Ученый секретарь
|
|
Скачать 0.7 Mb.
|
|
Таблица 2. Сравнение концентраций цитокинов в сыворотках крови и в содержимом верхнечелюстных пазух носа у пациентов ХГРС
Примечание: концентрации цитокинов в содержимом пазух носа достоверно отличаются от сыворотки крови: ** - р < 0,01, *** p < 0,001. Парный Т-тест Стьюдента. Норма – условно здоровые доноры, n=42.
Нейтрофилы являются основным типом клеток в содержимом пазух при ХГРС, поэтому было важно провести оценку их функциональной активности. Результаты сравнительной оценки фагоцитарной функции нейтрофилов в крови и в очаге воспаления продемонстрировали, что происходит резкое снижение функциональных показателей нейтрофилов, полученных из пазух носа, по сравнению с нейтрофилами периферической крови у одних и тех же пациентов, а также при сравнении с нормальными значениями (таблица 3). Значения фагоцитарного числа в крови у пациентов с ХГРС даже превышало нормальные значения, что, по-видимому, связано с обострением гнойно-воспалительного процесса. Таблица 3. Сравнение показателей фагоцитарной функции нейтрофилов, выделенных из крови и содержимого верхнечелюстных пазух носа у пациентов с ХГРС
Примечание: данные достоверно отличаются от периферической крови, *** p < 0,001, парный Т-тест Стьюдента. + p < 0,01, ++ - p < 0,001, данные отличаются от нормы. Норма – показатели фагоцитоза нейтрофилов в крови условно здоровых доноров. У здоровых людей в пунктатах из верхнечелюстных пазух в норме содержится 63% эпителиальных клеток, 28% нейтрофилов, 9% моноцитов и <1% эозинофилов и тучных клеток (Demoly P., et al., 1994). При острых респираторных инфекциях наблюдается выраженная нейтрофильная инфильтрация в слизистой оболочке пазух носа (Bachert C., 1998), что согласуется с полученными нами результатами. У изученных нами пациентов преобладающим типом клеток в содержимом верхнечелюстных пазух являлись нейтрофилы, они составляли в среднем около 84% клеток. Однако, несмотря на большое количество нейтрофилов, очищение очага воспаления было малоэффективным из-за снижения показателей фагоцитарной функции нейтрофилов в пазухах. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что при хроническом гнойном процессе в верхних дыхательных путях происходят изменения продукции цитокинов, функциональных и количественных параметров клеток иммунной системы, при этом нарушения в наибольшей степени выражены в очаге воспаления. Для того чтобы выявить зависимость локальной продукции цитокинов от активности, а также от тяжести заболевания, у пациентов с гнойно-деструктивными заболеваниями легких проводили измерение цитокинов параллельно в содержимом, получаемом из очага деструкции и в сыворотке крови. Исследование уровней цитокинов проведено у 40 пациентов с гнойно-деструктивными заболеваниями легких и плевры. Результаты показали, что у пациентов с острыми абсцессами легких в полости абсцесса выявлялись IL-1, IL-8 и TNF-, при этом концентрации IL-1 и IL-8 в полости превышали уровни в сыворотках крови. У пациентов с абсцессами легких, находящихся в периоде выздоровления, концентрации IL-1 и IL-8 были значительно ниже, чем у пациентов с острыми абсцессами легких (рис. 2).  Рисунок 2. Уровни провоспалительных цитокинов у пациентов с абсцессами легких на разных этапах протекания гнойно-деструктивного заболевания.. Примечание: различия достоверны * - р<0,05 между группами, + - p<0,05 по сравнению с уровнем в сыворотке крови. При оценке локальной продукции цитокинов у пациентов с ограниченным очагом гнойного воспаления (абсцесс легкого) и у пациентов с эмпиемой плевры было обнаружено, что при эмпиеме плевры средний уровень IL-1 в 7,6 раза, а средний уровень IL-8 – в 11,6 раза превышали локальные уровни цитокинов при абсцессах легких (рисунок 3). При этом локальные уровни IL-1 были значительно выше, чем его концентрации в сыворотках крови пациентов.  Рисунок 3. Содержание провоспалительных цитокинов в очаге деструкции и в сыворотке крови пациентов с гнойно-деструктивными заболеваниями легких. Примечание: различия достоверны **- р<0,01 между группами, +- р<0,05, ++ р<0,01 по сравнению с уровнем в сыворотке крови. Несмотря на многочисленные исследования роли цитокинов при различных воспалительных процессах в легких, в литературе имеется весьма ограниченное количество сообщений, касающихся изучения продукции цитокинов при такой патологии, как гнойно-деструктивные заболевания легких и плевры. Полученные в исследовании результаты подтверждаются данными литературы, о том, что у пациентов с эмпиемой плевры в плевральной жидкости определяются высокие уровни IL-1 и IL-8, при этом концентрации IL-8 коррелируют с числом нейтрофилов и показателями местной воспалительной реакции (Antony V.B. et al., 1993; Braaddus V. et al., 1992; Silvia-Mejias C. et al., 1995). Таким образом, продукция провоспалительных цитокинов в очаге деструкции находилась в зависимости от стадии и активности процесса воспаления, а также от тяжести гнойно-деструктивного процесса в легких. Было проведено исследование особенностей продукции провоспалительных цитокинов при еще одной форме локального воспалительного процесса – при флегмонах. Проводили сравнительный анализ уровней цитокинов в раневой жидкости при осложненном течении раневого процесса. Группы включали 34 человека с флегмонами челюстно-лицевой области (ЧЛЛ) и 15 человек с операционными, не осложненными инфекцией, ранами той же локализации. Результаты показали, что у 100% пациентов с флегмонами ЧЛЛ определяются IL-1β, IL-1α и IL-8 (рис. 4). В жидкости, полученной из не осложненных ран, также детектированы провоспалительные цитокины, но при этом уровни цитокинов являлись более низкими и определялись не у всех пациентов. Так, IL-1β выявлялся в 20% случаев, IL-1α – в 67% случаев, IL-8 – в 60% случаев. Различия между группами были статистически достоверными (p<0,05). Цитологическое исследование показало, что при флегмонах ЧЛЛ наблюдается преимущественно воспалительный тип цитограмм. В раневом очаге сохранность клеток была 76,58 ± 3,07%. Нейтрофилы составляли преобладающую популяцию клеток в раневой жидкости 90,13 ± 1,08%, 4,86 ± 0,73% приходилось на лимфоциты, макрофаги составляли 3,39 ± 0,50%, фибробласты наблюдались только у трети пациентов в незначительных количествах 1,03 ± 0,29%. Таким образом, у пациентов с флегмонами ЧЛЛ происходит увеличение продукции IL-1β, IL-1α и IL-8, при этом в чистых операционных ранах той же локализации концентрации цитокинов повышаются значительно меньше, чем при флегмонах ЧЛЛ.  Рисунок 4. Уровни цитокинов в раневой жидкости при флегмонах ЧЛЛ и в хирургических ранах. Примечание: различия между группами достоверны * p < 0,05, ** p < 0,01. Кроме оценки уровней цитокинов методам ИФА, при воспалительных процессах проводилось изучение местной продукции цитокинов методом иммуногистохимии. Иммуногистохимическое исследование наиболее точно отражает ситуацию in vivo и позволяет идентифицировать, локализовать и подсчитать клетки, продуцирующие цитокины. Материалом для исследований служили биоптаты глоточных миндалин, полученные в ходе операций у 42 детей с хроническим лимфопролиферативным синдромом с гипертрофией глоточной миндалины 2-3 степени. В зависимости от выявленной инфекции дети были разделены на три группы. В первую группу вошли 16 детей, у которых установлена герпесвирусная (ВЭБ, ЦМВ) инфекция. Вторую группу составили 15 детей, у которых выявлено инфицирование -гемолитическим стрептококком. Третью группу составили 11 детей, у которых не обнаружили маркеры данных инфекций. Было показано, что цитокины выявлялись главным образом в макрофагах, а распределение клеток, продуцирующих цитокины, на срезах совпадало с распределением CD68+ макрофагов. Цитокины также выявлялись в нейтрофилах. Подсчитывали активность продукции цитокинов в баллах: 0 баллов – продукция не выявлена; 1 балл – низкая активность продукции, 2 балла – умеренная, 3 балла – высокая. При герпесвирусной инфекции продукция провоспалительных цитокинов наблюдалась только у 25-75% детей. Количество клеток, продуцирующих цитокины в ткани глоточной миндалины, у детей в данной группе было наиболее низким по сравнению с другими группами (рис. 5). При стрептококковой инфекции активность продукции цитокинов была максимальной из данных трех групп, частота выявления составила 94-100% случаев. У детей, у которых не выявили маркеров герпес-вирусной или стрептококковой инфекции, продукция  Рисунок 5. Количество клеток, продуцирующих цитокины в ткани глоточной миндалины, у детей с хроническим лимфопролиферативным синдромом. Примечание: различия достоверны * - р < 0,05 I и II группы, ** - p < 0,05 I и III группы, + - p < 0,05 II и III группы. цитокинов выявлялась в 91-100% случаев, а активность продукции была промежуточной между первой и второй подгруппами. Таким образом, продукция цитокинов в глоточной миндалине у детей с хроническим лимфопролиферативным синдромом зависела от наличия вирусной или бактериальной инфекции. Результаты исследования подтверждаются данными, согласно которым продукция цитокинов выявлялась в миндалинах у детей с тонзиллитами и гипертрофией миндалин (Agren K.al., 1996; Kim J., et al., 2009). ^ Провоспалительные цитокины могут быть рассмотрены как важные факторы развития и прогноза течения гастродуоденальных заболеваний, в том числе связанных с инфекцией H.pylori (НР), у детей. Оценка продукции IL-1β и IL-8 в СОЖ проведена у 33 детей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями. Диагностика инфекции НР проводилась с использованием комплекса методов, включавшего бактериологическое исследование, оценку уреазной активности и серологическую диагностику. Инфекция НР была подтверждена у 20 детей из 33 (основная группа), остальные 13 детей (39,4%) были признаны неинфицированными (группа сравнения).  Рисунок 6. Исследование продукции IL-1β и IL-8 в биоптатах СОЖ у детей методом иммуногистохимии. Приведена частота выявления продукции IL-1β и IL-8 (количество детей в %, у которых выявлялась продукция цитокинов). * - различия между группами достоверны, p<0,05. Иммуногистохимическое исследование продукции цитокинов показало, что IL-1β и IL-8 выявляются в цитоплазме лейкоцитов, которые инфильтрировали собственную пластинку СОЖ. Был проведен сравнительный анализ продукции провоспалительных цитокинов в клетках СОЖ в зависимости от наличия или отсутствия инфекции HР. Относительное количество детей, у которых выявлялась продукция IL-1β и IL-8, было выше в основной группе, в которой дети были инфицированы НР, чем в группе сравнения (рис. 6). Таким образом, продукция провоспалительных цитокинов IL-1β и IL-8 клетками СОЖ может служить маркером инфицирования НР и протекания воспалительного процесса у детей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями. Литературные данные, касающиеся особенностей продукции провоспалительных цитокинов в СОЖ у детей, немногочисленны. У детей длительность течения инфекции HP меньше, чем у взрослых пациентов, поэтому иммунопатологический ответ при инфицировании НР отличается (Ernst P.B., 1999). Исследования продукции цитокинов, изученные разными методами, показали увеличение локальной продукции цитокинов у детей, инфицированных HP (Shimizu T., 2004, Guiraldes E., 2001 Bontems P., 2003, Dzierzanowska-Fangrat K., 2008), что подтверждает данные, полученные в работе. Проведенные единичные иммуногистохимические исследования, показали увеличение продукции IL-8 эпителиальными клетками при инфицировании HP (Camorlinga-Ponce M.С., 2003). ^ Исследование выполнено на модели полнокожных ран у мышей, моделирование осложненного течения раневого процесса проводили с использованием гидрокортизона (ГК). У мышей введение 25 мг/кг ГК ежедневно в течение всего опыта приводило к замедлению заживления ран по сравнению с нормой, начиная с 3-го дня после нанесения ран. Под влиянием ГК эпителизация ран снижалась, начиная с 3-го дня и на всех сроках наблюдения, а плотность грануляционной ткани значительно уменьшалась на 3-и и 5-е сутки опыта. Нарушения заживления ран при введении ГК сопровождались снижением веса и показателей иммунитета мышей (веса селезенки мышей и количества спленоцитов, количества лимфоцитов в периферической крови), начиная с 3-х суток после начала введения ГК. Причины снижения скорости эпителизации ран могут быть связаны с влиянием ГК на синтез ростовых факторов для клеток эпителия, в частности, фактора роста кератиноцитов (KGF). Глюкокортикоиды ингибируют продукцию KGF, а также синтез IL-1, который может индуцировать синтез KGF (Brauchle M., et al., 1995; Werner S., 1998). При проведении исследований с применением мазевой формы IL-1 были получены следующие результаты. Планиметрическая оценка площадей ран показала, что применение IL-1 способствовало уменьшению площадей раневой поверхности, начиная с 3-го дня эксперимента и на всех последующих сроках наблюдения, по сравнению с плацебо (мазевая основа) (рисунок 7). Гистологическое исследование раневой области показало, что после применения мазевой формы IL-1 полностью восстанавливается нормальная архитектура ткани. Эпителизация раневой поверхности и образование грануляционной ткани при использовании IL-1 начинались раньше, чем при использовании плацебо. Происходит увеличение длины новообразованного эпителия под действием IL-1 на 7-е сутки по сравнению с плацебо (рис. 8А). На десятый день у мышей, у которых применяли IL-1, наступала полная или практически полная эпителизация, при этом у мышей, у которых применяли плацебо, полной эпителизации не наблюдали. Применение IL-1 приводило к увеличению количества клеток во вновь образованной грануляционной ткани по сравнению с плацебо на 5 и 9 дни опыта (рис. 8Б).  А БРисунок 7. Изменения в площадях ран у мышей, получавших ГК, после применения IL-1 или плацебо. ГК и IL-1 - сплошная линия, ГК и плацебо – пунктирная линия. (A) – аутбредные мыши, (Б) аутбредные SPF мыши (B) (n=3-50). Примечание: * - p<0.05, различия между группами достоверны. Электронно-микроскопическое исследование эпителия раневой области проводили у трех групп мышей, которым наносили раны: первой группе не вводили ГК и не применяли мази – нормальное заживление; второй вводили ГК и применяли мазевую форму IL-1, третьей вводили ГК и применяли плацебо. Результаты исследования показали, что в группе мышей, у которых применяли плацебо, наблюдалась замедленная элиминация бактерий и микромицетов из раны. Также действие ГК выражалось в подавлении синтетической и метаболической активности эпидермальных клеток, что подтверждалось уменьшением количества рибосом в них. Развитие межклеточных контактов в группе плацебо шло медленнее, чем в двух других группах. В группе мышей, которых лечили IL-1, ультраструктурные изменения в клетках сходны с изменениями в клетках при нормальном заживлении раны. Отсутствие физиологически активных форм  * А  БРисунок 8. Влияние IL-1 на эпителизацию и формирование грануляционной ткани. А) Эпителизация ран (n=5-10). Б) Плотность грануляционной ткани (n=4-5). Примечание: * - различия с группой плацебо достоверны, p<0.05. микроорганизмов указывало на восстановление местных факторов защиты под воздействием IL-1β. Наибольшие различия наблюдали на 8-е и 14-е сутки эксперимента. Таким образом, IL-1β способствовал ускорению процессов дифференцировки клеток в эпидермисе и интенсивному очищению раны от микроорганизмов.  А БРисунок 9. Вес селезенок (А) и относительное содержание нейтрофилов и лимфоцитов в периферической крови (Б) аутбредных мышей на фоне введения ГК и применения мази с IL-1 или плацебо (n=3-5). Было выполнено исследование влияния мазевой формы IL-1β на экспрессию белков плотных контактов (клаудина-1, окклюдина и ZO-1) в эпидермисе при заживлении ран у мышей. Изучение выполнено в тех же группах мышей, что и электронно-микроскопическое исследование. Было показано, что введение ГК приводит к снижению экспрессии белков плотных контактов в эпидермисе при заживлении раны на 8-е сутки. Местные аппликации мазевой формы IL-1 способствовали поддержанию экспрессии клаудина-1, окклюдина и ZO-1 на 8-е сутки. На 14-е сутки наблюдали полную эпителизацию ран при нормальном заживлении, а также в группе мышей, которых лечили IL-1. На этом сроке в группе мышей, у которых применяли IL-1, клаудин-1 и окклюдин обнаруживались только в поверхностных слоях новообразованного эпидермиса. Напротив, в группе мышей, у которых использовали плацебо, в гиперпролиферативной зоне все еще отмечалась интенсивная экспрессия клаудина-1 и окклюдина. Исследование веса и параметров иммунитета мышей проведено в процессе лечения мазевой формой IL-1. Изменения веса мышей, веса селезенок, количества спленоцитов, количества лейкоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов крови были практически одинаковыми в группах мышей, которых лечили IL-1 или плацебо (рис. 9). Таким образом, применение мазевой формы IL-1 приводило к позитивным изменениям в заживлении ран, не оказывая выраженного системного действия. В данном исследовании IL-1 был использован в виде мазевой формы с концентрацией цитокина 50 нг/мл. Основное преимущество мазевой формы состоит в постепенном высвобождении IL-1 в раневом очаге. Результаты нескольких исследований подтверждают, что IL-1 регулирует функции клеток соединительной ткани и кератиноцитов in vitro в диапазоне доз, включающем использованную нами концентрацию (Thornton S.C.,et al., 1990; Maas-Szabowski N., et al., 2000; Steude J., et al., 2002). В литературе находятся лишь единичные сообщения, касающиеся локального применения IL-1 при лечении ран кожи в экспериментах (Sauder D.N., et al., 1990; Vegesna V., et al., 1995). Эти результаты, указывающие на то, что IL-1 может стимулировать репаративные процессы в ранах, согласуются с полученными в данной работе доказательствами ранозаживляющей активности IL-1. ^ у пациентов с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами нижних конечностей Изучение ранозаживляющего действия мазевой формы рекомбинантного IL-1 человека проведено у пациентов с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами нижних конечностей на фоне хронической венозной недостаточности, варикозного расширения вен или сахарного диабета I и II типов. В контрольной группе применяли обычное лечение (мази «Солкосерил» и «Вульнузан» на гидрофобной основе). Цитологический анализ мазков-отпечатков был выполнен у 51 человека, функциональная активность нейтрофилов изучена у 39 человек. Исследования выполнялись до лечения, на 3-и, 7-е и 14-е сутки в динамике терапии. Цитологическое исследование мазков-отпечатков является показательным методом при изучении процессов заживления ран. До начала применения мазевой формы IL-1 отмечали признаки вялотекущего воспалительного процесса, что проявлялось небольшим количеством клеток и преобладанием в ране нейтрофилов в разной степени деструкции. Количество макрофагов и лимфоцитов было снижено, а фибробласты и эпителиальные клетки отсутствовали. Отмечено значительное количество микроорганизмов в ране, которые располагались внеклеточно. Данная цитологическая картина является типичной для длительно незаживающих ран (Сергель О.С., Гончарова З.Н., 1990; Костюченок Б.М., Карлов В.А., 1990). При применении мазевой формы IL-1 динамика цитологических показателей отражала положительные изменения в процессе заживления раны (табл. 4). Происходило увеличение количества клеток на раневой поверхности, постепенно снижалась доля нейтрофилов, возрастала доля макрофагов и клеток соединительной ткани в мазках-отпечатках из ран. Таблица 4. Цитологическое исследование мазков-отпечатков из длительно незаживающих ран у пациентов на фоне лечения мазевой формой, содержащей 50 нг/мл рекомбинантного IL-1 человека
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям