Особенности апоптотической активности клеток костного мозга у больных хроническим миелолейкозом
|
|
Скачать 314.87 Kb.
|
|
На правах рукописи СЯСИНА Татьяна Владимировна ОСОБЕННОСТИ АПОПТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ 14.03.10 – клиническая лабораторная диагностика 14.01.21 ̶ гематология и переливание крови АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2012 Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И.Мечникова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Научные руководители: доктор медицинских наук профессор Козлов Антон Владимирович доктор медицинских наук профессор Бессмельцев Станислав Семенович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук доцент кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова АНТОНОВ Виктор Георгиевич; доктор медицинских наук профессор кафедры последипломного медицинского образования медицинского факультета Санкт-Петербургского Государственного университета БОГДАНОВ Александр Николаевич. ^ медицинский центр «ФГУЗ Центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова МЧС России». Защита состоится 27 ноября 2012 года в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.08 при ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д.6). С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М.Кирова» МО РФ. Автореферат разослан «____» октября 2012 года Ученый секретарь совета доктор медицинских наук, профессор Митин Юрий Алексеевич ^ Актуальность проблемы Хронический миелолейкоз (ХМЛ) представляет собой клональное миелопролиферативное заболевание, возникающее вследствие реципрокной транслокации t(9;22)(q34;ql1) между хромосомами 9 и 22. В результате данной транслокации на 22 хромосоме образуется химерный ген BCR-ABL, кодирующий синтез белка с высокой тирозинкиназной активностью [Pellicano F. et al., 2011]. Заболеваемость ХМЛ в мире составляет 1 – 2 случая на 100 тыс. населения [Ries L.A.G. et al., 2004]. Долгое время лечение заболевания оставалось малоэффективным и позволяло лишь несколько снизить объем опухолевой массы [Абдулкадыров К.М. и др., 1998]. Применение цитостатических препаратов (бусульфан, гидроксимочевина) позволило увеличить выживаемость больных в среднем до 3-5 лет в хронической фазе болезни, не оказывая влияния на продолжительность жизни в фазе акселерации и бластного криза [Fausel C., 2007]. Аллотрансплантация гемопоэтических стволовых клеток (аллоТГСК) стала важным этапом в лечении больных ХМЛ. Тем не менее, проведение аллоТГСК у большинства больных затруднено из-за высокого риска осложнений [Туркина А.Г. и др., 2003; Moen M.D. et al., 2007]. Новой эпохой в терапии больных ХМЛ стали препараты, обладающие способностью ингибировать реакции фосфорилирования специфических белков в опухолевой клетке. Один из представителей данной группы препаратов иматиниб – ингибитор BCR-ABL тирозинкиназы, в настоящее время является препаратом первой линии терапии у больных ХМЛ [Baccarani M. et al., 2009]. Несмотря на высокую эффективность иматиниба, у части больных не удается получить полный цитогенетический ответ. Другой проблемой является развитие невосприимчивости у определенной части больных. В связи с этим не теряет актуальности проблема поиска путей преодоления резистентности к препаратам, используемым для лечения ХМЛ, в частности к иматинибу [O’Hare T. et al., 2009; Eiring A.M. et al., 2011]. Торможение апоптоза является механизмом, путем которого опухолевые клетки приобретают устойчивость к лекарственным препаратам [Владимирская Е.Б., 2002]. Противоопухолевые эффекты иматиниба связывают с его способностью угнетать пролиферативную активность опухолевых клеток и восстанавливать апоптотическую активность клеток [Chomel J.C. et al., 2011]. Полагают, что иматиниб принимает участие в блокаде антиапоптотических сигналов не только на уровне протеинкиназ (тирозинкиназа BCR-ABL, c-Kit и PDGFR), но и на уровне сигнальных путей, подавляющих апоптоз, в частности RAS и STAT [Kantarjian H.M. et al., 2011]. В механизме действия иматиниба важная роль отводится его способности угнетать процессы обмена глюкозы опухолевыми клетками [Gottschalk S. et al., 2004]. Изучение апоптоза на клеточных культурах с помощью набора классических биохимических, микроскопических и современных методов (проточной цитометрии и полимеразной цепной реакции) позволило связать гибель опухолевых клеток с нарушением процессов утилизации глюкозы под влиянием иматиниба [Giuntoli S. et al., 2011]. Полагают, что он замедляет поступление глюкозы в клетку, способствует её перераспределению между различными метаболическими путями [Kominsky D.J. et al., 2009]. Тем не менее, механизмы вмешательства иматиниба в обмен глюкозы в опухолевых клетках выяснены недостаточно. Ряд авторов утверждают, что иматиниб эффективно подавляет метаболизм глюкозы, замедляет рост злокачественных клеток и угнетает их пролиферативную активность за счет индукции апоптоза [Cullinane C. et al., 2005; Giuntoli S. et al., 2011]. В экспериментах на клеточных культурах было показано параллельное снижение активности Bcr-Abl, скорости поглощения глюкозы и увеличения апоптотической активности клеток [Barnes K. et al., 2005]. В то же время, остаются практически неизученными взаимоотношения между способностью злокачественных клеток к восстановлению апоптоза и потреблением ими глюкозы у больных хроническим миелолейкозом. Нет ответа на вопрос, могут ли быть использованы в диагностических и прогностических целях показатели апоптоза и потребления глюкозы клетками костного мозга как лабораторные маркеры для оценки эффективности лечения больных ХМЛ. Решение этого вопроса будет способствовать выбору наиболее целесообразных схем терапии, и в ряде случаев, индивидуализации терапии. ^ Изучить апоптотическую активность клеток костного мозга и их способность к поглощению глюкозы у больных хроническим миелолейкозом и оценить значимость этих лабораторных маркеров для диагностики и прогнозирования течения заболевания. ^
^ Впервые на достаточном клиническом материале, включающем 95 больных ХМЛ, в клетках костного мозга изучены апоптотическая активность и скорость поглощения глюкозы на фоне лечения иматинибом. Установлено, что способность клеток вступать в апоптоз и интенсивность поглощения глюкозы клетками костного мозга взаимосвязаны и значительно различаются в хронической фазе, фазе акселерации и бластного криза. Получены доказательства того, что минимальная скорость апоптотических реакций опухолевых клеток у нелеченных больных в хронической фазе и фазе акселерации существенно отличаются при сравнении с больными в фазе бластного криза, в то время как максимальная скорость поглощения глюкозы одинакова. Показано, что максимальная скорость апоптотических реакций и минимальное поглощение глюкозы клетками костного мозга наблюдается у больных в хронической фазе, находящихся в полной цитогенетической ремиссии. Получены новые данные о прогностическом потенциале апоптоза опухолевых клеток у больных хроническим миелолейкозом, леченных иматинибом. Изучение характера апоптотических реакций в клетках костного мозга по связыванию ими акридин оранжа в сочетании с количественной оценкой их способности поглощать глюкозу позволяет выделить больных с благоприятным ответом на проводимое лечение или прогнозировать дальнейшее развитие заболевания в фазу акселерации и бластного криза. ^ Полученные данные о прогностическом значении апоптоза клеток костного мозга диктуют целесообразность включения исследования скорости спонтанного и индуцированного апоптоза опухолевых клеток в сочетании с определением интенсивности потребления глюкозы в алгоритм обследования больных хроническим миелолейкозом. Использование результатов исследования апоптоза клеток костного мозга у больных хроническим миелолейкозом может способствовать раннему выявлению прогрессии заболевания и химиорезистентности, а также делению больных на группы риска, что важно для выбора адекватной терапии. Данные о характере апоптотических реакций в клетках костного мозга в сочетании с количественной оценкой их способности поглощать глюкозу позволяют выделить пациентов с неблагоприятным течением хронического миелолейкоза. ^
^ Результаты исследования используются в учебном процессе на циклах «Клиническая лабораторная диагностика», «Гематологические и общеклинические методы исследований» на кафедре клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздравсоцразвития России, кафедре гематологии и трансфузиологии в ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России», и работе поликлинического отделения и клинического отдела «Химиотерапии гемобластозов, депрессий гемопоэза и трансплантации костного мозга ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России». ^ Материалы диссертационного исследования были доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Сочи, 2010), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Современные проблемы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2011), юбилейной научно-практической конференции молодых ученых Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2011), Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая лабораторная диагностика в гематологии и службе крови» (Санкт-Петербург, 2011). ^ Опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 в изданиях, поименованных перечнем ВАК. Объем и структура диссертации. Работа изложена на 119 страницах и включает следующие главы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и практические рекомендации. Список литературы содержит 190 источников, из которых 31 отечественный и 159 зарубежных. Работа иллюстрирована 9 таблицами, 11 рисунками, 1 микрофотографией. ^ В исследование включили 95 пациентов с Ph-позитивным хроническим миелолейкозом (ХМЛ), наблюдавшихся и проходивших лечение в двух лечебных учреждениях г. Санкт-Петербурга – в ФГБУ "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства" и в ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Представленная в работе информация основана на результатах изучения костного мозга больных ХМЛ в хронической фазе заболевания (68 чел.), фазе акселерации (15 чел.) и фазе бластного криза (12 чел.). При поступлении или очередном наблюдении, а так же в динамике на фоне лечения обследование всех больных включало данные анамнеза, объективного и лабораторного обследования: показатели периферической крови (с подсчетом лейкоцитарной формулы и определения количества тромбоцитов), исследование костного мозга с подсчетом миелограммы, цитогенетический анализ клеток костного мозга, молекулярно-генетическое исследование, оценка размеров печени и селезенки. Все больные были разделены на шесть групп в зависимости от фазы заболевания и ответа на терапию:
Возраст больных колебался от 18 до 78 лет, большинство – лица среднего возраста (40 - 65 лет). Средний возраст больных в хронической фазе составлял: в 1-й группе (первичные) – 43 года, во 2-й группе (ПГО) – 52,5 года, в 3-й группе (МЦО) – 39 лет и в 4-й группе (ЧЦО, ПЦО) – 42 года. У больных в фазе акселерации и в фазе бластного криза средний возраст равнялся 50 и 55,5 годам, соответственно. Соотношение мужчины: женщины составило 54:41. Цитогенетическое определение Ph хромосомы в клетках костного мозга было выполнено всем больным. В 4-й группе (ЧЦО, ПЦО) Ph-позитивные клетки были обнаружены только у 15 больных из 29. В остальных группах Ph-позитивные клетки были выявлены у всех больных. У больных, достигших гематологической ремиссии: 2-я (ПГО), 3-я (МЦО) и 4-я (ЧЦО, ПЦО) группы, жалоб не было, спленомегалии и гепатомегалии не обнаружено. Общее состояние их расценено, как удовлетворительное. У больных 1-й (первичные), 5-й (фаза акселерации) и 6-й (бластный криз) групп были жалобы на слабость, повышение температуры до субфебрильных цифр, потливость, потерю аппетита, боли в костях. Общее состояние пациентов 1-й и 5-й группы оценено, как средней тяжести и у пациентов 6-й группы как тяжелое. При пальпации у преобладающего числа больных этих групп было обнаружено увеличение селезенки (край селезенки выступал из-под реберной дуги на 1 – 4 см) и печени (край печени выступал из-под реберной дуги на 1 – 3 см). Диагноз ХМЛ и фазу заболевания устанавливали на основании результатов клинического анализа крови, морфологического, цитогенетического и молекулярного исследования аспирата костного мозга. Патологию кариотипа клеток оценивали в соответствии с Международной номенклатурой дифференциально окрашенных хромосом ISCN (1995) [Mitelman F., 1995]. Диагноз хронической фазы, фазы акселерации и бластного криза ставился на основании критериев ВОЗ [Yin C.C., Medeiros L.J., Bueso-Ramos C.E., 2010]. Эффективность лечения оценивали согласно рекомендациям European LeukemiaNet по лечению ХМЛ иматинибом и ингибиторами тирозинкиназ II поколения [Baccarani M., Cortes G., at al., 2009]. Полноту гематологической и цитогенетической ремиссии определяли по гематологическому ответу (ПГО) и цитогенетическому ответу (ЦО) [Baccarani M., Saglio G. at al., 2006]. Преобладающее количество больных находилось в хронической фазе заболевания – 71,6%. К ним относятся впервые выявленные больные ХМЛ и больные, достигшие гематологической и цитогенетической ремиссии, разной степени выраженности. Число больных в фазе акселерации равнялось 15,8%, а в фазе бластного криза – 12,6%. В периферической крови у больных ХМЛ 2-й (ПГО), 3-й (МЦО) и 4-й (ЧЦО, ПЦО) группы достоверных отличий по количеству лейкоцитов, гранулоцитов, тромбоцитов и концентрации гемоглобина не выявлено. Нарушений клеточного состава и присутствия незрелых форм клеток гранулоцитарного ростка не было обнаружено, что соответствует установленным критериям достижения полного гематологического ответа. У больных 1-й (первичные), 5-й (фаза акселерации) и 6-й (бластный криз) группы было зафиксировано достоверное увеличение (p<0,05) числа лейкоцитов, гранулоцитов, снижение концентрации гемоглобина, тромбоцитоз (в 1-й и 5-й группе) и тромбоцитопения (в 6-й группе). Максимальное количество лейкоцитов и самая низкая концентрация гемоглобина были обнаружены в 6-й группе больных в фазе бластного криза. Так же у пациентов 1-й, 5-й и 6-й группы при подсчете клеток обнаружен сдвиг лейкоцитарной формулы влево до бластных форм гранулоцитов. Таким образом, наличие эозинофильно-базофильной ассоциации и бластных клеток в разном количестве послужили диагностическим критерием для определения фазы заболевания ХМЛ. Результаты подсчета миелограммы больных ХМЛ, включенных в исследование, представлены в таблице 1. Таблица 1 Показатели миелограммы
Как видно из представленных в таблице 1 данных, нарушение миелокариоцитопоэза наблюдается у всех пациентов 1-й группы (первичные), 5-й группы (фаза акселерации) и 6-й группы (фаза бластного криза). У пациентов 2-й (ПГО), 3-й (МЦО) и 4-й (ЧЦО, ПЦО) нарушений в миелограмме не было обнаружено. В хронической фазе заболевания повышение числа бластных клеток отмечалось у больных 1-й группы (впервые выявленные), 5-й (фаза акселерации) и 6-й (фаза бластного криза). Максимальное значение бластных клеток наблюдалась у пациентов 6-й группы в бластном кризе и составило в среднем 47,1±10,1%. Повышение уровня промиелоцитов отмечалось у больных 1-й, 5-й и 6-й групп. У больных 2-й, 3-й и 4-й группы в хронической фазе заболевания определялись нормальные значения лейкоэритроидного соотношения: 4,1:1, 3,8:1 и 3,5:1. У больных 1-й группы было обнаружено повышение лейкоэритроидного соотношения до 10,3:1 и 13,0:1. У больных 5-й группы отношение лейко/эритро составило в среднем 11,8:1 (9:1 – 15:1), у больных 6-й группы – 19,8:1 (от 13:1 до 28:1), что значительно превышало аналогичный показатель в других группах. Большинство больных в хронической фазе находились на лечении иматинибом (гливек) 400 мг/сут. Часть больных получала гидреа (гидроксимочевина) 0,5-2 г/сут или α-интерферон (реаферон, роферон) 9-21 млн. ед./над. Больные в фазе акселерации и бластного криза были обследованы до начала терапии. Лечение больных в прогрессирующей стадии заболевания проводилось иматинибом 600 мг/сут или малыми дозами цитозин-арабинозида 20 мг/м2/сутки в течение 14-21 дней). В фазе бластного криза использовался иматиниб (гливек) или программы химиотерапии «7+3» (при миелоидном варианте криза) и «CHOP» (при лимфобластном варианте). Лабораторные методы Подсчет миелограммы. Препараты костного мозга готовили непосредственно после получения материала. Подсчет миелограммы (500 клеток) проводили в световом микроскопе с увеличением в 630 раз после окрашивания по Майн-Грюнвальду-Романовскому-Гимза. Выделение клеток костного мозга. Костный мозг (1-2 мл) получали при стернальной пункции или трепанобиопсии подвздошной кости и помещали в 2 мл буферного раствора следующего состава (ммоль/л): NaCl – 119; KCl – 4,69; CaCl2 – 2,52; MgCl2 – 1,18; глюкоза – 5,5; KH2PO4 – 1,18; HEPES – 25; pH = 7,4 с добавлением 60 г/л раствора ЭДТА в соотношении 1/20 от объема костного мозга [Kizaki H. et al., 1990]. Не позднее, чем через 1 час после получения пунктата надосадочную жидкость осторожно наслаивали на раствор фиколла-верографина (2 мл) с относительной плотностью 1,077 г/мл [Boyum A., 1968; Клаус Дж., 1990]. После центрифугирования (40 минут при 1500 об/мин) отделяли клеточную фракцию, которую трижды отмывали раствором хлорида натрия (9 г/л). Выделенные клетки инкубировали при постоянном встряхивании пробирок (1 час при + 37оС) в буферном растворе из расчета 1 мл раствора на 106 клеток [Паньков В.Н., Рябов Н.В., 1985]. На каждом этапе выделения клеток костного мозга подсчитывали их количество в камере Горяева и определяли жизнеспособность по связыванию трипанового синего. Жизнеспособные клетки составляли в среднем 92-99% от их общего числа. Индукция апоптоза. Апоптоз индуцировали путем создания в среде инкубации дефицита глюкозы. Ее дефицит вызывали путем инкубации клеток костного мозга (в среднем, 4 • 106) в минимальном объеме (50 мкл) буферного раствора. Для оценки спонтанного апоптоза то же количество клеток инкубировали в 1 мл буферного раствора. Обе пробы выдерживали в термостате при температуре 37оС в течение 18 часов. После инкубации в обеих пробах определяли количество клеток, связавших акридин оранж (АО). Апоптотическую активность клеток костного мозга определяли с помощью метода флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии. Флуоресцентная микроскопия. Оценку связывания клеток с АО проводили по методу Е.Б. Ласунской [Ласунская Е.Б., Кравцов В.Д., Фрейдлин И. С.,1989; Черныш Н.Ю., 2002; Зимина В.А., 2003]. После инкубации клеток в буферном растворе 5 мкл пробы помещали на предметное стекло, смешивали с равным объемом раствора АО (100 мкг/мл), накрывали покровным стеклом и просматривали под масляной иммерсией. Микроскопию проводили непосредственно после приготовления препарата в люминесцентном микроскопе Leica DM4000B в ультрафиолетовом свете (светофильтр H3). Подсчитывали не менее 100 клеток в разных полях зрения. Оценивали процент клеток с типичными для апоптоза изменениями [Mekori Y.A., Oh C.K., 1993; Hibner U., Coutinho A., 1994]. Проточная цитофлуориметрия. Апоптотическую активность клеток костного мозга определяли по связыванию клетками антител, меченных флюоресцеин изоцианатом (FITC), к аннексину V (аннексин V+ клетки). Краситель пропидий йодид (PI) употребляли в качестве маркера жизнеспособности клеток (аннексин V ̶ PI ̶ клетки) и клеточного некроза (аннексин V ̶ PI+ клетки). Интенсивность флюоресценции оценивали с помощью анализатора Beckman Coulter Cytomics FC500. Использовали набор реактивов ANNEXIN V-FITC APOPTOSIS DETECTION KIT I («BD Pharmingem™», США). Определение концентрации глюкозы в среде инкубации. О скорости поглощения глюкозы судили по её убыли в среде инкубации через 18 часов. Содержание глюкозы в инкубационной среде оценивали глюкозооксидазным методом, используя реактивы фирмы «Biosub® GLU». Результаты представляли в виде количества поглощенной за 18 часов глюкозы (мкмоль/106 клеток костного мозга). Кариотипирование клеток костного мозга проводили в цитогенетической лаборатории Российского НИИ гематологии и трансфузиологии Санкт-Петербурга, руководитель д.б.н. Мартынкевич И.С. Дифференциальное окрашивание проводили по методу GTG (дифференциальная G-окраска) [Паткин Е.Л. и соавт., 1992]. Препараты анализировали с учетом рекомендаций Международной классификации хромосом ISCN (1995) [Mitelman F., 1995]. Статистическая обработка и построение диаграмм проводили с помощью пакета «Statistica 6.0» и электронных таблиц «Excel». В тексте и таблицах значения представлены в виде Х±m. Для всех имеющихся выборок данных была проведена проверка нормальности распределения по критерию Колмогорова-Смирнова. В случаях, когда гипотеза нормальности отвергалась, показатель достоверности р рассчитывали на основе ранговых непараметрических критериев Вилкоксона и Манна-Уитни. В остальных случаях расчёт проводили с помощью критерия Стьюдента и парного Т-критерия. Выявление связи между параметрами осуществлялось на основе линейного корреляционного анализа с расчетом коэффициента корреляции (r). Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы р принимался равным 0,05. Автор приносит искреннюю благодарность коллективу клинико-диагностической и цитогенетической лаборатории Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии (Санкт-Петербург), коллективу иммунологической лаборатории ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И.Мечникова Минздравсоцразвития России и сотрудникам центра лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный медицинский Университет имени академика И. П. Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации за помощь и содействие при выполнении данной работы. ^ Сравнение результатов определения апоптоза методом проточной цитометрии и люминесцентной микроскопии. Апоптоз в клетках костного мозга изучали с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии на гетерогенной популяции клеток костного мозга, выделенных у двух групп больных: больных 4-й группы (n=14), достигших ЧЦО и ПЦО и количеством бластных клеток от 0,2 до 2,4% и 6-й группы (n=6), находящихся в бластном кризе и количеством бластных клеток от 32 до 65,4%. Количество клеток, находящихся в апоптозе, выражали в процентах от общего числа клеток. Мононуклеарные клетки костного мозга идентифицировали на основе CD45 флюоресценции (CD45+ клетки). Недифференцированный клеточный пул анализировали по общему лейкоцитарному маркеру CD34 (CD34+ клетки).  Рис. 1. Связывание аннексина V и АО клетками костного мозга больных 4-й группы (хроническая фаза, ПЦО), (%). Из представленных на рисунке 1 данных следует, что при проточной цитометрии и люминесцентной микроскопии наибольшее количество клеток в состоянии спонтанного и индуцированного апоптоза приходится на гранулоцитарный пул. Количество клеток в состоянии спонтанного апоптоза (14,1%) в общеклеточном пуле при проточной цитометрии достоверно не отличалось (p>0,05) от результатов спонтанного апоптоза (11,0%) при люминесцентной микроскопии. Количество клеток в состоянии индуцированного апоптоза (23,8%) в общеклеточном пуле при проточной цитометрии достоверно не отличалось (p>0,05) от результатов, полученных при люминесцентной микроскопии (20,2%).  Рис. 2. Связывание аннексина V и АО клетками костного мозга у больных 6-й группы (бластный криз), (%). Как следует из представленных на рисунке 2 данных, наименьшее количество клеток, находящихся в спонтанном и индуцированном апоптозе, (при проточной цитометрии) было обнаружено в гранулоцитарном клеточном пуле. Количество клеток в состоянии спонтанного апоптоза (4,2%) в общеклеточном пуле при проточной цитометрии достоверно не отличалось (p>0,05) от показателей спонтанного апоптоза при люминесцентной микроскопии (4,0%). Количество клеток в состоянии индуцированного апоптоза (4,6%) в общеклеточном пуле при проточной цитометрии достоверно (p>0,05) не отличалось от результатов индуцированного апоптоза при люминесцентной микроскопии (4,5%) . Результаты определения прироста числа клеток, вступивших в апоптоз, в условиях индукции представлены на рисунках 3 и 4.  Рис. 3. Прирост числа клеток костного мозга, связывающих аннексин V и АО, у больных 4-й группы (хроническая фаза, ПЦО), в условиях индукции апоптоза, (%). Из данных, представленных на рисунке 3, следует, что прирост числа клеток в апоптозе в условиях индукции в гранулоцитарном и общеклеточном пуле при проточной цитометрии не отличался у больных 4-й группы (хроническая фаза ПЦО) (p>0,05). По приросту числа клеток в апоптозе в условиях индукции в общеклеточном пуле результаты и проточной цитометрии и люминесцентной микроскопии не различались (p>0,05). У больных 6-й группы (бластный криз) (рис.4) различий по величине прироста числа апоптотических клеток в условиях индукции в гранулоцитарном, общеклеточным пуле при проточной цитометри и общеклеточным пулом при люминесцентной микроскопии не было обнаружено (p>0,05). Поскольку при проведении корреляционного анализа данных, полученных с помощью обеих методик, была обнаружена высокая зависимость на общеклеточном пуле в 4-й группе r = 0,96, в 6-й группе r = 0,83, в работе был использован метод люминесцентной микроскопии.  Рис. 4. Прирост числа клеток костного мозга, связывающих аннексин V и АО, у больных 6-й группы (фаза бластного криза) в условиях индукции апоптоза, (%). Акридинсвязывающая способность клеток костного мозга. Результаты определения количества клеток костного мозга, связывающих АО в условиях спонтанного и индуцированного апоптоза, представлены в таблице 2. Таблица 2 Связывание акридин оранжа клетками костного мозга в условиях спонтанного и индуцированного апоптоза, %
٭) достоверность различий по сравнению со значениями спонтанного апоптоза (p<0,005) 2,3,4,5,6) достоверность различий по сравнению со значениями других групп в столбце (p<0,005) Как следует из данных, представленных в таблице 2, при спонтанном апоптозе у больных 1-й группы количество клеток, связывающих АО, было достоверно ниже (p<0,005) значений 2-й, 3-й и 4-й групп больных и достоверно выше (p<0,005) по сравнению со значениями 5-й и 6-й группы. Максимальное количество клеток, связывающих АО, было обнаружено у больных 3-й и 4-й групп (хроническая фаза МЦО и ЧЦО, ПЦО). Минимальное количество клеток, связывающих АО, было обнаружено у больных 5-й и 6-й групп (фаза акселерации и бластного криза). В условиях индукции апоптоза во всех группах пациентов число клеток, связывающих АО, достоверно увеличилось по сравнению с числом клеток при спонтанном апоптозе. При этом у впервые выявленных больных (1-я группа) прирост числа клеток, связывающих АО при индукции апоптоза, было достоверно ниже по сравнению леченными больными 2-й, 3-й и 4-й группы. У больных 5-й и 6- групп (фаза акселерации и бластного криза) прирост числа клеток, связывающих АО в условиях индукции, был достоверно ниже по сравнению с группами больных ХМЛ в хронической фазе (1 – 4 группы). Восстановление способности клеток костного мозга к апоптозу в ходе лечения ХМЛ. Данные о приросте числа клеток, связавших АО в условиях индукции, представлены на рисунке 5. Из данных, представленных на рисунке 5, следует, что прирост числа клеток, связывающих АО в ответ на индукцию апоптоза, достоверно отличался во всех группах: в 1-й группе (первичные) был ниже (p<0,005) по сравнению со значениями 2-й (ПГО), 3-й (МЦО) и 4-й (ЧЦО, ПЦО) групп больных и выше (p<0,005) по сравнению со значениями 5-й (фаза акселерации) и 6-й (фаза бластного криза) группы больных. При сравнении групп максимальный прирост числа клеток, связывающих АО в условиях индукции апоптоза, был определен у больных, достигших ЧЦО и/или ПЦО. Минимальный прирост – достоверно определен у больных в фазе бластного криза.  Рис. 5. Прирост числа клеток костного мозга, связывающих АО в условиях индукции апоптоза, %. Полученные данные позволяют сделать ряд заключений: – клетки костного мозга больных 5-й группы (фаза акселерации) и 6-й группы (фаза бластного криза) практически не способны в условиях индукции вступать в апоптоз; – прирост числа клеток, связывающих АО в условиях индукции, у больных 1-й группы (впервые выявленные), 5-й группы (фаза акселерации) и 6-й группы (бластный криз) ниже соответствующих значений у больных 2-й (ПГО), 3-й (МЦО) и 4-й (ЧЦО, ПЦО) группы. Это указывает на то, что в клетках костного мозга не леченных больных в хронической фазе существует устойчивость к проапоптотическим сигналам; – определение в динамике числа клеток, связывающих АО, в костном мозге у больных ХМЛ позволяет выделить группу пациентов с положительным ответом на химиотерапию. Таким образом, по мере лечения и улучшения гематологических и клинических данных, происходит восстановление способности клеток костного мозга вступать в апоптоз как в условиях спонтанного, так и индуцированного апоптоза. Обнаружение того, что максимальная способность клеток костного мозга вступать в апоптоз выявлена у больных 4-й группы (ПЦО), может указывать на то, что определение в динамике способности клеток к восстановлению апоптоза может быть использовано в качестве критерия оценки эффективности терапии. Потребление глюкозы клетками костного мозга у больных ХМЛ. Данные о поглощении глюкозы клетками костного мозга у больных ХМЛ в разных фазах заболевания представлены на рисунке 6.  Рис.6. Потребление глюкозы клетками костного мозга в условиях инкубации, мкмоль/106кл. Как следует из представленных данных на рисунке 6, клетки костного мозга у больных 1-й группы (первичные) и 5-й группы (фаза акселерации) не отличались по скорости поглощения глюкозы. Максимальная скорость поглощения глюкозы была выявлена у больных 6-й группы (фаза бластного криза) по сравнению с 1-й группой (p<0,05). Сравнимое по скорости поглощение глюкозы было выявлено у больных 2-й группы с ПГО и у больных 3-й группы с МЦО (p>0,05). Минимальное потребление глюкозы клетками костного мозга у больных ХМЛ было обнаружено в 4-й группе больных с ЧЦО или ПЦО. На рисунке 7 представлены взаимоотношения между апоптозом, поглощением глюкозы, бластными клетками и Ph(+) клетками в костном мозге больных ХМЛ в разных фазах заболевания.  Рис.7. Поглощение глюкозы, скорость апоптоза, содержание бластных клеток и Ph(+) клеток у больных ХМЛ в разных фазах заболевания.О   сь Y1: Потребление глюкозы клетками КМ, %  Количество промиелоцитов в КМ,%  Количество бластов в КМ, %О   сь Y2: Прирост числа клеток, связывающих АО, в условиях индукции, %Из рисунка 7 следует, что на фоне минимальной апоптотической активности, высокого содержания бластных клеток и повышенного числа промиелоцитов обнаружена максимальная скорость поглощения глюкозы клетками костного мозга (группа 6). У больных 1-й, 5-й и 6-й групп количество бластов и промиелоцитов было достоверно выше значений 2-й, 3-й и 4-й групп (p<0,05) и составляло: в 1-й группе – 2,2±0,4% и 6,0±1,6%, в 5-й – 12,3±1,4% и 8,1±1,8% и в 6-й – 47,1±10,1% и 7,3±2,2%, соответственно. Достижение ПГО сопровождается достоверным нарастанием апоптотической активности, уменьшением количества бластных клеток и промиелоцитов до нормальных значений (1,5% и до 2,5%, соответственно) и значимым снижением скорости потребления глюкозы с 0,67 до 0,39 мкмоль/106кл. Была выявлена высокая степень корреляции между снижением числа бластов, промиелоцитов и потреблением глюкозы r=0,73 и r=0,69, соответственно. Эти данные могут указывать на то, что основными потребителями глюкозы являются бласты и промиелоциты. Как видно из представленных данных, больные 2-й (хроническая фаза ПГО) и 3-й группы (хроническая фаза МЦО) достоверно (p<0,005) отличались по интенсивности апоптоза (5,6% и 7,4%), но были сравнимы по количеству поглощенной клетками глюкозы (0,39 и 0,29 мкмоль/106кл, соответственно) и гематологическим показателям (% бластных клеток – 1,5±0,4 и 1,1±0,5 и промиелоцитов – 2,5±1,0 и 2,6±0,8 в костном мозге). Содержание Ph-позитивных клеток составляло: у больных 2-й группы – 100%, 3-й группы – от 36% до 86%. В 4-й группе (ЧЦО, ПЦО) апоптоз был максимальным, поглощение глюкозы опускалось до минимума (0,16 мкмоль/106кл), и было достоверно ниже по сравнению с другими группами (p<0,005). У больных с ЧЦО количество Ph(+) клеток в костном мозге колебалось от 6% до 26%, у больных с ПЦО Ph(+) клетки не были обнаружены. Это представляло собой основной отличительный признак данной группы больных от других групп. Полученные данные мы расцениваем как существование зависимости между скоростью потребления глюкозы клетками костного мозга и количеством Ph-позитивных клеток. Коэффициент корреляции между скоростью потребления глюкозы клетками костного мозга и количеством Ph-позитивных клеток составил r = 81. Существование подобной зависимости указывает на более сложные взаимоотношения между мерой злокачественности клетки и потреблением ею глюкозы. Таким образом, по мере улучшения гематологических и клинических данных у больных ХМЛ происходит снижение скорости поглощения глюкозы и нарастание апоптотической активности в клетках костного мозга. Это указывает на то, что оценка этих показателей в динамике может быть использована в качестве критерия эффективности терапии. ВЫВОДЫ 1. Апоптотическая активность клеток костного мозга и их способность поглощать глюкозу являются лабораторными маркерами, характеризующими ответ опухолевых клеток больных хроническим миелолейкозом на действие направленной терапии. 2. Апоптотическая активность опухолевых клеток в хронической фазе хронического миелолейкоза при положительном ответе на проводимое лечение достоверно увеличивается, в то время как их способность поглощать глюкозу уменьшается. При достижении полного цитогенетического ответа у больных, получающих иматиниб, наблюдается максимальное ускорение процессов спонтанного и индуцированного апоптоза. 3. У больных в фазе акселерации и бластного криза выявляется резкое замедление апоптотических реакций, как при спонтанном, так и индуцированном апоптозе на фоне выраженного поглощения глюкозы. 4. Обнаружение низкого числа клеток, связывающих акридин оранж, на фоне высокой скорости поглощения глюкозы, позволяет отнести этих больных в прогностически неблагоприятную группу и, наоборот, при высоком количестве клеток и низком уровне поглощения глюкозы вероятность достижения цитогенетической ремиссии хронического миелолейкоза достоверно выше. ^ 1. Определение количества клеток костного мозга, связывающих АО в сочетании с количественным определением поглощения глюкозы целесообразно использовать при диагностике хронического миелолейкоза в дополнении к стандартным методам исследования. 2. Обнаружение низкого числа клеток костного мозга, связывающих АО на фоне высокого поглощения глюкозы, позволяет отнести этих больных к прогностически неблагоприятной группе и, наоборот, при высоком количестве клеток, связывающих АО в сочетании с низким уровнем поглощения глюкозы прогнозировать вероятность достижения ремиссии. 3. Изучение количества акридин связывающих клеток костного мозга и степени поглощения ими глюкозы могут быть использованы для формирования групп риска больных хроническим миелолейкозом. ^
 |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям