Учебное пособие Новосибирск 2002 введение
|
|
Скачать 2.06 Mb.
|
RРазличия между аминокислотами касаются как раз боковых групп – R. В зависимости от свойств боковых цепей аминокислоты делятся на гидрофобные, гидрофильные, основные и кислотные. Список аминокислот, участвующих в синтезе белков - лизин, аргинин, гистидин (основные боковые цепи); аспарагиновая и глутаминовая кислота (кислотные боковые цепи); глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин ( гидрофильные боковые цепи). Аминокислоты существуют в виде двух оптических изомеров – D и L, т. е. правовращающих и левовращающих (по отклонению поляризованного света). Однако белки состоят, за небольшим исключением, только из левовращающих аминокислот. Здесь уместно заметить, что сахара, в отличие от белков, состоят из D-изомеров. Этот феномен называется феноменом хиральной чистоты. Механизм его возникновения не ясен. Человек и животные синтезируют аминокислоты (заменимые) из безазотистых продуктов обмена и аммонийного азота. Незаменимые аминокислоты должны поступать в организм с пищей. Для человека 9 аминокислот являются незаменимыми. Это валин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин. Аминокислота тирозин образуется из фенилаланина и при недостатке последнего тоже оказывается незаменимой. Порядок расположения аминокислот в полипептиде называется аминокислотной последовательностью, или первичной структурой белка (рис. 28). Эта структура очень гибкая, поэтому белковая молекула в принципе может принимать бесконечно большое число различных пространственных форм – конформаций. Однако большинство полипептидных цепей существует лишь в одной необходимой для функционирования конформации. Это обусловлено тем, что боковые группы аминокислот взаимодействуют друг с другом и с водой с образованием слабых нековалентных связей.  Рис. 28. Конформационная структура белка. Хотя конформация каждого белка уникальна, несколько способов укладки постоянно присутствует в разных молекулах. Они называются α-спиралями и β- складками. α-Спираль образуется при закручивании полипептидной цепи вокруг оси с образованием жесткого цилиндра, в котором каждая пептидная группа связывается водородными связями с другими такими же группами. Антипараллельный β-слой образуется в результате многократного изгибания полипептидной цепи на 180 так, что пласты располагаются антипараллельно. α-Спирали и β- слои представляют вторичную структуру белка (рис. 28). Некоторые комбинации α-спиралей и β- слоев, упакованные вместе, формируют компактно уложенные глобулярные единицы – домены . Это третичная конформация белка. Если же несколько полипептидных цепей в виде доменов образуют комплекс и функционируют как единое целое, такая конформация называется четвертичной. Белки могут образовывать также супрамолекулярные структуры для выполнения сложных функций. Говоря о белках, невозможно не упомянуть о пептидах. Пептиды – это маленькие структуры, состоящие из небольшого числа аминокислотных остатков, 2- 10, соединенных, как и в белках, пептидной связью. Они могут быть закодированы в определенных генах или получаться при расщеплении белков. Пептиды часто имеют линейную структуру, но могут образовывать и циклы. Пептиды часто выступают в роли эндогенных регуляторов в иммунной и нейроэндокринной системе. Например, пептидами являются эндогенные опиоиды. Открыты они в начале 70-х годов ХХ века, после установления в мозге рецепторов к морфину, наркотическому веществу, которое с древних времен применяли люди, чтобы снять напряжение, уйти от тревожащих их проблем. Оказалось, что в организме синтезируются вещества, взаимодействующие с этими рецепторами. Их назвали опиоидами. Взаимодействуя с рецепторами, эти вещества включают систему награды. Именно опиоидам – эндорфинам и энкефалинам обязаны мы многими приятными ощущениями, которые испытывает человек, достигнув успеха в спорте, бизнесе, в науке, а также при приеме пищи и сексуальном удовлетворении. Чувство радости обусловлено их действием. Пептидами являются многие биологически активные вещества – пептидные антибиотики, гормоны вазопрессин, глюкагон и др. В настоящее время искусственным путем получены природные пептиды и их аналоги, которые используют в качестве лекарственных биопрепаратов. Функции белков: 1. Участие в образовании клеточных структур. 2. Ферментативная активность. 3. Рецепторная функция. 4. Направленное движение. 5. Функция молекулярных насосов. 6. Участие в репликации ДНК в составе реплисомы. 7. Регуляция экспрессии генов. 8. Защитная функция. 9. Сигнальная функция. 10.Преобразование энергии 11.Питательная 12. Энергетическая 13. Буферная и др. 9.2. Фазы трансляции и ее регуляция Синтез белка или трансляция – это одно из главных событий в жизни клетки. Информация в виде чередования дезоксирибонуклеотидов на одной из двух комплементарных цепей гена сначала переписывается на одноцепочечную молекулу информационной РНК – это процесс транскрипции. На следующем этапе по матрице мРНК строится последовательность аминокислотных остатков полипептида, фактически осуществляется перевод (translation) последовательности нуклеотидов в последовательность аминокислотных остатков в белке. Итак, зрелая мРНК выходит в цитоплазму, где она подвергается трансляции. Зная последовательность ее нуклеотидов, можно ли определить последовательность аминокислот в белке? Оказывается, сделать это не просто. мРНК эукариот – сложные структуры. Они включают помимо информации об аминокислотной последовательности кодируемого белка (транслируемая область), достаточно протяженные нетранслируемые области (НТО) на обоих концах молекулы 3’-НТО и 5’-НТО. В этих районах мРНК содержится информация о их поведении в клетке, активности, времени жизни и т. д.(рис. 29).  Рис. 29. Структура информационной РНК Процесс трансляции делится на три фазы: инициации, элонгации и терминации. Наиболее ответственной фазой является фаза инициации трансляции. У эукариот в основном на этом уровне происходит регуляция синтеза белка. Начало трансляции не совпадает с началом мРНК. Известно, что она начинается с первого от 5’-конца метионинового кодона AUG. Это действительно так, однако чтобы кодон AUG стал инициирующим, он должен находиться в соответствующем контексте последовательностей нуклеотидов. Если первый кодон AUG оказался в неподходящем контексте, он пропускается и инициация осуществляется со следующего AUG. Для инициации трансляции большинства мРНК также важно наличие кэп-структуры на 5’-конце мРНК и поли-А на другом ее конце. Указанные структуры узнаются белками, необходимыми для трансляции. Интересно, что контекст может существенно изменить генетический код. Так, аминокислота селеноцистеин, очень важная для функционирования клеток, кодируется одним из терминирующих кодонов UGA в соответствующем контексте.  Животные клетки используют несколько способов регуляции синтеза белка на уровне трансляции. Практически во всех случаях она осуществляется в фазе инициации.Матричная активность разных мРНК может сильно различаться. Очень сильными матрицами являются вирусные РНК, а также клеточные, кодирующие мажорные белки, например, глобины. Матрицы для белков, присутствующих в клетке в небольших количествах, являются слабыми. Сила матрицы определяется на уровне инициации трансляции. На сильных матрицах инициация происходит часто, на них нанизывается много рибосом. На слабых – наоборот. Осуществляют регуляцию специфические белки, которые связываются в 5’-НТО вблизи инициирующего кодона. Изменяя конформацию мРНК, они могут снижать доступность 5’-конца мРНК для белоксинтезирующего аппарата. Регуляторами могут выступать продукты трансляции данной мРНК, т. е. наблюдается ауторегуляция. Примером такой регуляции является синтез ферритина (рис. 30), который в свою очередь зависит от содержания в клетке железа – в присутствии железа он синтезируется, а при отсутствии - трансляция Рис. 30. Регуляция железом трансляции мРНК ферритина и стабильности мРНК рецептора трансферина соответствующей мРНК останавливается на стадии инициации. Оказалось, что это зависит от шпилечной структуры в 5’-НТО мРНК. При отсутствии железа этот регулирующий элемент связывается со специальным белком, препятствующим сканированию 5’-НТО рибосомами. Этот белок имеет сродство к ионам железа и при связывании с ними перестает связываться с ферритиновой мРНК. В результате включается инициация трансляции последней. Вновь синтезированный ферритин отнимает железо у белка- репрессора, который опять связывается с регуляторной областью ферритиновой мРНК. Репрессор – это акотиназа – фермент, цикла Кребса. 3’НТО отвечает за стабильность мРНК, которая варьирует в широких пределах – от десятков минут полужизни до десятков дней. Нестабильность мРНК рецептора трансферина в присутствии железа (рис. 30) определяется шпилечными структурами в 3’ НТО. Регулирующим белком и в этом случае является акотиназа. Однако при этом она стабилизирует мРНК и позволяет ей активно транслироваться. Одним из способов регуляции трансляции является маскирование мРНК, когда соответствующие мРНК становятся недоступными не только для трансляции, но и для других ее превращений, например разрушению нуклеазами. При этом маскирующий белок связывается с 3’НТО, что приводит к глобальной структурной перестройке мРНК. Клетка использует также такой способ регуляции трансляции, как тотальная репрессия, она обусловлена фосфорилированием факторов инициации, таких как IF2, что приводит к выключению инициации трансляции всех мРНК клетки. Причиной этого могут быть тепловой шок, недостаток ростовых факторов, вирусное поражение и др. Таким образом, для эукариот характерна наработка мРНК не по потребности, а впрок. Такие стабильные мРНК не сразу вступают в трансляцию, а только тогда, когда это необходимо. Если необходимость в продукте трансляции отпадает, мРНК может быть инактивирована перечисленными выше путями. ^ Аппаратом трансляции являются несколько сот разных молекул нуклеиновых кислот и белков. Главными участниками этого сложного процесса являются мРНК, тРНК, АРС-азы и рибосомы. Именно благодаря трансляции, существует представление о дискретных единицах генетической информации. Здесь уместно вспомнить о генетическом коде (См. гл.4). Многие свойства генетического кода реализуются молекулами ферментов амино-ацил-тРНК-ситетазами (АРС-азами) и тРНК. Триплетность и неразрывность кодонов мРНК-матрицы обеспечивается антикодоном тРНК, выделенным в петле тРНК специальными модифицированными нуклеотидами. Таким образом, соответствие между триплетом нуклеотидов и аминокислотой устанавливается не во время синтеза белка на рибосоме, а в процессе присоединения аминокислоты к определенной молекуле тРНК. Если к тРНК присоединиться неправильная аминокислота, она включится в состав белка вместо правильной. Это может привести к изменению или потере свойств данной молекулы белка. Поэтому именно дорибосомному этапу в биосинтезе белка уделяется в последние годы наиболее пристальное внимание. ^ тРНК (рис.31) состоят примерно из 70-90 нуклеотидов. Каждая тРНК имеет акцепторный конец, к которому присоединяется аминокислотный остаток, и адаптерный конец, несущий тройку нуклеотидов, комплементарную к определенному кодону мРНК. Поэтому этот триплет называют антикодоном. Акцепторный конец имеет одинаковое строение, состоит из ССА- нуклеотидов. При образовании трехмерной структуры тРНК складывается в типичную L-образную структуру (Рис. 32). Если кодоном на мРНК является UUU, то антикодоном в тРНК, соответствующим кодону, будет AAA, и такая тРНК будет связывать фенилаланин. Известно, что аминокислоты закодированы в генетическом коде 61 кодоном. Можно предполагать, что столько же должно быть и антикодонов, т. е. разновидностей тРНК. В действительности тРНК меньше. Некоторые тРНК своим одним антикодоном узнают несколько кодонов на мРНК. Это достигается за счет механизма неоднозначного соответствия или качания. Это означает, что в отношении взаимодействия кодон-антикодон правило Уотсона-Крика выполняется не полностью. Первый и второй нуклеотиды антикодона строго следуют правилам комплементарности, а взаимодействие с третьим нуклеотидом кодона позволяет некоторую нестрогость при спаривании, неоднозначность спаривания. Благодаря этому свойству, каждое семейство кодонов для одной аминокислоты может обеспечиваться одним антикодоном. Исходя из этого, для считывания всей кодоновой таблицы достаточно всего 31 тРНК. Например, в мРНК кодоны GCC и, значит, GCU кодируют аланин. Антикодон, который спаривается и с тем, и с другим кодоном может быть CGG  Рис. 31. Укладка тРНК в виде клеверного листа. Для всех молекул тРНК характерно присутствие большого числа разнообразных модифицированных нуклеотидов, часто называемых минорными. Во всех видах тРНК число их превышает 60. Среди них много метилированных производных. За счет комплементарных участков цепь тРНК складывается в характерную вторичную структуру. Благодаря спариванию оснований образуется двуспиральный стебель с петлей из неспаренных оснований. Такая структура получила название клеверного листа – четыре стебля и три петли (рис. 31). Стебель с петлей формируют ветвь. Иногда в структуре тРНК присутствует дополнительная, вариабельная, V-ветвь. За счет взаимодействия элементов вторичной структуры образуется третичная структура, называемая L-формой из-за сходства с соответствующей буквой латинского алфавита (рис. 32).  Рис. 32. L-образная структура тРНК. В каждой клетке присутствует более, чем 20 видов индивидуальных тРНК, потому что несколько различных тРНК могут соединяться с одной и той же аминокислотой, такие тРНК называются изоакцепторными. Транспортные РНК обладают двумя главными функциями – акцепторной, т. е. способностью ковалентно связываться с аминокислотным остатком и адапторной, т. е. способностью узнавать триплет и обеспечивать поступление аминокислоты на законное место в растущей полипептидной цепи. Присоединение аминокислоты к тРНК (аминоацилирование) катализируется ферментами аминоацил-тРНК-синтетазами (АРС-азами). В клетке имеется 20 индивидуальных АРС-аз. АРС-азы с высокой степенью специфичности узнают свою тРНК (все изоакцепторные тРНК) и соответствующую ей аминокислоту. Очевидно, для этого у всех изоакцепторных тРНК должны быть некие общие свойства, распознаваемые одним и тем же ферментом. В настоящее время показано, что это определяется нуклеотидами, занимающими одни и те же места в структуре большинства тРНК. Они включают, прежде всего нуклеотиды антикодона, нуклеотид в положении 73, предшествующий ССА-концу, первые три пары нуклеотидов акцепторного стебля. Экспериментальные данные показывают, что одни и те же участки тРНК узнаются АРС-азами из разных организмов. После специфического узнавания тРНК АРС-азой происходит подгонка двух макромолекул в результате изменения их конформации. ^ Следующий этап проходит с участием рибосом и поэтому называется рибосомным. Он катализируется самой рибосомой без участия экзогенных ферментов. Итак, рибосома в процессе биосинтеза белка принимает кодированную генетическую информацию от ДНК в виде мРНК и расшифровывает ее, катализирует образование пептидных связей в реакции транспептидации, передвигает цепь мРНК и молекулы тРНК. Таким образом, рибосома – это сложная белоксинтезирующая частица, обладающая генетической (декодирующей), энзиматической (образование пептидных связей) и механической (передвижение мРНК) функциями. Химически рибосома представляет собой рибонуклеопротеид. Она состоит из комплекса рибосомных РНК и белков. Физически рибосома представляет собой компактную частицу. Функционально – это молекулярная машина, протягивающая вдоль себя цепь мРНК, считывающая закодированную в мРНК генетическую информацию и параллельно, в соответствии с кодом, синтезирующая полипетидную цепь белка из поступающих в нее аминокислотных остатков. Электронно-микроскопическое изображение рибосомы показывает, что она состоит из двух неравных частиц – большой и малой, довольно лабильно ассоциированных друг с другом. Рибосомные РНК концентрируются ближе к центру частиц, а рибосомные белки занимают периферию. Каждая рибосомная частица содержит много белков и все они разные. Основная морфологическая черта электронно-микроскопических изображений рибосомы – это борозда, разделяющая две рибосомные частицы. В одном месте она расширяется, образуя так называемый “глаз”. В этой полости размещаются основной субстрат рибосомы – тРНК. Теперь рассмотрим отдельно малую субъединицу рибосомы. Она разделяется глубокой бороздой на головку и тело. В ней размещается участок связывания мРНК и через нее цепь мРНК протягивается от одного конца к другому в процессе трансляции. В большой субъединице рибосомы тоже есть борозда, разделяющая головку и тело. В ней располагается главный каталитический центр рибосомы, осуществляющий синтез полипептидных цепей. Трансляция состоит из трех стадий : инициации, элонгации и терминации (рис. 33). Самым ответственным этапом является инициация. Для осуществления ее в клетке имеются специальные механизмы. Трансляция начинается с того, что мРНК связывается с рибосомной частицей. При этом рибосомная частица (у прокариот прямо и непосредственно, а у эукариот после некоторого скольжения вдоль некодирующей части мРНК) специфически взаимодействует с началом кодирующей нуклеотидной последовательности мРНК, с кодоном AUG. Вслед за инициацией рибосома последовательно триплет за триплетом считывает цепочку мРНК, по направлению к 3’-концу, наращивая цепочку полипептида. Этот этап называется элонгацией. Достигнув стоп-кодона, рибосома освобождает синтезированную цепь – это терминация трансляции.  Рис. 33. Трансляция у про- и эукариот. Необходима абсолютно точная инициация, так как правильная трансляция зависит от правильной рамки считывания. Если произойдет сдвиг рамки считывания, то образовавшиеся стоп-кодоны прекратят синтез еще до образования полноразмерного пептида. Дефектный пептид быстро деградирует. Характерной особенностью инициации трансляции является то, что на этом этапе участвуют не целые рибосомы, а только их отдельные субъениницы (рис. 34). Поэтому, чтобы началась трансляция, рибосома должна диссоциировать на две ее составляющие части. Именно малая единица рибосомы, и только она, связывается с мРНК и удерживает ее. При этом в связывании с мРНК вовлечен участок в 30 нуклеотидов, но в каждый момент только две тРНК могут разместиться в рибосоме. Большая единица рибосомы с мРНК никак не взаимодействует. Все начинается со связывания инициаторной метиониновой тРНК в Р-участке рибосомы с кодоном AUG (рис. 34). Этот же кодон кодирует метионины, находящиеся повсюду в молекуле белка. Оказывается, существуют две разные тРНК для метионина. Одна для инициации, а другая – для добавления метионина в процессе элонгации. Инициаторная тРНК имеет структурные особенности, которые распознаются белковым фактором инициации IF2. Последний и доставляет ее к инициаторному комплексу. Элонгаторная метиониновая тРНК распознается другим белковым фактором, который также доставляет ее к рибосоме. На рибосоме имеются два участка связывания с тРНК. А-участок, акцепторный, т. е. участок, который может быть занят очередной вновь поступающей аминоацил-тРНК. До того, как в А-участок придет аминоацил-тРНК, в этот участок входит триплет (кодон), кодирующий аминокислоту, которая должна быть включена в пептид.Другой участок Р-участок - пептидил-тРНК-связывающий, или донорный (рис. 35). Механизм элонгации заключается в следующем. Инициаторная тРНК поступает в Р-участок. Затем в А-участок малой субъединицы рибосомы поступает тРНК, нагруженная той аминокислотой, которая кодируется следующим за инициаторным кодоном. Получается, что два аминокислотных остатка, каждый из которых присоединен к соответствующей тРНК, находятся вблизи рибосомной пептидилтрансферазы. В таком состоянии происходит реакция транспептидации, т. е. переход метионина из Р-участка рибосомы на свободную аминогруппу аминокислоты в А-участке. В Р-участке тРНК остается ненагруженной аминокислотой, поэтому она высвобождается. Далее тРНК движется из участка А в Р, таща за собой связанный    Рис. 34. Инициация трансляции. с ней триплет мРНК. Так цепь мРНК протаскивается относительно рибосомы ровно на один триплет. В этом процессе участвует фактор EF-G (транслоказа) и теперь в А-участке устанавливается смежный с предыдущим триплет нуклеотидов, то есть следующий кодон.  Рис. 35. Элонгация трансляции. Все готово для следующего раунда элонгации. Далее аналогичным способом аминоацил-тРНК, соответствующая вновь установленному в А-участке кодону, связывается с ним.Полипептидная цепь удлиняется на одну аминокислоту, на ту, которая принесена тРНК в А-участок. Сама тРНК, принесшая эту аминокислоту, так и остается с ней связанной, а следовательно связанной и с удлиненным полипептидом. За образование пептидных связей отвечает большая единица рибосомы. В элонгации участвует много белковых факторов – EF-Tu, EF-G и другие. Все они обладают ГТФ-азной активностью. Итак, мы видим, что на всех этапах синтеза белка работают механизмы, отвечающие за точность этого процесса. Хотя следует заметить, что ошибка в биосинтезе белка не имеет серьезных последствий, так как образуется множество молекул белков. Другими словами, эти ошибки не имеют таких далеко идущих последствий, как ошибки при репликации ДНК. ^ � Образование полипептидной цепи – это только первый шаг в процессе формирования белка. Для образования функционально активного белка полипептидные цепи претерпевают ряд изменений. Для функционирования ряда белков необходимо объединение нескольких полипептидных цепей. Так, гемоглобин образуется при объединении двух α- и двух β-цепей, а также после связывания с ними гемогруппы. Некоторые белки подвергаются гидроксилированию, фосфорилированию или дефосфорилированию. Многие белки синтезируются в виде крупных предшественников, а потом активируются путем отщепления частей полипептидных цепей. Например, сначала образуется проинсулин, затем он расщепляется с удаление N-концевого и внутреннего фрагмента цепи. Во-первых, за счет взаимодействия аминокислотных остатков полипептиды автоматически сворачиваются, образуя вторичную и третичную структуры (См. рис. 28). Существовало представление, что поскольку структуру белка определяет лишь последовательность нуклеотидов в гене, сворачивание полипептидной цепи зависит и определяется только последовательностью аминокислот. Для этого утверждения были экспериментальные подтверждения. Так, Анфинцен показал, что если РНК-азу денатурировать, а потом удалить из раствора денатурирующие агенты, фермент вновь восстанавливал свою нативную структуру и проявлял каталитическую активность. В дальнейшем было выяснено, что не для всех белков это так. Оказалось, что для большинства белков процесс их сворачивания является энергозависимым и ни в коем случае не спонтанным. Он имеет иерархическую природу. Сначала за доли секунды формируются элементы вторичной структуры. Затем также за доли секунды происходит специфическая ассоциация некоторых элементов вторичной структуры с образованием супервторичной структуры – это сочетания нескольких -спиралей, нескольких -пластов или смешанные ассоциаты этих элементов. Далее образуется третичная структура, в основном за счет гидрофобных взаимодействий. А ведь многие белки составлены из нескольких полипептидных цепей, значит должны установиться дополнительные контакты между доменами этих цепей. Действительно, в цепи аминокислот имеются практически безграничные возможности ассоциации аминокислотных остатков друг с другом. Если полипептид будет “пробовать” все мыслимые варианты такой ассоциации, пока не достигнет формы нативного белка, ему понадобится несколько миллионов лет. В клетке же это происходит в считанные минуты. В середине 80-х годов было обнаружено, что в клетке существует особая категория белков, основной функцией которых является обеспечение правильного характера сворачивания полипептидных цепей в нативную структуру. Эти белки названы молекулярными шаперонами. Они не дают полипептиду образовывать нежелательные связи. Это и отражено в их названии ( французское слово chaperone означает гувернантка). Это целое семейство белков со сходной функцией. Есть еще белки – шаперонины – более сложно устроенные, представляющие собой сложные ологимерные структуры. Несколько олигомеров образуют цилиндр с полостью в центре – каналом, в котором и происходит процесс сворачивания белка. Для проникновения белков через мембрану митохондрий и хлоропластов необходимо их развернуть, это тоже делают шапероны. Известно, что синтез шаперонов индуцируется под влиянием теплового шока, стресса, радиации, ултрафиолетового излучения. Поэтому шапероны называют белками теплового шока или белками стресса. По этому их проявлению впервые и были открыты белки теплового шока. Открытие сделано работами Риттозы на политенных хромосомах слюнных желез личинок дрозофилы. При повышении температуры до 370 С (а оптимум для дрозофилы 20С) образовывались пуфы там, где их не было раньше. Идентифицированы эти белки в 1974 году. После денатурации в результате этих воздействий конформацию белков восстанавливают шапероны. Шапероны метят белки, которые должны быть деградированы в лизосомах. Известен среди них убиквитин, осуществляющий эту функцию, его называют меткой смерти. Шапероны участвуют также в сборке крупных белковых комплексов, работающих как молекулярные машины. Помимо шаперонов и шаперонинов, в сворачивании (фолдинге) белка принимают участие и другие белки-ферменты. К ферментам, участвующим в фолдинге, относится протеиндисульфид-изомераза, перемещающая дисульфидные связи в полипептидной цепи, разрывая недопустимые и создавая новые S-S связи между остатками цистеина. Другой фермент из этой группы – пептидил-пролин-изомераза катализирует изомеризацию пептидных связей пролина. Белки синтезируются в цитоплазме клеток, а также в митохондриях и хлоропластах. Они при этом имеют разные пункты назначения. Какие-то из них остаются в цитоплазме, другие встраиваются в клеточную мембрану, третьи проникают в лизосомы и пероксисомы, четвертые идут в ядро, митохондрии, хлоропласты и т.д.  Рис. 36. Перенос полипептида в цистерны ЭПР В эукариотических клетках для обеспечения транспорта белков имеется сложный аппарат. Белки, предназначенные для некоторых органелл и цитозоля (водной фракции цитоплазмы) синтезируются на свободных рибосомах, а белки, остающиеся в лизосомах, аппарате Гольджи и в мембранах, синтезируются на рибосомах, ассоциированных с эндоплазматическим ретикулумом (ЭПР). ЭПР – это сложная сеть мембран, ограничивающая огромное количество сплющенных полостей. ЭПР с прикрепленными к нему рибосомами называется шероховатым, не связанный с рибосомами – гладким. Белки, предназначенные для экспорта к одной из клеточных мембран или внутриклеточным органеллам, имеют так называемую сигнальную последовательность, которая прокладывает белку путь в просвет ЭПР (рис. 36). Сначала сигнальный полипептид связывается с рибонуклеопротеидной сигнальной распознающей частицей (СРЧ). СРЧ в свою очередь связывается с рецептором на мембране ЭПР. Таким образом рибосома прикрепляется к ЭПР. Синтезирующийся полипептид постепенно втягивается в просвет ЭПР через белковую пору. В просвете ЭПР сигнальный пептид отщепляется эндопептидазами. В просвете ЭПР происходит существенная модификация белков, а именно гликозилирование, т. е. присоединение углеводных остатков к NH2 – группе аспарагина. Далее белки окружаются мембраной, образуя везикулу и отпочковываются от ЭПР. Везикулы доставляют белок в аппарат Гольджи путем слияния его с мембраной (рис. 37). Аппарат Гольджи является удивительной органеллой эукариотической клетки. Структура его проста – это ряд замкнутых мешочков, ограниченных мембранами, но у него очень важная функция. Аппарат Гольджи сортирует белки, упаковывает их в везикулы и доставляет, куда нужно, по точно указанным адресам. Предназначенные для экскреции белки в составе пузырьков мигрируют к плазматической мембране. Далее посредством экзоцитоза, они освобождаются из клетки. Например, таким образом происходит секреция ферментов из клеток поджелудочной железы (рис. 37). Для белков, направляемых в лизосомы, адресом является их углеводная часть. Лизосомы – это небольшие окруженные мембраной внутриклеточные органеллы, содержащие высокоактивные гидролитические ферменты. Эти ферменты узнаются в аппарате Гольджи, происходит их фосфорилирование, после чего они отпочковываются от аппарата Гольджи в виде лизосом. При нарушении фосфорилирования не происходит поступление ферментов в лизосомы и развивается тяжелейшее наследственное заболевание – синдром Гоше.  Рис. 37. Путь полипептидов через аппарат Гольджи. В ЭПР образуются также мембранные липиды и новые мембраны. Интегральные белки мембран идут тем же путем, но за счет гидрофобных аминокислот заякориваются в мембране. Время существования белков в клетке сильно варьирует. Некоторые белки имеют период полужизни более 20 часов (белки печени – несколько дней), а другие 10 или даже 2 минуты. Структурные белки и гемоглобин являются долгожителями. Быстро деградируют белки, содержащие неправильные аминокислоты, что обусловливает их неправильный фолдинг. Белки, пострадавшие от химических воздействий, например, окисления, также должны быть уничтожены. В деградации долгоживущих белков участвуют лизосомы. ^ Изменение фолдинга белка, который называют прионом, лежит в основе развития вялотекущих заразных губчатых энцефалопатий. Эти заболевания объединяют термином прионовые. Ген прионового белка очень консервативен и имеется у всех млекопитающих. У человека он кодируется в коротком плече 20-й хромосомы. Формы нормального и прионового белка кодируются одним и тем же геном и имеют одинаковую последовательность аминокислот. А вот их трехмерная форма существенно различается. Несмотря на то, что исследования агента, вызывающего эти заболевания, отмечены уже двумя Нобелевскими премиями, окончательной ясности в этой проблеме до сих пор нет. Бесспорно одно: заболевание поражает и людей, и животных, и люди могут заразиться от животных, а также через хирургические инструменты, биопрепараты и т. п. Так что это еще одна экологическая угроза человечеству. Одна из этих болезней – скрепи овец, известна еще с XVIII века. У больных животных вначале наблюдается расстройство координации движений, затем наступают параличи и смерть. В 1947 г. на одной из звероводческих ферм США была обнаружена энцефалопатия норок, которая возникла после скармливания им субпродуктов от овец, больных скрепи. Когда эта причинная связь была установлена и приняты соответствующие меры, заболевание прекратилось. У человека сходную картину заболевания наблюдал и изучал сначала Якоб в 1921 г. (болезнь Кройцфельда – Якоба), а затем Даниель Карлтон Гайдушек в середине 50-х гг. в племени форе Новой Гвинеи (болезнь куру). Оба заболевания характеризовались различными неврологическими симптомами и слабоумием. Гайдушек установил, что распространение куру связано с ритуальным каннибализмом в этом племени. Гайдушек заразил обезьян экстрактами мозга людей, умерших от куру. У последних через 2 года появились первые симптомы заболевания. В 1971 г. подобным образом осуществили передачу болезни Кройцфельда – Якоба от человека животным. К прионовым заболеваниям человека относсится также синдром Герстманна-Шейнкера и фатальная семейная бессонница. В 1976 г. Гайдушек был удостоен Нобелевской премии за расшифровку механизмов губчатых энцефалопатий, хотя на самом деле до открытия механизмов было еще далеко. Предполагалось, что этиологическим фактором болезни являются медленные вирусы, которые, однако, не были выделены. Не выделены они и до сих пор.  В 1974 г. Стенли Прузинеру с сотрудниками удалось получить достаточное количество очищенного агента скрепи. Исследование его свойств показало, что агент исключительно белковой природы, устойчив к ультрафиолетовому и ионизирующему излучению, нагреванию, обработке ферментами. Прузинер выдвинул гипотезу “только белок” (protein only), говорящую о том, что инфекционным агентом скрепи и других губчатых энцефалопатий является белок, с молекулярной массой 27-30 кД, имеющий 3-х-мерную форму, отличную от аналогичного нормального белка. Прузинер назвал этот белок прионом, а соответствующие заболевания – прионовыми. Показано, что в нормальном прионовом белке больше Рис. 38. Конформация нормального -спиралей, а в патологическом больше - пластов (рис.и прионового белка 38). По гипотезе Прузинера аномальная конформация белка приона может передаваться молекулам нормального белка. Возникает вопрос, каким образом неправильно свернутый белок может стать инфекционным и воспроизводить самого себя? Ни один из рассмотренных нами механизмов образования белка не позволяет белковой молекуле управлять своей собственной репликацией. Как бы то ни было, поведение этого белка противоречит догме классической генетики. И хотя за исследование прионов Прузинер в 1997 г. награжден Нобелевской премией, многое в этой проблеме остается неясным. Возможно, что процесс ”прионизации” обусловлен тем, что шапероны по каким-то причинам не помогают складываться этому белку в правильную третичную структуру. У дрожжей обнаружены белки – аналоги прионов человека. Они также состоят преимущественно из -пластов и тоже склонны к олигомеризации. Олигомеризованные формы белка проявляют повышенную протеазоустойчивость. Еще один прион обнаружен у гриба Podospora anserina. Постепенно накапливающиеся в этой области данные грозят крушением некоторых привычных представлений о реализации генетической информации. По крайней мере, уже сейчас ясно, что одной первичной структуре белка может соответствовать не одна нативная конформационная структура белка и не один уровень ферментативной активности. Возможно, это до сих пор неизвестный уровень эпигенетического контроля трансляции белков и, что самое интригующее, наследование модификаций на уровне конформации белка. Значит, наследственные изменения не сводятся только к мутациям. Нормальный белок приона экспрессируется в клетках мозга, особенно в синапсах. В легких, селезенке и мышцах содержание этого белка в 10-15 раз меньше, чем в нервной ткани. До сих пор роль этого белка неизвестна. Интересно, что нокаутированные по гену приона мыши, не экспрессирующие этот белок вообще, нормально существуют. Когда прион становится патогенным, он накапливается в мозге в больших количествах в виде волокон или палочек, образующих амилоидные бляшки. Ген прионового белка находится у человека в 20-й хромосоме. В настоящее время он клонирован и изучена его структура. Ген оказался консервативным у млекопитающих. Описаны мутации в гене приона, которые обусловливают наследственные формы болезни Кройцфельда – Якоба и семейную фатальную бессонницу. Одни мутации представлены точковыми аминокислотными заменами в полипептидной цепи белка, другие - увеличением числа повторов в N-концевой части белка. Есть данные, что эти повторы существенны для превращения белка в патологическую конформацию. Изучение патогенеза прионовых заболеваний показало, что для переноса инфекции от одного животного к другому необходима нормальная экспрессия нормального гена приона. Нокаутированных мышей, у которых ген приона отсутствует, заразить инфекционным прионом не удается. Выяснено также, что повышенная экспрессия нормального гена приона также приводит к развитию заболевания губчатой энцефалопатией. Это как будто подтверждает предположение, что возможна спонтанная перестройка нормального прионового белка в патологический. С экологической точки зрения интерес представляет возможность межвидового переноса прионовых агентов. Особенно актуальна эта проблема в связи с опасностью заражения человека от больных животных. Попытки заражения мышей хомячковым и коровьим прионом сначала дали отрицательные результаты, однако впоследствии мыши все же заболели. Просто в этих случаях латентный период был гораздо больше, чем при заражении мышей мышиным прионом. А теперь вспомним эпидемию коровьего бешенства в Англии, которая началась в середине 80-х годов после того, как были изменены условия приготовления пищевых добавок к корму крупного рогатого скота из органов овец, больных скрепи. В 1996–1997 гг. эпидемия достигла небывалых размеров, пришлось уничтожить 130 тыс. больных коров. Ущерб составил 300 млн. фунтов стерлингов. Есть предположение, что 900 тысяч коров, находящихся в инкубационном периоде энцефалопатии, были съедены в основном в Англии. Английские ученые предсказывают в связи с этим проявление прионовой патологии у 70-80 тысяч англичан. То, что болезнь Кройцфельда – Якоба можно передать от человека обезьяне, доказал в своих исследованиях еще Гайдушек. До него это заболевание заразным не считалось. В процессе развития эпидемии коровьего бешенства в Англии появилась новая нетипичная форма болезни Кройцфельда – Якоба. Появление ее связывают с заражением людей через мясо больных коров. Белок прион этих больных очень похож на коровий и отличается от типичных прионов, характерных для ранее встречавшейся болезни Кройцфельда – Якоба. Прионовый агент настолько устойчивый, что никакая термическая обработка мяса его не инактивирует. Человек может заразиться и от больного человека( при лечении препаратами гормонов из гипофизов трупов, а также при пересадке твердой оболочки мозга, либо при введении биопрепаратов). Какова роль в развитии описываемых заболеваний иммунной системы? Распознает ли она прионовый агент? Развиваются ли при попадании приона в организм эффекторные реакции иммунитета и какие? Все эти вопросы волнуют исследователей с самого начала открытия прионов. Показано, что специфическая иммунологическая реакция, направленная на элиминацию прионовых агентов, не развивается. Само по себе это представляется странным: изменилась первичная структура белка и его конформация, что однако совершенно не замечается иммунной системой. Тем не менее, иммунная система не остается безучастной к ним. При любом способе заражения инфекционный агент не сразу попадает в мозг. Показано, что он длительно может персистировать в лимфоузлах, миндалинах, пейеровых бляшках и селезенке. Спленэктомия, произведенная до или в короткое время после заражения мышей прионами, значительно удлиняла латентный период заболевания. Тимэктомия подобного эффекта не вызывала. Если же инфекция уже локализовалась в нервной системе, спленэктомия ничего не изменяла. У мышей с тяжелым комбинированным дефицитом, у которых наряду со зрелыми Т- и В-лимфоцитами, отсутствуют и дендритные клетки, вызвать инфекцию прионами не удается. Все это доказывает важность периферического периода в течение прионового заболевания. Кроме того, что очень важно, эти данные фокусируют внимание исследователей на существовании реальной опасности горизонтального переноса прионовых заболеваний путем гемотрансфузии, трансплантации органов и тканей, а также через хирургические инструменты. Интересно, что разного рода воздействия, стимулирующие иммунную систему, повышают чувствительность мышей к заражению агентом скрэпи, а иммунодепрессанты, наоборот, уменьшают эту чувствительность. В патогенезе прионовых заболеваний остается много неясного. Не все ученые разделяют точку зрения, что прионовый белок является непосредственным этиологическим фактором указанных заболеваний. Они предполагают, что причина не выяснена и что прион – это лишь свидетель неизвестного инфекционного агента. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям