после окончания амплификации, в агарозном геле. Результат ПЦР считается положительным при выявлении фрагмента ДНК, по своей молекулярной массе соответствующего молекулярной массе ампликона контрольного образца. Для этого при проведении электрофореза необходимо использовать маркеры (фрагменты ДНК известной молекулярной массы), положительный и отрицательный контроли. Существенными недостатками метода являются: субъективность оценки результатов электрофореза оператором, низкая производительность, невозможность автоматизации процесса, трудность количественной оценки продуктов ПЦР в каждом конкретном образце. Наибольшую опасность составляет возможность наработки в ходе ПЦР неспецифического продукта, сходного по размерам с детектируемым продуктом. При существующей системе детекции возможна выдача оператором ложноположительного результата. Альтернативой электрофоретическим методам детекции ПЦР-амплифицированной ДНК являются методы гибридизационно-флуоресцентной детекции. В ходе такого способа детекции амплифицированная ДНК гибридизуется и с праймерами, и с мечеными флуоресцентным красителем олигонуклеотидными зондами, специфичными к внутренней последовательности анализируемого фрагмента. Образовавшийся гибрид автоматически регистрируется флуоресцентным или фотометрическим ридером. Таким образом, при гибридизационном способе детекции ДНК специфичность реакции амплификации обеспечивается, во-первых, за счет гибридизации с праймерами, во-вторых, за счет гибридизации со специфическими зондами. Метод ПЦР в его классическом варианте первоначально использовался для детекции ДНК C. trachomatis с помощью тест-систем, сконструированных в каждой лаборатории самостоятельно (домашнее изготовление). К настоящему времени такие тест-системы вытесняются коммерческими тест-системами. В большинстве тест-систем мишенью является криптическая плазмида или 23S рРНК C. trachomatis. ПЦР в классическом варианте используется в коммерческих тест-системах производства Roche Molecular Diagnostics Pleasanton, CA (AMPLICOR® CT/NG Test for Chlamydia trachomatis и COBAS AMPLICOR® CT/NG Test for Chlamydia trachomatis). Мишенью в указанных тест-системах является криптическая плазмида. Существует ряд ПЦР– тест-систем производства Российской Федерации для детекции Chlamydia trachomatis, разрешенных к медицинскому применению. Тест-системы, основанные на принципе классической ПЦР, являются наименее удобными в повседневной работе (особенно при ручном исполнении), но отличаются относительно низкой стоимостью. Для повышения чувствительности и специфичности классической ПЦР был разработан ее вариант получивший название гнездной ПЦР. При этом используют две пары праймеров. После проведения амплификации с использованием первой пары праймеров полученные ампликоны используют во втором раунде ПЦР со второй парой праймеров. Вторая пара праймеров отжигается на внутренних участках ампликонов, таким образом, продукт второго раунда амплификации оказывается короче, чем продукт первого раунда. Повышение чувствительности и специфичности гнездной ПЦР достигается за счет увеличения общего количества циклов амплификации (по 15 – 30 в каждом раунде) и отжига второй пары праймеров только на фрагментах, полученных в первом раунде. Метод гнездной ПЦР используется в основном в исследовательских целях и не нашел широкого применения в коммерческих тест-системах. С практической точки зрения, весьма перспективной является мультиплексная ПЦР. При этом варианте в одной и той же пробирке находятся несколько пар праймеров, специфичных для различных мишеней, что позволяет проводить детекцию нескольких мишеней одновременно. Конструирование праймеров и оптимизация условий для мультиплексной ПЦР несколько сложнее, чем решение этих задач для классической ПЦР, так как необходимо исключить возможную комплементарность между различными праймерами и обеспечить для них одинаковую температуру отжига. Мультиплексная ПЦР по чувствительности несколько уступает обычной реакции. ^ Один из принципиальных недостатков, затрудняющих использование классической ПЦР в рутинной диагностике, связан с крайне высокой чувствительностью этого метода, что повышает вероятность ложноположительных результатов из-за перекрестной контаминации исследуемых образцов. Вероятность перекрестной контаминации удается предотвратить при использовании метода ПЦР в реальном времени, благодаря тому, что процессы амплификации и детекции продуктов амплификации происходят одновременно в одной и той же пробирке. Для детекции продуктов амплификации разработаны достаточно сложные технологии, основанные на комплексе ферментативных реакций, в результате которых в реакционной смеси возникает флюоресцентный сигнал, по интенсивности пропорциональный количеству образовавшегося продукта амплификации. Специфичность флюоресцентного сигнала удается получить при использовании ДНК-зондов, комплементарных внутренним участкам фрагмента ДНК, ограниченного праймерами. Наибольшее распространение получили TaqMan зонды и «молекулярные маяки». Детальное описание конструкции зондов и химических реакций, приводящих к появлению флюоресценции, при накоплении в реакционной смеси продуктов амплификации выходит за рамки настоящего протокола. ПЦР в реальном времени может быть использована для определения количественного содержания ДНК-мишени в биологическом образце. Целесообразность количественной детекции C. trachomatis при урогенитальной хламидийной инфекции в настоящее время не определена, что, однако, не исключает такой возможности в будущем. Для проведения ПЦР в реальном времени необходимы специальные термоциклеры с прецизионной оптикой, позволяющие мониторировать интенсивность флюоресценции в реакционной смеси. Современные термоциклеры для ПЦР в реальном времени оснащены каналами для детекции флюоресценции в нескольких диапазонах длин волн (до 5 – 6), что позволяет разрабатывать мультиплексные форматы реакции. Тест-системы для детекции C. trachomatis методом ПЦР в реальном времени, а также мультиплексные тест-системы для детекции возбудителей ИППП (включая C. trachomatis) разработаны и выпускаются некоторыми российскими производителями. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям