Анисимов сергей Владимирович Применение стволовых клеток при возрастной нейродегенеративной патологии
|
|
Скачать 0.75 Mb.
|
На правах рукописиАНИСИМОВ Сергей Владимирович Применение стволовых клеток ПРИ возрастной нейродегенеративной патологии (экспериментальное исследование) 14.01.30 - геронтология и гериатрия 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология А в т о р е ф е р а т диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Санкт-Петербург - 2011 Работа выполнена в Федеральном Центре сердца, крови и эндокринологии им. В.А.Алмазова», Геронтологическом исследовательском центре Национального института старения США (г. Балтимор, США) и Валленберговском Нейрологическом Центре Люндского Университета (г. Люнд, Швеция). ^ академик РАН, доктор биологических наук, профессор Никольский Николай Николаевич профессор, M.D., Ph.D. Брюндин Патрик (Швеция) ^ заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Кветной Игорь Моисеевич заслуженный деятель науки РФ, академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Скоромец Александр Анисимович доктор медицинских наук, профессор Имянитов Евгений Наумович ^ Учреждение Российской академии наук «Институт мозга человека им. Н. П. Бехтеревой» РАН Защита диссертации состоится "_____"____________2011 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3). Автореферат разослан "_____" ______________2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Козина Л.С. ^ Актуальность проблемы Проблема постарения населения, то есть, увеличение в структуре населения доли лиц пожилого возраста в последние десятилетия приобретает глобальный характер. Об актуальности проблемы старения для всего человечества свидетельствует разработанная по инициативе ООН «Программа по исследованиям старения в ХХI веке». Отдельный раздел этой программы посвящен изучению механизмов старения и связанных с ним заболеваний [Сидоренко А. и Эндрюс Г., 2000]. Среди этих заболеваний одно из важнейших мест занимают нейродегенеративные. Хотя нейродегенеративный процесс может быть обусловлен генетической патологией (наследственные метаболопатии), являться осложнением инфекционных заболеваний, травм или воздействия токсических факторов, важнейшее значение имеет широкая распространенность именно возрастной идиопатической нейродегенеративной патологии [Литвиненко И. В., 2006]. Тремя наиболее распространёнными нейродегенеративными заболеваниями в мире являются болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП), и болезнь [диффузных] телец Леви (БДТЛ), соответственно. Важно отметить, что в то время как для БА и БДТЛ характерна диссеминация нейродегенеративного процесса (с поражением нейронов коры головного мозга в целом), при БП нейродегенеративный процесс преимущественно локализован. Как хроническое неуклонно прогрессирующее заболевание ЦНС, БП сопровождается дегенерацией нигростриарных нейронов и нарушением функции базальных ганглиев. За исключением наследственных (ювенильных) форм, БП поражает лиц пожилого возраста, при этом заболеваемость и распространенность болезни Паркинсона неуклонно увеличиваются с возрастом: от ~1% среди людей старше 60 лет до ~2% среди людей старше 70 лет [Langston J. W., 1998]. Продолжительная (5-10 лет) фармакотерапия связана с появлением значимых побочных реакций и общим снижением эффективности действия. В связи с этим, в течение последних 18-20 лет производятся попытки создать принципиально новые методы лечения БП, - такие, как глубокая стимуляция головного мозга и заместительная клеточная терапия дофаминергическими нейронами донорского происхождения [Бехтерева Н. П. и др., 1990; Hitchcock E. R., et al., 1988; Lindvall O., et al., 1988; Madrazo I., et al., 1988]. Стволовые клетки (СК) разных типов способны служить ценным источником нейронов как субстрата клеточной терапии нейродегенеративных и иных заболеваний [Дыбан А. П. и Дыбан П. А., 2002; Никольский Н. Н. и др., 2007; Зинькова Н. Н. и др., 2007]. Наиболее перспективным субстратом заместительной клеточной терапии локализованной возрастной нейродегенеративной патологии считаются эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), однако существующие протоколы их дифференцировки в функциональные дофаминергические нейроны являются крайне длительными и чрезвычайно сложными технически [Carpenter M. K., et al., 2001; Kim J. H., et al., 2002]. Кроме того, сам механизм дифференцировки, то есть перестройки плюрипотентной ЭСК в высокоспециализированный нейрон является весьма сложным и в значительной степени необъяснённым [Iacovitti L., et al., 2007]. Для фактического применения данного подхода в клинической практике необходима разработка эффективного протокола, основанного на экспансии недифференцированных ЭСК in vitro, дифференцировки их в функциональные дофаминергические нейроны, а также обеспечение безопасности субъектов трансплантации (в первую очередь, с точки зрения развития злокачественной тератомы), поскольку пожилой и старческий возраст является фактором, способствующим промоции и прогрессии канцерогенеза. Важнейшими направлениями данного исследования являлись раскрытие механизмов пролиферации и дифференцировки ЭСК человека, а также обеспечение ксенологической и онкологической безопасности трансплантации и повышение её эффективности за счёт модификации протоколов дифференцировки и смены формата селекции пересаживаемого клеточного материала. ^ Изучить механизмы пролиферации и дифференцировки стволовых клеток, и разработать способ заместительной клеточной терапии локализованной, ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии в условиях эксперимента. ^ 1. Провести анализ возможности проведения клеточной терапии ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии и идентифицировать действенный субстрат клеточной терапии; 2. Выявить факторы, определяющие возможность эффективного размножения стволовых клеток в культуре in vitro; 3. Изучить возможность направленной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека в функциональные дофаминергические нейроны в культуре in vitro; 4. Разработать стандартизованный протокол, позволяющий получить из эмбриональных стволовых клеток человека оптимальное количество функциональных дофаминергических нейронов, пригодных для терапии, ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии; 5. Оценить влияние фактора роста фибробластов 20 (FGF-20) на клетки-предшественники дофаминергических нейронов; 6. Разработать технологию подготовки клеточного материала к трансплантации, обеспечивающую максимальную выживаемость пересаженных клеток и эффективность лечения ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии; 7. Разработать способ предотвращения развития злокачественной тератомы в сайте трансплантации клеточного материала при терапии, ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии; 8. Изучить эффекты трансплантации производных эмбриональных стволовых клеток человека лабораторным животным, модельным в отношении локализованной, ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии. ^ Выявлена биологическая роль фактора роста фибробластов 20 (FGF-20), который был идентифицирован ранее, но биологическая роль которого до сих пор оставалась неизвестной. В ходе проведения экспериментов по направленной дифференцировке чЭСК в нейроны in vitro было установлено, что фактор роста фибробластов 20 стимулирует дифференцировку и поддерживает выживаемость дофаминергических прогениторных клеток, что может способствовать повышению эффективности клеточной терапии ассоциированных с возрастом нейродегенеративных заболеваний. Впервые установлена существование обратной зависимости между временем пребывания чЭСК в культуре in vitro (пропорциональным доле постмитотических клеток в общем объеме гетерогенной популяции производных чЭСК) и риском развития злокачественной тератомы (тератокарциномы) в сайте трансплантации клеточного материала. Сформулирована концепция «окна возможности» проведения заместительной клеточной терапии локализованной возрастной нейродегенеративной патологии, в пределах которого в культуре in vitro можно получить достаточное количество дофаминергических нейронов-производных чЭСК, и при этом выживаемость донорских дофаминергических нейронов в ходе трансплантационной процедуры является приемлемой, а риск развития злокачественной тератомы (тератокарциномы) в сайте/сайтах трансплантации клеточного материала отсутствует, что особенно важно при последующем применении заместительной клеточной терапии у пациентов пожилого и старческого возраста. Разработан и использован в экспериментальной работе двухэтапный протокол направленной дифференцировки чЭСК в функциональные дофаминергические нейроны in vitro, который позволяет получить однородную популяцию содержащих такие клетки клеточных агрегатов, пригодных к трансплантации непосредственно, то есть без диссоциации. Разработана также техника трансплантации таких клеточных агрегатов. Установлено, что использование этой технологии многократно повышает выживаемость донорских дофаминергических нейронов в сайте трансплантации, одновременно полностью ликвидируя риск развития злокачественной тератомы (тератокарциномы) у реципиентов трансплантации. Разработана технология, позволяющая проводить эффективное размножение эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) в культуре in vitro (экспансию чЭСК) в сложных клеточных системах, основанных на применении фидерных клеток человеческого происхождения. Проведена комплексная оценка параметров транскриптомов стволовых клеток разных типов в сравнении с транскриптомами иных типов клеток (не стволовых). В результате проведенного анализа выявлены важные закономерности и идентифицирована панель молекулярных мишеней, играющих важную роль в контроле пролиферации и дифференцировки стволовых клеток. Разработана, запущена в опытное производство и начала применяться в экспериментальной биологии специализированная микрочиповая (микроматричная) платформа «NeuroStem» предназначенная для изучения транскриптома стволовых клеток человека в ходе дифференцировки в клетки нейрального/нейронального ряда. Данная микрочиповая платформа обладает рекордными характеристиками в отношении представленности на ней молекулярных мишеней, имеющих отношение к биологии дофаминергической системы, в значительной степени способствуя прогрессу в разработке надежных, безопасных и эффективных методов клеточной терапии ассоциированных с возрастом нейродегенеративных заболеваний. ^ Применение технологии размножения эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) в культуре in vitro (экспансии чЭСК) в сложных клеточных системах, основанных на применении фидерных клеток человеческого происхождения снижает влияние ксеногенных факторов на клетки человека, что снижает ксеногенные риски в случае практического применения производных этих клеток в формате клеточной терапии, понижает влияние ксеногенных факторов на параметры транскриптома и протеома клеток человека, что важно для верной интерпретации полученных научных результатов. Кроме того, применение для экспансии чЭСК клеток человеческого происхождения является значительно более удобным по сравнению с клетками мыши. Проведенный широкомасштабный анализ транскриптомов стволовых клеток разных типов в сравнении с транскриптомами иных типов клеток позволил идентифицировать панель молекулярных мишеней, играющих важную роль в контроле пролиферации и дифференцировки стволовых клеток. Отдельные молекулярные мишени из состава данной группы могут быть использованы в качестве мишени генной модификации клеток (с использованием технологии генной инженерии) для воздействия на процессы пролиферации и дифференцировки стволовых клеток разных типов, - в том числе в интересах генной и генно-клеточной терапии ассоциированных с возрастом заболеваний. Разработанная, апробированная и запущенная в производство специализированная микрочиповая (микроматричная) платформа «NeuroStem» позволяет с высокой производительностью и высоким качеством исследовать транскриптом стволовых клеток человека, нейронов и глиальных клеток разных типов, а также динамику транскриптома стволовых клеток человека в ходе дифференцировки в клетки нейрального/нейронального ряда. Это позволяет получать ценную информацию о фундаментальных механизмах, лежащих в основе жизнедеятельности стволовых клеток, нейронов, и их коммитированных предшественников. В свою очередь, это может иметь большое значение для идентификации новых диагностических, прогностических и терапевтических мишеней терапии ассоциированных с возрастом нейродегенеративных заболеваний. Применение фактора роста фибробластов 20 (FGF-20) в качестве добавки в составе питательной среды используемой для культивирования производных стволовых клеток человека in vitro в ходе их направленной дифференцировки в дофаминергические нейроны позволяет повысить эффективность исходного протокола, что определяет возможность получения из чЭСК большое количество жизнеспособных и функциональных дофаминергических нейронов для использования в исследовательской работе и в качестве субстрата заместительной клеточной терапии локализованной возрастной нейродегенеративной патологии. Установленная обратная зависимость между временем пребывания чЭСК в культуре in vitro и риском развития злокачественной тератомы (тератокарциномы) в сайте трансплантации клеточного материала, и сформулированная концепция «окна возможности» проведения заместительной клеточной терапии локализованной возрастной нейродегенеративной патологии позволили адаптировать существующие подходы к основанной на применении стволовых клеток терапии, минимизировав риск развития злокачественной тератомы (тератокарциномы) в сайте/сайтах трансплантации клеточного материала донорского происхождения. Разработанный и апробированный в эксперименте двухэтапный протокол направленной дифференцировки чЭСК в функциональные дофаминергические нейроны in vitro позволяет получить однородную популяцию содержащих такие клетки клеточных агрегатов, что даёт возможность избежать проведения этапа диссоциации клеток при проведении трансплантации. Использование такой технологии многократно повышает выживаемость донорских дофаминергических нейронов в сайте трансплантации, что открывает новые перспективы перед подходами к заместительной клеточной терапии локализованной возрастной нейродегенеративной патологии. Разработанная технология будет способствовать дальнейшему прогрессу в создании безопасных и удовлетворяющих клиническим требованиям патогенетически обоснованных методов лечения ассоциированных с возрастом заболеваний, сопровождающихся локализованным нейродегенеративным процессом. ^ 1. Сравнительный анализ ключевых биологических свойств стволовых клеток разных типов показывает, что эмбриональные стволовые клетки человека (чЭСК) являются наиболее адекватным субстратом для проведения заместительной клеточной терапии локализованной возрастной нейродегенеративной патологии. 2. Анализ транскриптомов стволовых клеток разных типов (в том числе недифференцированных и находящихся на различных этапах дифференцировки) с использованием технологии серийного анализа генетической экспрессии (SAGE) и микрочиповой технологии демонстрирует практическую невозможность действенной стимуляции дифференцировки стволовых клеток в функциональные дофаминергические нейроны методами генетической инженерии. 3. Разработана технология эффективной направленной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека в функциональные дофаминергические нейроны in vitro; впервые установлен вклад фактора роста фибробластов 20 (FGF-20) в дифференцировку и выживаемость дофаминергических прогениторных клеток. Применение FGF-20 позволило пятикратно повысить эффективность исходного протокола в приложении к выходу дофаминергических нейронов. 4. В экспериментальных моделях локализованной ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии установлено существование обратной зависимости между риском развития злокачественной тератомы и временем пребывания клеток в культуре in vitro. 5. Предложена концепция «окна возможности» проведения заместительной клеточной терапии локализованной возрастной нейродегенеративной патологии, в пределах которого выживаемость донорских дофаминергических нейронов является приемлемой, а риск развития злокачественной тератомы в сайте/сайтах трансплантации клеточного материала отсутствует. 6. Разработанный и использованный двухэтапный протокол направленной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека в функциональные дофаминергические нейроны in vitro позволяет получить однородную популяцию содержащих такие клетки клеточных агрегатов, пригодных к трансплантации непосредственно, без диссоциации. Использование этой технологии более чем в 5 раз повышает выживаемость донорских дофаминергических нейронов в сайте трансплантации, одновременно полностью устраняя риск развития злокачественной тератомы у реципиентов. ^ Основные результаты исследований и положения диссертационной работы, выносимые на защиту, были представлены и доложены на следующих научных конференциях, съездах и практикумах: III, V, VI Annual National Institute on Aging Intramural Scientific Retreat (Линтицум Хэйтс, США, 1998, 2000, 2001); Stem Cells: Origins, Fates and Functions, Keystone Symposia (Кейстоун, США, 2002); From Stem Cells to Therapy, Keystone Symposia (Стимбоат Спрингс, США); INYS Workshop on Stem Cell Research. Nobel Forum (Стокгольм, Швеция, 2004); 4th Forum of European Neuroscience (Лиссабон, Португалия, 2004); Symposium of Lund Strategic Center for Stem Cell Biology and Cell Therapy (Люнд, Швеция, 2005); Meeting of SRC-SDARF-JDRF Joint Programme in Stem Cell Research (Сигтуна, Швеция, 2005); International Society for Stem Cell Research 3rd Annual Meeting (Сан-Франциско, США, 2005); From Neuron to Neurology and Psychiatry: The Baltic Summer School (Копенгаген, Дания, 2005); 2nd European Science Foundation Functional Genomics Conference “Functional Genomics and Disease” (Осло, Норвегия, 2005); NSR (Nervous System and Repair) and NCoE (Nordic Center of Excellence) Joint Symposium: Disease models in vivo and in vitro (Люнд, Швеция, 2005); Swedish Research Council NeuroFortis (Strong Research Environment in Brain Damage and Repair) Annual Meeting (Изаберг, Швеция, 2009); General Biology of stem cell systems: EuroSTELLS Meeting (Венеция, Италия, 2006); Pre-clinical Evaluation of Stem Cell Therapy in Stroke (STEMS) kick-off meeting (Париж, Франция, 2006), II Съезд Общества клеточной биологии и Юбилейная конференция, посвященная 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007); IV и V Международная конференция «Медицина долголетия и качества жизни» (Москва, 2008, 2009); Всероссийская научно-практическая конференция c международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов» (Санкт-Петербург, 2008, 2009); Российско-шведский практикум «Cell Technologies for Medicine» (Санкт-Петербург, 2009); Всероссийская научная школа для молодёжи «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009); Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 г. в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2009); LXXI конференция молодых ученых СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова (Санкт-Петербург, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные нейродегенеративные заболевания XXI века» (Санкт-Петербург, 2010). Публикации По материалам диссертации опубликовано 18 статей в журналах, рекомендуемых ВАК Российской Федерации для публикации результатов докторских исследований, 4 статьи в иных журналах, 5 глав в коллективных монографиях, 2 главы в методических пособиях, 12 тезисов докладов. Внедрение Полученные в ходе диссертационной работы данные используются в научно-исследовательской работе и образовательном процессе в ФГУ «Федеральный Центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А.Алмазова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Учреждении РАН Институте цитологии РАН, Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН, и Санкт-Петербургском Институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Национальном институте старения США, и Люндском Университете (Швеция). Разработанная в ходе выполнения данной работы и производимая компанией «SweGene» (Швеция) специализированная микрочиповая (микроматричная) платформа «NeuroStem» в настоящее время используется в работе лабораторий клеточной биологии и экспериментальной неврологии Люндского Университета (Швеция) и Университета Тель-Авива (Израиль) для экспериментальной работы, направленной на разработку методов терапии ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии, основанной на применении эмбриональных и соматических стволовых клеток человека. ^ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, собственных результатов и обсуждения, и выводов. Объем работы составляет 429 страниц. Список литературы содержит 29 отечественных и 560 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 16 таблицами и 93 рисунками. ^ |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям