Учебное пособие Новосибирск 2002 введение
|
|
Скачать 2.06 Mb.
|
|
^ � Функции и морфология разных клеток одного организма порой так сильно отличаются, что трудно представить, что они обладают одним и тем же геномом. Тем не менее это так. Дифференцировка клеток, в результате которой они становятся мало похожими друг на друга внешне и выполняют разные функции, определяется изменением экспрессии генов, не сопровождающимися, как правило, изменениями в последовательности ДНК. В результате в клетках разных типов или на разных стадиях развития клеток одного типа синтезируются разные наборы белков. Некоторые исключения из этого правила касаются работы генов, кодирующих иммуноглобулины, мембранные формы которых являются антигенраспознающими рецепторами В-лимфоцитов, и Т-клеточные антигенраспознающие рецепторы. Механизмы регуляции генов стабильны и передаются по наследству от клетки к клетке. Это подтверждается экспериментами in vitro - при выращивании вне организма на культуральной среде определенного типа клетки сохраняют свои уникальные свойства. Регуляция генной активности сложна и многогранна из-за необычайного разнообразия участвующих в ней процессов и проходит на всех уровнях реализации генетической информации от ДНК к РНК и белку, т.е. на уровне репликации, транскрипции, трансляции и посттрансляционной модификации белков. Для большинства генов наиболее важным является контроль на уровне транскрипции. Он осуществляется специальными белками, специфически связывающимися с ДНК в области промотора гена. Результатом этого связывания может быть как активация работы гена, так и подавление ее. Разные типы клеток обладают разным набором таких регуляторов и, следовательно, разными наборами активированных генов. Гены высших эукариот обычно регулируются путем комбинированного воздействия нескольких белков - факторов транскрипции. В отличие от прокариот, у которых фермент РНК-полимераза узнает сайт инициации транскрипции непосредственно, у эукариот транскрипция представляет собой гораздо более сложный процесс. В ней принимают участие три РНК-полимеразы – I,II,III, эволюционно родственные ферменту бактерий, но содержащие большее число субъединиц. Эукариотическая РНК-полимераза узнает комплекс ДНК со специфическим фактором транскрипции. Фактор связывается с последовательностью ТАТА, расположенной на участке 25-30 п.н. от сайта инициации транскрипции. Оказалось, что для эффективной транскрипции необходимо взаимодействие факторов транскрипции с сайтами ДНК, находящимися на большом отдалении от промотора, на десятки тысяч п.н. Одни из них – энхансеры, т. е. усилители. Соединение с ними факторов транскрипции усиливает транскрипцию. Противоположным эффектом обладают сайленсеры, т. е. сайты ДНК, которые, взаимодействуя с факторами транскрипции, ингибируют ее. Эффект энхансеров и сайленсеров, находящихся в большом отдалении от промотора, возможен благодаря гибкости ДНК, что позволяет присоединившимся к ним белкам влиять на РНК-полимеразу. Включение и выключение гена обусловлено взаимодействием с сайтами ДНК, с РНК-полимеразой и друг с другом многих факторов транскрипции. Для каждого типа клеток набор факторов транскрипции является уникальным. Рассмотрим способ регуляции активности генов путем возникновения перестроек генетического аппарата, возникающих в онтогенезе. Такие перестройки распространены у одноклеточных организмов и в соматических клетках многоклеточных. Многие из них происходят случайно, другие запрограммированы и приурочены к определенным стадиям дифференцировки клеток и связаны с этими стадиями. Перестройки генетического материала обусловлены гомологической и негомологической рекомбинациями, т.е. перераспределением генетического материала (ДНК), приводящими к возникновению новых комбинаций генов. В отличие от репликации и репарации, обеспечивающих воспроизведение и сохранение генетического материала, рекомбинация приводит к генетической изменчивости. Гомологическая рекомбинация приводит к обмену гомологичными участками хромосом. Биологическое значение гомологической рекомбинации велико. Она вносит вклад в генетическую изменчивость, позволяющую организмам приспосабливаться к среде обитания. Негомологическая рекомбинация – это процесс, использующий очень ограниченную гомологию между рекомбинирующими участками, либо вообще обходящийся без нее. К последней относятся сайт-специфическая рекомбинация, транспозиции и незаконная рекомбинация. К сайт-специфической рекомбинации относятся перестройки в последовательностях ДНК, кодирующих иммуноглобулины и рецепторы Т-лимфоцитов. Транспозиции – это перемещение подвижных генетических элементов – транспозонов. Незаконная рекомбинация происходит без гомологии между участками ДНК, а также без сайт-специфической рекомбинации и транспозиции. Примерами незаконной рекомбинации являются захват ретровирусами участка ДНК и перенос в другое место, в другой организм, а также интеграция ДНК, вводимой в клетку инъекцией. Примерами сайт-специфической перестройки является инверсия сегмента Н в хромосоме S.typhimurium, ответственного за смену жгутиковых антигенов. Это обеспечивает выживание бактерий в условиях иммунного ответа хозяина. За счет смены антигена они избегают развившихся эффекторных реакции иммунитета и обеспечивают новую волну инфекции. Хозяин включается в борьбу с новыми антигенами. Так продолжается гонка между паразитом и хозяином. До окончательной победы…. Еще один механизм регуляции активности генов путем перестроек – это диминуция хроматина. Она описана у нематод еще в 1887 году классиком клеточной биологии Т. Бовери. Диминуция заключается в фрагментации и элиминации значительной части генома. При диминуции может удаляться до 85% хроматина. Это оригинальный метод выключения генов – его удаление. В противоположность этому, запрограммированная амплификация (увеличение числа его копий) генов – механизм усиления функционирования генов. Амплификация генов описана в генах рибосомных РНК и гистонов в ооцитах многих организмов. Самый яркий пример запрограммированной перестройки генов – это формирование генов путем перестройки генных сегментов для образования зрелых генов, кодирующих иммуноглобулины (рецепторы В-лимфоцитов) и рецепторы Т-лимфоцитов. Эти процессы являются тканеспецифическими, т. е. происходят только при дифференцировке В- и Т-лимфоцитов. Каждый этап перестройки, а их несколько, приурочен к строго определенной стадии дифференцировки. Этот механизм обеспечивает беспрецедентное разнообразие генов иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов при использовании относительно небольшого числа зародышевых генных сегментов. Подробнее этот механизм описан в главе….. Суммируем основные механизмы регуляции работы генов, ради которых происходят перестройки: подстановка кодирующей рамки гена под промотор состыковка разобщенных частей гена удаление гена из генома амплификация гена Необходимо отметить, что из этих механизмов вытекает одно важное обстоятельство – а именно, что в разных клетках организма, возникших из одной оплодотворенной яйцеклетки, могут быть различия в структуре генетического материала. В 70-х годах 20 века в области молекулярной биологии было сделано удивительное открытие. Оказалось, что в ДНК есть фрагменты, которые могут перемещаться как в пределах одной хромосомы, так и между хромосомами. Они были названы мобильными элементами, или транспозонами. Размеры транспозонов сопоставимы с размерами генов, локализация которых в геноме стабильна, т.е. они включают от тысячи до десятков тысяч пар нуклеотидов. Перемещения транспозонов – транспозиции осуществляются с помощью белков-ферментов. Они производят либо вырезание транспозона из одного места и встраивание его в другое, либо образуют сначала копию транспозона и ее внедряют в новое место, при этом родительская копия остается на прежнем месте. В последнем случае наблюдается размножение транспозонов в геноме. Открытие транспозонов опровергло существовавшую в молекулярной биологии догму относительно неизменности последовательности нуклеотидов ДНК по длине хромосомы. Оказалось, что последовательность их может изменяться, благодаря перемещению фрагментов ДНК. Встраиваясь в окрестности гена, транспозоны могут вызывать мутации, называемые инсерционными (insertio – вставка). Так, например, у плодовой мухи дрозофилы подавляющая часть спонтанных мутаций (до 80%) обусловлена внедрением транспозонов. Подвижные элементы часто называют по их способности перемещаться – Магеллан, Бигль, hobo – бродяга, gypsy – цыган и др. Авророй остроумно назван транспозон, подвижный в прошлом и заякоренный в настоящее время. Транспозоны вездесущи. Они обнаружены у прокариот и эукариот, у растений и животных. Транспозоны эукариот представлены несколькими семействами. Обычно они рассеяны по геному, составляя 10-40% генома, но иногда могут концентрироваться в некоторых участках. У бактерий транспозоны могут содержать гены устойчивости к антибиотикам.  Рис. 39. Структура транспозонов, механизм перемещения и их участие в репарации. Перемещения транспозонов – достаточно редкие явления. Например, у бактерий – один акт перемещения на 10000 – 1000000 клеток. Однако при определенных внешних воздействиях ( стрессе, вызванном изменением температуры, облучением) частота перемещений может сильно возрастать, так что составит частоту – 1 акт на 10- 100 особей за поколение. В зависимости от молекулярных механизмов, обеспечивающих перемещение, транспозоны разделяются на собственно транспозоны и ретротранспозоны. Транспозоны (рис. 39) обязательно включают ген, кодирующий транспозазу и ограничивающие его инвертированные повторы. Инвертированные повторы сближаются и точно вырезаются из ДНК вместе с геном транспозазы. Транспозаза делает разрыв в ДНК-мишени и вносит вырезанный фрагмент ДНК. Брешь в ДНК после вырезания транспозона застраивается транспозазой с участием гомологичного участка сестринской хромосомы, только что реплицированной. Другой класс подвижных элементов – ретротранспозоны. Механизм их перемещения связан с работой обратной транскриптазы, фермента, открытого Г. Теминым и Д. Балтимором в 1970 году. Обратная транскриптаза была обнаружена при изучении ретровирусов, содержащих РНК, которая служит матрицей для синтеза ДНК. При этом обратная транскриптаза осуществляет и синтез второй цепи ДНК, а РНК-матрица удаляется и распадается. Вновь синтезированная ДНК перемещается в ядро и может встроиться в хозяйскую хромосому, образуя провирус. Провирус стабильно наследуется в ряду поколений клетки, как обычный ген. В геноме млекопитающих в большом количестве содержатся эндогенные провирусы, которые безвредны. Провирус ограничен длинными концевыми повторами (long terminal repeаts - LTR). Они необходимы для его репликации и транскрипции. Один из них является промотором, с которым взаимодействует РНК-полимераза. Синтезированная РНК в дальнейшем транслируется с образованием белков, необходимых для формирования вирусных частиц, а также белков, необходимых для синтеза ДНК провируса и его внедрения в геном. Образовавшиеся вирусные частицы могут из клетки выйти и заразить другие клетки. Транспозаза, в отличие от ДНК-полимеразы, работает с ошибками. Может случиться, что в состав будущего провируса попадет материал других клеточных генов, например, управляющих пролиферацией. Это может обусловить злокачественное перерождение клеток. Структуру провирусов фактически повторяют ретротранспозоны. Отличие лишь в том, что ретротранспозоны не имеют генов, кодирующих белки вирусной оболочки и, следовательно, они не инфекционны, так как не могут выйти из клетки и заразить другие клетки. Остается открытым вопрос, произошли ли ретровирусы от ретротранспозонов, или, наоборот, ретротранспозоны возникли из вирусов, утратив способность к заражению. Отношение к подвижным элементам ДНК как к эгоистической ДНК, которая паразитирует в ДНК хозяина и занимается только своим размножением, в последние годы изменилось. В главе 4 расмотрена проблема недорепликации ДНК и достраивания концов хромосом с помощью теломеразы. Оказалось, что иногда укороченные концы хромосом восстанавливаются за счет транспозонов. Например, у дрозофилы отсутствует теломеразный механизм, а утраченные концы хромосом восстанавливаются за счет ретротранспозонов. В этом случае они выступают как спасатели хромосом. Подвижные элементы иногда используются клеткой для залечивания двунитевых разрывов ДНК. Заплатка в виде транспозона позволяет хромосоме не утратить оторванный от центромеры фрагмент. Конечно, при этом исходная последовательность нуклеотидов не будет восстановлена. Однако если этот район ДНК не содержит генов, то клетка полностью сохранит жизнеспособность. Помимо этих важнейших функций, транспозоны могут участвовать в регуляции экспрессии генов. Внедряясь в ген, транспозон может разорвать экзон; в этом случае ген лишиться возможности кодировать белок. Внедряясь в район промотора, сайты энхансеров или сайленсеров, он может нарушить регуляторную область гена. Только попадание в интрон может быть безвредным, если вся последовательность интрона вместе с транспозоном будет вырезаться при процессинге РНК. При рассмотрении роли транспозонов в регуляции экспрессии генов не стоит забывать, что они имеют собственные промоторы и сайты терминации транскрипции, а также экзоны, интроны и сигналы, обеспечивающие сплайсинг. Внесение с транспозоном нормального регулирующего сигнала может привести к усилению транскрипции гена. Если этим геном окажется протоонкоген, может начаться сверхпродукция соответствующего белка, ведущая к злокачественной трансформации клетки. Есть данные, что в эволюции генома регулирующие сайты подвижных элементов превращаются в энхансеры клеточных генов. Так, белок-рецептор ретиноевой кислоты узнает регуляторную последовательность гена, которая была приобретена в результате внедрения подвижного элемента. Ретротранспозон может привести к экспрессии гена в ткани, где он обычно молчит. Подвижные элементы могут принимать участие в хромосомных перестройках. Процесс рекомбинации в присутствии подвижных элементов может изменить свой характер. Так, в результате неравного кроссинговера, проходящего по встройке подвижного элемента, может образоваться делеция или дупликация генов. Еще один способ регуляции активности генов заключается в метилировании ДНК. Более 50 лет тому назад в ДНК было обнаружено азотистое основание – 5-метилцитозин. Сначала предположили, что оно, подобно четырем основным основаниям, в составе нуклеотидов включается в ДНК при ее репликации. Однако вскоре выяснилось, что цитозин метилируется уже после начала репликации специальным ферментом – ДНК-метилтрансферазой. В ДНК позвоночных метилируется цитозин в положении ЦГ, т. е. когда за ним следует гуанин. Метилирование ДНК, открытое еще до открытия двойной спирали ДНК, остается до сих пор наиболее старой из нерешенных проблем. Трудно назвать генетические процессы, в которых не участвует метилирование ДНК – оно влияет на экспрессию генов, репликацию и репарацию ДНК, активацию хромосом , разрывы, обмены, образование Z-формы и другие процессы. Подобная полифункциональность не знает аналогии в клетке. В то же время, если метилирование так важно, то почему оно совсем отсутствует у дрозофилы, дрожжей и нематоды C. elegans?. Нормальное развитие млекопитающих невозможно без метилирования, Если нокаутировать ген метилтрансферазы, осуществляющей метилирование, развитие эмбриона останавливается на ранних стадиях. В то же время метилирование представляет опасность, так как метилцитозин может дезаминироваться и превращаться в тимин. Таким образом, при репликации ДНК вместо пары ГЦ будет AT. Известно, что такие мутации вызывают заболевания – фенилкетонурию, тяжелый комбинированный иммунодефицит, гемофилию и др. Примерно у половины больных гемофилией мутации не наследуются от родителей, а возникают заново в течение жизни. Превращение метилированного цитозина в тимин, а следовательно накопление мутаций, происходит при старении. Однако в процессе дифференцировки клеток этот способ регуляции активности генов носит скорее вспомогательный характер и используется для закрепления выбранного пути развития клетки. ДНК неактивных генов метилирована в большей степени, чем активных. Метилирование привлекает белки, подавляющие транскрипцию. Метилирование интрона, наоборот, может активировать ген. В процессе образования гамет рисунок метилирования стирается и устанавливается новый – один, характерный для гена в сперматозоиде, другой – для того же гена в яйцеклетке. Может случиться так, что ген, пришедший в зиготу от отца, сильнее метилирован и, следовательно, неактивен. Другими словами, гены эукариот способны сохранять память о том, в составе какого генотипа они пребывали, и соответственно химически модифицироваться, изменяя характер своей экспрессии. ♀Аа х ♂Аа ♀Аа х ♂А*а (нет импринтинга) (есть импринтинг)
А* – доминантный ген, импринтированный в мужских гаметах. В этом случае фенотип потомка с генотипом А*а не будет отличаться от фенотипа потомка с генотипом аа, так как доминантный ген, полученный от отца проявляться не будет, он выключен. Рис. 40. Импринтинг Это явление называется импринтингом, что обозначает след, запечатление. Предположим, в гетерозиготе самцовый ген метилирован, поэтому мутация в нем может не проявляться. Если же мутация в гене самочьем, а он слабо метилирован, проявится заболевания. У человека много импринтированных генов. Реципрокные гибриды по импринтированным генам, вопреки генетической догме, неидентичны. Значит, некоторые гены несут отпечатки пола родителей (рис. 40). В настоящее время есть методы, позволяющие получить мышей, у которых пара гомологичных хромосом от одного родителя. Если, например, 11 хромосома от матери, мыши очень маленькие, если от отца – очень большие. У человека шизофрения и псориаз протекают очень тяжело, если передаются по отцовской линии;поликистоз почек и эпилепсия, наоборот, предаются по материнской линии. ^ Многие гены эукариот кодируют различные белки за счет альтернативного сплайсинга мРНК. Другими словами, один и тот же ген может быть матрицей для нескольких белков. Конститутивная форма альтернативного сплайсинга обусловлена двусмысленностью интрона, когда механизм сплайсинга не может различить две или более альтернативные пары 5’ и 3’-сайтов сплайсирования. Поэтому случайно образуются разные формы мРНК. Это характерно для наследственного заболевания β-талассемии. В большинстве же случаев отбор сайтов сплайсинга определяется клеткой, в результате чего образуются тканеспецифические белки. Замены экзонов, происходящие при альтернативном сплайсинге, приводят к появлению белков, чаще всего обладающих сходными функциями. Однако возможны и такие случаи, когда синтезируются белки с различающимися и даже противоположными свойствами. Предполагают, что выбор сайтов сплайсинга обусловлен связыванием тканеспецифических белков с растущим РНК-транскриптом. Необходимость транскрибирования ДНК в составе хроматина сильно усложняет транскрипцию у эукариот. Показано, что изменение упаковки ДНК влияет на экспрессию генов. Предполагают, что гены становятся неактивными, если соответствующий участок подвергается суперспирализации, т. е. образованию гетерохроматина. Это подтверждается данными, полученными при изучении инактивации одной из Х-хромосом в клетках млекопитающих. Все клетки женского организма имеют две Х-хромосомы, а мужского – одну Х- и одну Y-хромосому. Предполагают, что двойная доза продуктов генов Х-хромосомы является летальной, поэтому одна Х-хромосома инактивируется. При этом она полностью конденсируется и образует гетерохроматин. Такие конденсированные хромосомы можно увидеть в световом микроскопе. Это так называемые тельца Барра. Глава 12. МАНИПУЛИРОВАНИЕ ГЕНАМИ И ГЕНОМАМИ ^ Для изучения структуры и функций ДНК классическим подходом является использование генетических методов, которые на основе анализа фенотипов мутантных организмов позволяет судить о функции генов, их местоположении в хромосомах. В последнее время этот подход обогатился набором методов, позволяющих производить детальный анализ генетического материала - это технология рекомбинантных ДНК. Появление этих методов в 70-х годах называют методической революцией в молекулярной биологии. Они позволяют вырезать определенные участки ДНК, получать практически неограниченное число их копий, определять последовательность нуклеотидов в них, изменять по желанию экспериментатора выделенный ген и вводить его в геном вируса, бактерии или эукариотической клетки, где этот ген начнет функционировать. Техника рекомбинантных ДНК оказала существенное влияние на фундаментальную биологическую науку, позволяя решать задачи, которые раньше представлялись неразрешимыми. Применение этих методов в биотехнологии позволяет получать труднодоступные биологические вещества в виде лекарственных препаратов, новые штаммы полезных бактерий, трансгенные растения и животные. Расщепление ДНК рестриктазами. Это первый этап на пути выделения гена. Рестриктазы – это класс бактериальных ферментов, опознающих определенные последовательности нуклеотидов в двуспиральной ДНК и разрезающие ее в этих сайтах. В настоящее время производится более 100 рестриктаз, распознающих разные сайты. В качестве отступления необходимо заметить, что бактерии используют рестриктазы как средство защиты от вторжения чужеродных молекул ДНК, например, фаговой. При этом геном бактерии защищен метилированием нуклеотидов в сайтах рестрикции. Комбинация рестриктаз позволяет разрезать ДНК в строго установленных местах с хирургической точностью, с образованием заданных фрагментов (Рис. 41). Рестрикционные фрагменты ДНК уникальны у каждого человека. Поэтому, проведя их электрофорез в геле, можно получить картинку, напоминающую товарный код. По ней можно устанавливать отцовство, материнство и дальнее родство.  Рис. 41. ^ Клонирование ДНК. Многие рестриктазы производят разрезание в двуцепочечной ДНК со смещением в несколько нуклеотидов, так что на концах фрагментов образуются одноцепочечные участки. Их называют липкими концами, так как они могут образовывать комплементарные пары с одноцепочечными участками другого фрагмента. Таким образом любой фрагмент ДНК можно воссоединить, включить в другую ДНК, например, вируса или плазмиды и др. Клон – это множество копий идентичных одному предшественнику. Схема клонирования гетерологичной ДНК в плазмиде представлена на рис. 42. Для получения клона ДНК можно использовать также бактериофаги, которые могут принять фрагмент чужеродной ДНК. Чаще всего для этой цели используют ДНК фага λ.  Рис. 42. Клонирование эукариотической ДНК в плазмиде бактерий. Центральная часть его ДНК может быть заменена фрагментом в 15-20 т.п.н. без ущерба для репликации такого рекомбинантного фага в клетках E.coli. Дале E.coli заражают фагами с фрагментом, например, человеческой ДНК, так что одна E.coli заражается одним рекомбинантным фагом; при размножении она будет нарабатывать фрагмент человеческой ДНК. Таким образом получают полное собрание генома человека, распределенное по отдельным томам рекомбинантных молекул фаговых частиц в суперобложке бактерии E.coli. Это и есть геномная библиотека. E.coli, зараженные фагом, высевают на питательную среду. Неинфицированные клетки растут, образуя “газон”, а инфицированные фагом – лизируются с образованием пятна лизиса, или бляшки. Каждая бляшка содержит множество копий фага с одним фрагментом ДНК человека. Теперь надо отобрать бляшки с нужным фрагментом ДНК. Это делатся с помощью ДНК-зонда, т.е. короткой последовательности в гене человека. Далее только этот фаг с нужным фрагментом размножают в E.coli. Клонирование кДНК. Если клонирование геномной ДНК предполагает получение клонов ДНК, не зависимо от того, есть в ней гены или нет, то клонировние кДНК направлено на получение генов. Для этого сначала из клеток, в которых интересующий ген экспрессируется достаточно интенсивно, выделяют мРНК. Она, как известно, после созревания не содержит интронов. Затем in vitro производят ее копирование с помощью обратной вирусной транскриптазы (открыта в 1970 г. Г. Темином и Д.Балтимором) в однонитевую ДНК, а потом к ней достраивают вторую комплементарную цепь. Клонирование полученной ДНК осуществляют, как описано выше. Получается библиотека кДНК или генов. Такой метод применяют для получения так называемых одноцепочечных антител. Схема метода представлена на рис. 43. Сначала получают кДНК для VH- и VL-доменов антител и сшивают эти фрагменты ДНК. После трансфекции E.сoli этой ДНК и заражения нитчатым фагом трансфецированные бактерии размножают. В результате образуется множество нитчатых фагов, которые на своей поверхности экспрессируют V-домены антител человека.  Рис. 43. Получение антител человека с помощью нитчатых фагов. Секвенирование ДНК. Это определение последовательностей нуклеотидов в ДНК. Существует два метода секвенировния. Один из них химический метод Максама-Гилберта, другой основан на репликации ДНК метод Сэнгера. Во избежание излишнего усложнения учебного пособия, мы здесь не описываем эти методы.  Амплификация сегментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) (рис. 44). Для проведения ПЦР достаточно небольшого количества ДНК (из нескольких клеток). Метод прост и изящен, но для его осуществления надо знать нуклеотидную последовательность амплифицируемой ДНК, чтобы синтезировть два олигонуклеотида – праймера, каждый из которых комплементарен участку одной из цепейРис. 44. Проведение полимеразной цепной реакции. ДНК, примыкающему к выбранному для амплификации сегменту. Сначала ДНК нагревают для разделения дуплекса и копируют. Вновь образовавшиеся дуплексы опять разделяют нагреванаием и проводят следующий раунд амплификации. В ПЦР используют фермент ДНК-полимеразу термофильных архей – Taq- или Pfu- полимеразы. В ПЦР можно амплифицировать фрагменты ДНК длиной до 35 тысяч п.н. Применение этих и других методов сделало возможным выделение и анализ структуры и функции любого гена. Выдающимся достижением современной генетики является создание способов направленной модификации геномов животных, растений и микроорганизмов. Имеется в виду рукотворное направленное воздействие на геном – изменение структуры генов, введение в геном чужеродных генов в виде природных или искусственно созданных генных конструкций, а также конструирование новых, доселе не существовавших в природе геномов. В 1982 году создан Международный центр по генной инженерии и биотехнологии, объединяющий 32 государства. Началось все с трансгенеза, т.е. с переноса генов из одного организма в другой. Основанием для этого послужила разработка методов молекулярной биологии гена, позволяющих выделять определенный ген, получать необходимое число его копий, т.е. клонировать, осуществлять кройку-шитье генов, т.е. убирать ненужные участки и пришивать новые, а также техника рекомбинантных ДНК, позволяющая помещать гены в реплицирующийся вектор – вирус или плазмиду – для дальнейшего переноса в другой организм. В настоящее время трансгенез превратился в стратегическое направление исследований, дающее ответы на многие фундаментальные и прикладные вопросы. С помощью трансгенеза создают новые породы животных, сорта растений и штаммы микроорганизмов. Трансгены можно вводить в соматические клетки, в оплодотворенную яйцеклетку, а также в стволовые эмбриональные клетки, культивируемые in vitro. Методы введения генов разнообразны и выбор их зависит от клеток, которые подвергаются трансгенезу. Введение в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки осуществляют непосредственной инъекцией генетической конструкции с использованием микроманипулятора. Таким способом получают трансгенных животных. В стволовые эмбриональные клетки трансгены вводят с помощью вирусной инфекции или электропорации. Затем модифицированные таким образом клетки вводят в бластоцисту мыши, которую трансплантируют в матку ложнобеременной самки. При успешном исходе получается химерная мышь, содержащая трансгенные клетки в разных тканях, в том числе и в зародышевом пути. Трансгенез соматических клеток используют как основной прием в генной терапии. Но об этом несколько позже. ^ В 1972 году американский ученый Пол Берг опубликовал сообщение о получении in vitro рекомбинантной ДНК, состоящей из фрагментов ДНК вируса и бактерии. Так, развитие технологии рекомбинантных ДНК ознаменовало рождение новой отрасли молекулярной биологии – генетической инженерии. Задачи этого направления исследований разнообразны. Во-первых, это изучение механизмов функционирования генетического материала эукариот, включая человека. Во-вторых, практические задачи, многие из которых уже сейчас успешно решены. На основе переноса искусственно созданных генетических конструкций в разные организмы получены трансгенные микроорганизмы, растения и животные. Разработаны методы создания новых диагностикумов для выявления наследственных и вирусных заболеваний. В медицине в связи с успехами генной инженерии появилась генная терапия, основанная на введении в организм больного новой генетической конструкции. Генная инженерия индуцировала развитие таких направлений, как генная археология, генная дактилоскопия и т.д. Предпосылками к возникновению генной инженерии были три группы важнейших открытий: открытие структуры и функции генетического аппарата клетки; открытие механизмов рекомбинации ДНК – гомологичной и негомологичной; обнаружение в бактериальных клетках внехромосомных маленьких кольцевых ДНК, плазмид, способных к репликации и выделяющихся из бактерий в нативном виде; открытие рестриктаз, бактериальных ферментов, способных расщеплять ДНК в строго определенных местах с образованием фрагментов с липкими концами. Из этого перечисления открытий видно, что главным теоретическим принципом генной инженерии является генетическая рекомбинация, которая в естественных условиях постоянно осуществляется в организмах. Однако в природе существует много ограничений на рекомбинацию между участками ДНК. Гомологичная рекомбинация происходит только между гомологичными хромосомами при скрещивании близкородственных организмов. Нельзя извне управлять процессом рекомбинации в организме, поэтому нельзя предугадать, какое получится потомство при скрещивании, и результаты часто бывают прямо противоположными ожидаемым. Эти обстоятельства делают путь к получению новой породы животных или нового сорта растений классическими методами селекции долгим, тернистым и зачастую малоуспешным. Сущность генной инженерии заключается в том, что процесс рекомбинации производится вне организма, при этом преодолеваются все препятствия, с которыми сталкиваются ученые при классической селекции. В результате появились неограниченные возможности скрещивать гены видов, далеко отстоящих друг от друга на эволюционной лестнице. Появилась возможность управлять процессом рекомбинации, так как in vitro он не защищен запрещающими механизмами организма. И, наконец, можно предсказывать результат. Как же получают необходимую рекомбинантную ДНК? Для этого используют вирусы или плазмиды. Сначала получают фрагмент гетерологичной ДНК, например, эукариотической и плазмидной с одинаковыми липкими концами. Для этого ту и другую ДНК обрабатывают одной и той же рестриктазой. В результате одноцепочечный липкий конец одного фрагмента оказывается комплиментарным концу другого фрагмента. Гибридизацию фрагментов проводят in vitro, а затем рекомбинантную плазмиду вводят в клетку. Обычно используемая плазмида имеет маркерный ген, придающий бактерии устойчивость к антибиотику. Поэтому бактерии, несущие рекомбинантные плазмиды, будут расти на среде с добавлением этого антибиотика, а все другие погибнут. Рекомбинантная плазмида начинает функционировать, т. е. ее ДНК реплицируется и транскрибируется. В результате в бактериальной клетке появляется белок, которого никогда в этих клетках в естественных условиях не было. Таким способом можно ввести любой ген в любую клетку. Итак, основные процедуры генной инженерии сводятся к следующим: рекомбинация in vitro ДНК-вектора и ДНК-гена; введение рекомбинантной ДНК в вирус или плазмиду; получение клона клеток, экспрессирующих данный ген. ^ Первыми организмами, которые по воле ученых содержали рекомбинантную ДНК, явились бактерии, а именно E. сoli, производящие генно-инженерный человеческий инсулин. Инсулин – гормон поджелудочной железы – играет главную роль в углеводном обмене. Если он не производится в организме (по разным причинам), развивается тяжелое заболевание – диабет. Для лечения больных диабетом применяли инъекции свиного инсулина, на который у многих больных развивалась иммунологическая реакция. Но даже потребности в свином инсулине удовлетворялись всего на 60%. Поэтому в качестве первой практической задачи генные инженеры клонировали ген человеческого инсулина и включили его в плазмиду, которой заразили E.coli (рис. 45). В результате E.coli. стали нарабатывать человеческий инсулин. За ночь каждая бактерия дает потомство 107 клеток. Из 1000 л бактериальной культуры получают 200 г инсулина, столько же, сколько получали раньше из 1600 кг поджелудочной железы свиней. Главное, для этих больных решена проблема иммунологической реактивности на чужеродный свиной инсулин. Другой генно-инженерный биопрепарат – это интерферон, который успешно применяют для лечения вирусных заболеваний и злокачественных опухолей. В настоящее время на стадии клинического испытания находится более 1000 генно-инженерных лекарственных веществ. Около 200 новых диагностических препаратов уже введено в медицинскую практику. Так начало развиваться одно из главных направлений в генной инженерии – наработка труднодоступных лекарственных биопрепаратов – гормонов, факторов роста, нейро- и иммуномодуляторов, аминокислот, витаминов, антибиотиков. Второе направление – это получение рекомбинантных вакцин для профилактики инфекционных заболеваний. Идеалом является комбинированная вакцина, состоящая из иммунодоминантных эпитопов ряда возбудителей ( что в естественных условиях не встречается), эффективная при использовании в малой дозе для перорального введения людям и сельскохозяйственным животным. В пищевой промышленности используются трансгенные штаммы организмов в хлебопечении, сыроварении, получении кисломолочных продуктов, виноделии и т.д.  Рис. 45 . Получение генноинженерного инсулина. Для использования в сельском хозяйстве получены штаммы трансгенных бактерий, которые наиболее эффективно осуществляют фиксацию азота, улучшают состояние почв, препятствуют образованию льда на корнях растений и т. д. Для целей охраны окружающей среды используют трансгенные бактерии, которые очищают почву и воду от фенолов, от загрязнения нефтью, ракетным топливом гептилом и др. загрязняющими веществами. Ген фермента хитиназы встроили в бакуловирус (вирусы этой группы поражают только насекомых), последний используют в качестве биоинсектицида. Попадая в организм насекомых, он поражает их кишечник. Есть проект, предусматривающий введение гена хитиназы в растения. ^ По прогнозам к 2020 году население Земного шара достигнет 8 млрд человек. Питание и медицинское обслуживание такого количества людей является первостепенной задачей, стоящей перед человечеством. Растения являются основой питания людей. Кроме того, они еще по-видимому долго будут оставаться источником биологически активных и лекарственных препаратов. Следовательно, повышение урожайности сельскохозяйственных растений является главной проблемой современности. 30 лет назад завершилась Зеленая революция, в результате которой при использовании традиционных методов селекции ученые добились повышения урожайности сельскохозяйственных культур вдвое. Это было достигнуто за счет переноса в создаваемые сорта растений генов, отвечающих за развитие короткого и прочного стебля, за более эффективную утилизацию удобрений, за устойчивость к заболеваниям и вредителям и др. Идеолог Зеленой революции Норман Борлуаг в 1970 году награжден Нобелевской премией. Сохранение демографического роста не снимает с повестки дня проблему обеспечения населения продовольствием. Одно из ее решений заключается в создании трансгенных растений методами переноса генов не путем скрещиваний выбранных сортов, а непосредственным внесением в геном нужных генов. Растения имеют одно очень важное преимущество перед животными, а именно легко осуществима их регенерация in vitro из недифференцированных соматических клеток с получением нормальных фертильных растений. Это обусловлено тотипотентностью растительных клеток. Для конструирования генома растений необходимо решить следующие задачи: выделить конкретный ген, обеспечить включение его в наследственный аппарат растительной клетки и регенерировать из единичных модифицированных клеток нормальное растение с измененным генотипом. Для этого используют несколько методов трансгенеза. Наиболее распространенный – это перенос генов с помощью Ti-плазмиды Agrobacterium tumifaciens, бактерий, которые поражают растения с образованием на корнях опухолеподобных разрастаний – корончатых галлов (Рис. 46). Эти бактерии обладают естественным механизмом горизонтального переноса генов, передавая свои плазмиды растительным клеткам. Это самый замечательный из известных примеров природной генетической инженерии. В природных популяциях Agrobacterium tumifaciens имеются плазмиды, содержащие опухолеродный генный сегмент. Встраивание его в клетку растения обусловливает развитие опухоли, которая синтезирует производные аргинина, отсутствующие у хозяина. Они необходимы для роста бактерий. Генные инженеры используют эти бактерии для трансгенеза. При этом из их плазмид вырезают гены, ответственные за образование корончатых галлов, и вносят нужные генетические конструкции. Однако этот метод эффективен только для двудольных растений, для однодольных, в основном злаковых, применяют баллистический метод – выстреливание из ”генного ружья” золотых или вольфрамовых пулек, частиц величиной в 4мкм, покрытых ДНК, которую нужно перенести в клетку. Кроме того, применяют введение плазмидной ДНК в лишенные оболочки клетки растений (протопласты), электропорацию клеток, прокалывание клеток путем встряхивания их в суспензии микроигл, а также с помощью вирусной инфекции. Вместе с нужным геном встраивают обычно и, так называемый, репортерный ген (ген устойчивости к канамицину), по которому судят, встроилась ли конструкция в клетку. Постоянную угрозу для урожая сельскохозяйственных культур представляют сорняки. Для борьбы с ними применяют токсичные вещества – гербициды. Но при применении их страдают и культурные растения. Значит, надо сделать последние устойчивыми к гербицидам.  Рис. 46. Методы получения трансгенных растений. Достигается это за счет введения генов, обеспечивающих ускоренный метаболизм гербицидов или кодирующих нечувствительные к гербицидам белки-мишени. В настоящее время созданы такие растения устойчивые к гербицидам широкого спектра действия. Бельгийцы пытаются выйти на рынок с трансгенной капустой, устойчивой к гербицидам. Пока им это не удается, так как есть опасность, что она сама станет сорняком, с которым не справиться. Устойчивая к гербициду Roundup соя признана в США растением года в 1997 году. Другая проблема, которая решается методами трансгенеза, это создание растений устойчивых к болезням – вирусным, бактериальным, грибковым, и к вредителям. Такие растения получены. Многие из них устойчивы к десятку вирусов. Для создания устойчивости к вредителям генные инженеры использовали способность токсина B. turingiensis поражать насекомых. Токсин bt расщепляется в кишечнике насекомых и активизируется, после чего связывается с рецепторами клеток кишечника и вызывает их лизис. Для млекопитающих токсин B. turingiensis совершенно безвреден. Ген, отвечающий за синтез этого токсина, выделен, клонирован и перенесен в геном растений. Они оказались не поедаемыми насекомыми. В настоящее время трансгенные растения хлопка, кукурузы, картофеля с геном токсина bt уже производятся разными фирмами, и семена их продаются. Новая генетическая информация может быть включена не только в ядерный геном растений, но и в пластиды. В результате в такой трансгенной клетке образуется до 1000 копий трансгена. Такие растения называются транспластосомиками. Особое направление в трансгенезе растений связано с получение так называемых съедобных вакцин. Для этого в растения вводятся гены, кодирующие белки патогенных для человека бактерий и вирусов. Получены бананы и картофель, синтезирующие вакцины против холерного вибриона. Растения могут производить и белки животного типа. Удалось получить растения, в листьях которых содержатся антитела против стрептококка, вызывающего зубной кариес. С помощью трансгенеза оказалось возможным управлять синтезом жирных кислот в растениях с целью повышения или снижения содержания ненасыщенных жирных кислот в растительном масле, а также получение белка, более сбалансированного по аминокислотному составу и легкоусвояемого млекопитающими. Получение трансгенных растений превратилось в рутинную технологию для решения различных практических задач, которыми занимаются научные учреждения и коммерческие фирмы. В настоящее время у 120 видов растений получены трансгенные формы. Разрешены для использования в народном хозяйстве трансгенные виды: соя, кукуруза, картофель, томаты, хлопок, рапс, тыква, табак, папая, свекла. В растения введены гены устойчивости к гербицидам, к насекомым, к вирусам, к грибковым и бактериальным заболеваниям, гены, регулирующие созревание плодов и др. В Китае на многих тысячах гектаров произрастают растения с генами ризобактерий, фиксирующих азот. Пока не ясно, можно ли заменить использование азотистых удобрений таким способом. Но главной задачей трансгенеза растений все-таки остается повышение продуктивности. Российскими учеными создано 20 видов трансгенных растений. Некоторые из них в настоящее время проходят испытания. Перечень некоторых трансгенных растений Растения с генами устойчивости к вирусным заболеваниям (табак с геном интерферона, томаты, кукуруза с генами устойчивости). Растения с генами устойчивости к гербицидам “Баста” и “Облава”. Растения с генами устойчивости к вредителям, в основном с генами токсина B.turingiensis (картофель устойчивый к колорадскому жуку и фитофторе, кукуруза, хлопчатник). Растения с генами нитрогеназы, фермента из азотфиксирующих бактерий, способные усваивать атмосферный азот. Растения пищевые вакцины (картофель и бананы как вакцины против холеры), растения с генами антител против холеры и др. заболеваний. Транспластомики растения, у которых трансген введен в пластиды (неординарная экспрессия гена до 10000 копий в клетке). Растения с генами, обеспечивающими распад предшественника этилена, для предотвращения быстрой порчи (негниющие томаты, бананы свключенными в их геном генов, тормозящих синтез этилена,и др.). Растения с генами лекарственных препаратов. Синие розы, с геном пигмента, заимствованным у других растений. ^ Главным достижением генной инженерии является создание способов модификации геномов животных. Речь идет о направленном изменении структуры генов животного или введения в геном чужеродных натуральных и искусственных генов, т. е. о направленном конструировании новых геномов. Основой этого подхода является введение клонированной ДНК с помощью микроинъекции в пронуклеус, обычно мужской, зиготы (Рис. 47) При этом экзогенная ДНК способна интегрироваться в геном и становиться его компонентом – трансгеном, следовательно наследоваться в поколениях. Для проведения этой процедуры оплодотворенные яйцеклетки выделяют из яйцевода животного и с использованием микроманипулятора вводят ДНК. На рис. 47 показана схема подобного эксперимента. Введенная таким способом экзогенная ДНК  Рис. 47. Получение трансгенных животных. способна интегрироваться в геном реципиента случайным образом и зачастую в виде множества копий. Вследствие этого экспрессия одного и того же трансгена может варьировать в широких пределах, от полного ее отсутствия до уровня, превышающего экспрессию аутентичного гена. Тем не менее, этот метод активно используется как для получения как лабораторных, так и сельскохозяйственных трансгенных животных. Лабораторные трансгенные животные используются в основном для моделирования заболеваний человека. В настоящее время, благодаря трансгенной технологии, получено более 300 трансгенных линий мышей, моделирующих воспалительные, аутоиммунные, нейродегенеративные, онкологические и другие заболевания человека. Трансгенные сельскохозяйственные животные используются в основном как “фабрики” для наработки необходимых для человека биопрепаратов.  В последующем техника введения чужеродной ДНК в геном животных усовершенствовалась так, что стало возможным вводить ДНК направленно, адресно в конкретную часть генома. Основой этой технологии послужило использование эмбриональных стволовых (ЭС) клеток. Известно, что ЭС-клетки сохраняют высокие плюрипотентные свойства при длительном культивировании in vitro и, будучи вновь введенными в эмбрион, способны формировать химеры. Эта уникальная способность ЭС-клеток открыла широкие возможности для манипуляции с их генами. Адресное введение гена достигается благодаря возможности рекомбинации между экзогенной ДНК и ДНК реципиента. В результате этого происходит адресная инсерция гена в ДНК-мишень ЭС-клеток. После этого ЭС-клетки внедряют в бластоцисту животных на ранних стадиях развития (Рис. 48). В результате трансгенные эмбриональные стволовые клетки принимают участие в формировании тканей развивающегося плода, который представляет собой химеру. У химерных животных до 50% клеток составляютРис. 48. Получение трансгенных животных с помощью эмбоиональных стволовых клеток клетки – потомки введенных трансгенных эмбриональных стволовых клеток. Показано, что они присутствуют во всех тканях, в том числе и зародышевом пути. В эмбриональные стволовые клетки трансгены вводят с помощью ретровирусов, электропорации, липосом, в виде “голой ” плазмидной ДНК, в виде искусственных конструкций на основе полисахаридов и др. К настоящему времени получено более 2000 трансгенных мышей, в геноме которых находятся различные введенные генетические конструкции. Получены трансгенные козы, овцы, свиньи, коровы и другие сельскохозяйственные животные. Вводимая таким способом ДНК интегрируется в геном случайным образом и зачастую в виде множественных копий. Вследствие этого экспрессия трансгена у разных животных может сильно варьировать. Тем не менее этот метод активно используется для практических целей,например, для получения животных, которые являются поставщиками человеческих белков – факторов свертывания крови, гормонов и других необходимых для лечения человека белков. Дело в том, что трансгенные прокариоты, которых получать проще, не достаточно полно справляются с аналогичной задачей. Они не могут осуществлять посттрансляционную модификацию белков так, как это делают эукариотические клетки ( фолдинг, гликозилирование и др.). использование биореакторов, в которых продуцентами биопрепаратов являются культивируемые клетки животных, очень дорого. К тому же культивируемые клетки часто проявляют нестабильность генома. В связи с этим наиболее перспективной для получения белков человека является биотехнология с использованием трансгенных животных. Животные адекватным образом осуществляют посттрансляционные процессы и могут быть настоящими фабриками по производству любого белка. При этом можно сделать так, что нужный белок будет выделяться с молоком, что очень удобно в ряде случаев. Для этого трансген помещают под контроль одного из генов, контролирующих белки молока. Для промышленного биопроизводства используют коров, коз, овец и свиней. В настоящее время имеется реальная возможность производства в молоке трансгенных животных более 65 биологически активных белков человека. Так получают антитрипсин для лечения заболевания легких, антитромбин, необходимый для лечения инфаркта миокарда и инсульта, факторы свертывания крови для лечения гемофилии, С-реактивный белок для лечения иммунодефицитов, иммуномодуляторы, биостимуляторы, антитела и др. Трансгенные животные находят применение для моделирования заболеваний человека. Введенный трансген обеспечивает экспрессию рецептора к соответствующему вирусу и, следовательно, возможность возникновения вирусной инфекции. Такой прием необходим в случае моделирования на животных вирусных инфекций, поражающих только человека. В последние годы внимание исследователей привлечено к возможности модификации генома животных на уровне индивидуальных хромосом. Появились способы создания искусственных хромосом и подходы к переносу их от одного животного к другому. По сути, это новая биотехнология или генная инженерия. Она основана на модификации генома эмбриональных стволовых клеток. В Институте цитологии и генетики СО РАН О. Л. Серовым с сотрудниками используется оригинальный подход. Получают гибриды между эмбриональными стволовыми клетками и соматическими клетками. В полученных гибридах, только в тех из них, которые сохраняют плюрипотентные свой свойства и способны образовывать при введении в бластоцисту химеры, находятся единичные хромосомы от соматического партнера. Будучи введенными в бластоцисту мыши, они способны формировать химеры, а последние – продуцировать гаметы, идентичные по генотипу гибридным клеткам. Согласно этой схеме, возможен перенос индивидуальных хромосом от одного животного к другому. Не менее привлекательным выглядит сочетание метода с клонированием. В этом случае ядра полученных гибридов переносят в энуклеированную яйцеклетку. Значит, такие реконструированные ооциты обеспечат развитие особей с генотипом гибридной клетки. Есть еще одна интересная модификации трансгенеза, позволяющая переносить большие количества генетического материала. В основе его – контролируемая фрагментация клеточного ядра, так что отдельные фрагменты содержат индивидуальные хромосомы или их фрагменты, их называют микроклетками. Последние сливают с эмбриональными стволовыми клетками. Полученные мыши-химеры (способом, описанным выше) называют транс-хромосомными. Недавно группа английских ученых получила серию транс-хромосомных мышей, несущих фрагменты 21 хромосомы человека. Важно, что у этих животных наблюдается тканеспецифическая регуляция экспрессии человеческих генов. Ученые научились также получать искусственные хромосомы и вводить их в геном животных. Уже получены такие мыши, которые могут использоваться для изучения роли отдельных структур в организации хромосом млекопитающих. 12.6. Клонирование Новая страница в модификации геномов животных – это клонирование, основанное на переносе в энуклеированную яйцеклетку ядер соматических клеток, т. е. замене генома созревающей яйцеклетки на геном, взятый от другого животного. В комбинации с методами трансгенеза клонирование открывает фантастические возможности для генетической модификации геномов животных. Клонирование – это точное воспроизведение того или иного живого объекта в каком-то количестве копий. Бесполое размножение одной бактерии или амебы – это образование клонов соответствующих организмов. Для генетиков растений получение клонов не составляет никаких проблем. Апомиксис – не что иное, как специфический способ размножения, позволяющий получать генетические копии материнского организма. Однако такая природой созданная технология в естественных условиях используется только некоторыми растениями (например, кукурузой). Для многих сельскохозяйственных растений характерен половой способ размножения. Но и для них метод клонирования разработан давно. Если любую растительную клетку лишить прочной оболочки, а потом обработать ростовыми факторами, она начинает делиться, образуя колонии клеток, каллус, из которых каждая может дать начало целому растению. Для селекционеров эта технология представляет большой практический интерес, так как дает возможность вводить определенные гены в клетки каллуса и в последствии получать серию растений, модифицированных по желанию экспериментатора. Генетики животных получают клоны, если животные размножаются партеногенезом, то есть бесполым путем, без предшествующего оплодотворения. Получают клоны и в экспериментальной эмбриологии. Если зародыш морского ежа на ранней стадии дробления разделить на составляющие его клетки – бластомеры, то из каждого бластомера разовьется целый организм. У человека известны случаи своеобразного естественного клонирования. Это, так называемые, однояйцевые близнецы, которые возникают сравнительно редко из-за разделения оплодотворенной яйцеклетки на два бластомера, каждый из которых потом развивается самостоятельно. Такие близнецы очень похожи друг на друга. В настоящее время предприняты попытки (и они увенчались успехом!) клонирования животных путем пересадки ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки. История клонирования животных началась с исследований российского ученого Г. В. Лопашова в 40-х годах, который разработал метод пересадки ядер в яйцеклетку лягушки. Однако из-за беспредельного господства в отечественной биологии печально известной лысенковщины, объявившей генетику лженаукой, статья Г. В. Лопашова не была опубликована, а в 50-е годы американские эмбриологи Бригс и Кинг выполнили сходные эксперименты и приоритет достался им, как это часто случалось в истории Российской науки. В дальнейшем Джон Гердон из Великобритании усовершенствовал эту методику и стал удалять ядра из яйцеклеток лягушки и вводить вместо них ядра разных дифференцированных соматических клеток, в частности из эпителия кишечника и плавательной перепонки. В результате развития такие модифицированные яйцеклетки превращались во взрослые особи, точные копии лягушки, от которой взяты ядра соматических клеток (рис. 49). Вслед за этими работами Карл Иллмензее опубликовал сообщение о том, что ему удалось получить клон из трех мышат. К сожалению, из-за того, что никому из экспериментаторов не удалось воспроизвести эти эксперименты, опыты Иллмензее признали недостоверными, и на некоторое время в этой области исследований воцарилось спокойствие. И вдруг как гром среди ясного неба в феврале 1997 года появилось сообщение, что в лаборатории Яна Вильмута из Рослинского института (Эдинбург, Шотландия) разработан эффективный метод клонирования млекопитающих и на его основе создана овечка Долли. Схема эксперимента представлена на рисунке 50. Ооциты были извлечены из овец породы Шотландская черномордая и помещены в культуральную среду, после чего на них проведена операция энуклеации – удаления клеточного  Рис. 49. Схема получения клонированных лягушек я  дра. Ядро соматической клетки взяли для трансплантации из молочной железы лактирующей овцы породы Финский дорсет и слили с энуклеированной яйцеклеткой. После этого модифицированную яйцеклетку активировали к делению электрическим током и после культивирования в питательной среде в течение 6 дней трансплантировали в матку овцы - суррогатной матери. Получается, что у Долли 3 матери - одна, которая дала свой генетический материал, вторая – от которой взяли яйцеклетку (кстати, митохондрии у Долли от Рис. 50. Схема получения овечки Доллиэтой овцы) и третья – которая вынашивала ягненка, и ни одного отца. Из 236 опытов успешным оказался один, в результате которого и родилась овечка Долли. Вслед за этим был получен клон мышей группой ученых из Гонолуллу под руководством Риузо Янагимачи. Эти работы, безусловно, являются выдающимся достижением молекулярной генетики. Можно сказать, что техническая задача получения клонированных животных решена. Появление Долли вызвало немедленную реакцию во всех странах. Общественность взволнована вопросом, допустимо ли распространить метод клонирования на человека? Правительства многих стран наложили мораторий на клонирование человека. Однако запретить эти эксперименты вряд ли удастся. Нет ничего, что было бы недоступно в этой технологии для современной эмбриологической лаборатории. Американские ученые получили клонированных обезьян, а это уже очень близко к человеку. Однако есть надежда на то, что сама природа поставит заслон этим исследованиям на человеке. Нельзя сказать, что яйцеклетка человека больше похожа на яйцеклетку овцы, чем сам человек на овцу. Различия большие. Однако теоретически клонирование человека возможно. Только вряд ли нужно. Хочется думать, что человечество воздержится от таких рискованных экспериментов. В теоретическом плане работа Яна Вильмута показала, что в процессе развития геном не претерпевает необратимых изменений и возможно репрограммирование генома соматических клеток путем трансплантацию их в цитоплазму ооцита. В связи с этим клонирование млекопитающих открывает возможность выращивания ткани для пересадки пациентам с тяжелыми неизлечимыми заболеваниями, то есть создание банков здоровых тканей. ^ � Успехи трансгенеза обусловили возникновение нового комплекса методов лечения заболеваний – генную терапию, основанную на введении в организм генетических конструкций с целью лечения заболеваний путем направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций. В арсенале генной терапии несколько приемов. Один из них используется в тех случаях, когда утрачена функция какого-либо гена и для лечения эту функцию нужно восстановить. Наиболее подходят для такого способа лечения заболевания, которые обусловлены дефектом одного гены, особенно если этот ген выделен и клонирован. В этом случае введение в организм нормального гена при его экспрессии обеспечит недостающий продукт (позитивная генная терапия). Второй подход связан с необходимостью подавления функции ”больного ” гена или избыточно экспрессирующегося гена. Этот прием называется генный нокаут. Для решения этой задачи применяют ряд методов. Во-первых перенос гена, кодирующего антисмысловую мРНК ( антисенс-мРНК), т. е. мРНК, комплементарную той, которая кодирует мРНК ”больного ” гена, в результате трансляция последней подавляется. Такой подход называется негативной генной терапией, или антисенс-терапией. Для избавления от ненужного генного продукта используют также метод, который называется внутриклеточной иммунизацией. Он заключается в том, что в клетку вводят ген, кодирующий антитело к нежелательному белку, при экспресси гена такие антитела будут связывать специфически образующийся белок и отменять его функцию. Такие внутриклеточные антитела получили название интрабоди. Их применение облегчилось замечательной находкой. Известно, что за связывание с антигеном отвечает не вся сложная молекула антитела, состоящая как минимум из двух тяжелых и двух легких полипептидных цепей (может быть и больше), а только вариабельные домены каждой из них. Вот и сделали конструкцию, кодирующую эти два домена, так называемые одноцепочечные антитела. К этой конструкции можно присоединить сигнальные последовательности, которые будут направлять ее в определенные компартменты клетки, к определенным клеточным структурам. Таким образом, внутриклеточные антитела открывают универсальный способ воздействия внутри клетки на любые продукты синтеза. Например, подобная работа проведена с α- субъединицей рецептора интерлейкина-2. Экспрессия этого рецептора в значительной степени повышена при некоторых формах лейкемии. Внутриклеточные антитела в данном случае обусловили отсутствие рецептора на поверхности клеток и обусловили тем самым лечебный эффект. Еще один прием для подавления функции гена связан с введением генетической конструкции, кодирующей рибозим, т. е. РНК, обладающую ферментативными свойствами и специфически расщепляющую соответствующую вредную мРНК что как нетрудно догадаться, приведет к отмене ее трансляции и наработки белка. Третий подход – это корригирующая генная терапия, т.е. исправление структуры и, следовательно, функции испорченного гена. Иногда как отдельный способ генной терапии выделяют модификацию генетическим путем клеток для усиления иммунного ответа. В этом случае гены вводят либо в клетки, против которых вследствие их модификации развивается иммунный ответ (усиление иммунитета на опухолевые клетки ), либо в клетки иммунной системы ( для коррекции функции иммунной системы при иммунодефицитах). В число заболеваний, подлежащих генной терапии, входят, прежде всего, наследственные болезни, и среди них те, которые обусловлены рецессивной мутацией и являются моногенными. В настоящее время известно более 4500 заболеваний, относящихся к генетическим, т. е. в основе их патогенеза лежит повреждение генов. Но и такие болезни, как рак, атеросклероз, нейропсихические заболевания, диабет и другие, также могут быть объектами генной терапии. Стоит заметить, что если речь идет о человеке, то подразумевается только соматическая генная терапия, т. е. введение генов в соматические, а не зародышевые клетки. Во всех случаях генной терапии чаще всего используют метод ex vivo (рис. 51), заключающийся в том, что клетки, взятые из организма пациента, подвергают трансгенезу in vitro, отбирают трансфецированные клетки и возвращают обратно.  Рис. 51. Генотерапия способом ex vivo. Какую бы стратегию генной терапии ученые ни использовали, необходимо решить в каждом случае ряд практических вопросов, которые решаются в принципе также как и при получении трансгенных животных, а именно: как сделать и как доставить необходимую генную конструкцию, как обеспечить экспрессию гена и ее регуляцию в организме. Процесс генокоррекции начинается с создания полноценно работающей генетической конструкции, содержащей кодирующую и регуляторную части гена. На следующем этапе решается проблема вектора, обеспечивающего эффективную, а по возможности и адресную доставку гена в клетки-мишени. По выражению Индера Вермы из Института им. Солка в США, в генной терапии есть три основных проблемы – это проблема доставки, доставки и доставки. Векторы для доставки генетических конструкций по назначению делят на вирусные и невирусные. В вирусных векторах рекомбинантная ДНК, несущая экспрессируемый ген, упакована в геном ретровируса, аденовируса, герпес-вируса и т. д. При этом из вирусного генома удаляют ту его часть, которая ответственна за формирование инфекционных вирусных частиц и лизис клеток, но сохряняют те гены, которые отвечают за перенос и экспрессию клонированного гена. До последнего времени главное место среди вирусных векторов занимали ретровирусы (РНК-содержащие вирусы). Ретровирусы обладают такими свойствами, как будто они специально созданы для переноса генов: для репликации они должны внедриться в геном клетки-хозяина, стабильно в нем реплицируются, и передаются подобно клеточным генам в поколениях клеток. При этом ретровирусы позволяют включать в состав их генома чужеродные гены, без утраты способности к репликации. Проникновение модифицированного ретровируса в клетку индуцируется его присоединением к соответствующему рецептору. Это делает возможным переносить гены в вирусном векторе в определенный тип клеток. Правда, эти клетки должны быть делящимися, потому что ретровирусы не могут проникать через ядерную мембрану и только при ее лизисе (что происходит при делении клеток) оказываются способными внедриться в геном хозяина. Аденовирусные векторы создаются на основе ДНК-содержащих вирусов, вызывающих у человека заболевания верхних дыхательных путей и желудочнокишечного тракта. Они обладают широкой видовой и тканевой специфичностью, заражают клетки на любой стадии клеточного цикла, способны заражать клетки нервной системы, мышечной ткани, иммунной системы. В подавляющем большинстве случаев они не интегрируются в геном, а находятся в клетке в форме эписом. В качестве векторов используют также вирусы герпеса, осповакцины, лентивирусы и др. Вирусные векторы эффективно доставляют генетические конструкции в клетки, однако у них много недостатков. Ретровирусы проникают, как уже было сказано, только в делящиеся клетки, внедряются в геном хозяина, что чревато инсерционным мутагенезом и активацией онкогенов или инактивацией антионкогенов и, как следствие, риском развития опухолей. Аденовирусы не внедряются в геном, что является их преимуществом, но эпихромосомная их локализация не обеспечивает длительной экспрессии трансгена. Поэтому такие рекомбинантные вирусы надо вводить повторно. А это вызывает развитие иммунологических реакций. В 1999 году все молекулярные биологи (и не только они) были потрясены трагическим случаем с пациентом, лечившимся в США методом генной терапии. Ему вводили аденовирус с геном орнитилкарбомоилтрансферазы, по которому у него был дефицит. После 4-й инъекции пациент погиб. Вскрытие показало атрофию всех внутренних органов за счет гибели клеток по типу апоптоза. Недостатки вирусных векторов заставляют генных инженеров изыскивать другие способы доставки генетических конструкций. Так появились невирусные векторы. Арсенал их довольно разнообразен – это ”голая ” плазмидная ДНК, катионные липосомы, искусственные макромолекулы, состоящие из углеводных адресных групп и сигнальных последовательностей, обеспечивающих поступление в клетки, введение генов в искусственных хромосомах, и др. Перечисленные векторы пытаются ввести так, чтобы обеспечить целевую доставку в клетки, где они будут экспрессироваться. Среди способов направленного введения векторов наиболее распространены следующие. Введение непосредственно в ткань (кожа, мышцы, тимус), введение в специальном баллончике непосредственно в сосуд для лечения ишемической болезни сердца, введение в виде аэрозолей для лечения болезней легких и т. д. Однако все перечисленные векторы и способы их введения имеют один главный недостаток – встраивание переносимой генетической информации происходит случайным образом. В идеале введение гена должно быть прицельным, т. е. сайт-специфическим, для замещения испорченного гена. С этой целью в настоящее время начинает применяться метод химеропластики. Делают шпильку – дуплекс, состоящий из комплементарных нуклеотидов ДНК и РНК. Ветви шпильки комплементарны участкам испорченного гена, а в петле, нуклеотид, который нужно заменить. Такие химеропласты доставляют в клетки (чаще всего в эмбриональные стволовые) с помощью липосом. В конструкции обязательно присутствует бактериальная рекомбиназа. Таким способом удается исправить до 40% клеток. Другой способ исправления гена основан на исключении экзона, в котором находится мутация. В некоторых случаях удаление из первичного транскрипта, содержащего стоп-кодон, но несущественного для функции белка, спасает ситуацию. Белок синтезируется, правда без соответствующего домена, и может выполнять основную функцию и при этой утрате. Для исключения экзона в клетки вводят короткие антисенс РНК, комплементарные участкам сплайсинга, чтобы экзон оказался сплайсированным. В последнее время особое внимание исследователей уделяется созданию векторов на основе искусственных хромосом млекопитающих. Благодаря наличию в них основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные гены и их регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена в нужной ткани и в должное время. ^ Наиблее успешна генная терапия при лечении наследственных дефектов метаболизма. Генно-терапевтическая стратегия облегчается в данных случаях тем, что для нормального существования организма необязателен 100 % уровень отсутствующего у больного фермента. Например, гемофилия В, развивается от недостаточности фактора свертывания крови IX, когда уровень его менее 1% от нормы. Если же этот уровень удается увеличить до 1-10%, больные чувствуют себя вполне удовлетворительно. Поэтому в этих случаях легче осуществить заместительную терапию. Первое успешное применение генной терапии связано с лечение ТКИД – тяжелого комбинированного иммунодефицита, обусловленного недостаточностью фермента аденозиндезаминазы (АДА). В сентябре 1990 года в Бетесде (США) четырехлетней девочке, страдающей этим заболеванием были пересажены ее собственные клетки – лимфоциты, в которые с помощью ретровируса был введен ген АДА. В результате наблюдалось улучшение состояния пациентки. Столь же успешным было лечение и другой такой же пациентки. Другой пример лечения заболевания из этой же группы болезней – наследственной гиперхолистеринемии. Дефект находится в гене, кодирующем рецептор липопротеинов низкой плотности. Следствие этого – гиперхолестеринемия, ранний атеросклероз, инфаркты миокарда. Для лечения у пациента провели частичное удаление ткани печени и в печеночные клетки с помощью ретровируса ввели генетическую конструкцию, содержащую ген нормального рецептора. Через воротную вену трансгенные клетки возвращены пациенту. Наблюдалось восстановление экспрессии рецептора. Это очень важный результат. Он показывает некую общую идею использования клеток печени для трансгенеза в виду ее особого значения для функционирования организма. Не зря наши предки считали печень (а не мозг) местом жизненной силы и управительницей эмоций. Клетки печени, которые синтезируют много важных белков, могут быть использованы для вставки генов, компенсирующих наследственные дефекты. Аналогично лечению наследственной гиперхолистеринемии, лечат гемофилию В. А вот с гемофилией А, болезнью королей и царей, дела обстоят сложнее из-за большого размера гена фактора свертывания крови VIII. Это препятствует встраиванию его в вирусный вектор. Но оказалось, что можно использовать укороченный ген. Тогда он кодирует белок без одного несущественного для проявления функции домена и обеспечивает терапевтический уровень фактора. В эксперименте достаточно хорошо разработаны молекулярно-генетические подходы к лечению миодистрофии Дюшенна (МДД). Это одно из частых наследственных заболеваний человека (1: 5000). Причиной его является мутация в гене дистрофина, структурного белка сарколеммы. Ген дистрофина – самый большой в геноме человека. Он содержит 85 экзонов и занимает 0,1 % ДНК клетки. Его молекулярная масса составляет 427 кD. Мутация в гене проявляется дегенерацией мышечных волокон скелетной мускулатуры, диафрагмы и сердца. Разработаны следующие приемы генной терапии МДД: Введение в мышцу в аденовирусном или ретровирусном векторе мини-гена дистрофина, который способен восстанавливать нормальный мышечный фенотип Невирусные способы доставки полноразмерного гена дистрофина прямой инъекцией, баллистической трансфекцией, в составе липосом и полимерных носителей Химеропластика, или генная хирургия, заключающаяся в трансфекции гибридными ДНК/РНК молекулами шпилечной структуры с нужным основанием, по которому планируется замена Исключение экзона путем трансфекции короткими антисмысловыми РНК, комплементарными сайтам сплайсинга первичного транскрипта, Это приводит к выбрасыванию экзона, несущего мутацию. При этом восстанавливается рамка считывания и образуется усеченный белок, способный выполнять функцию Дерепрессия аутосомного гомолога дистрофина – гена утрофина, продукт которго может компенсировать недостаток дистрофина Список наследственных заболеваний, находящихся на разных стадиях реализации метода генной терапии, пополняется с каждым годом. Он включает, помимо указанных выше, муковисцедоз, мышечную миодистрофию Дюшенна, фенилкетонурию, болезнь Гоше и др. Генной терапии подлежат и многие приобретенные заболевания. Среди них инфекционные болезни и злокачественные опухоли, хорея Геттингтона, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и др. К настоящему времени в мире более 3000 человек имеют в своем организме трансгенные клетки, введенные с целью лечения. Среди 396 одобренных для клинических испытаний протоколов геннотерапевтических проектов 60% направлены на лечение опухолей, 15% - инфекционных заболеваний, 15% наследственных заболеваний и 10% - прочих. |
||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям