ВЫВОДЫ
1. Идентифицирована панель в составе 238 генов, контролирующих процессы пролиферации стволовых клеток в недифференцированном состоянии. Данная группа содержит в том числе новые «кандидатные» факторы контроля пролиферативного потенциала стволовых клеток.
2. Показано, что по совокупности свойств (а именно, доступности исходного клеточного материала; этическим препятствиям; сложности получения линий клеток; пролиферативному потенциалу; эффективности экспансии клеточного материала; уровню пластичности; иммуногенности; возможности направленной дифференцировки
в функциональные дофаминергические нейроны; и другим) эмбриональные стволовые клетки человека (чЭСК) линии SA002 наиболее удобны для размножения (экспансии) in vitro в интересах применения в качестве субстрата клеточной терапии локализованной возрастной нейродегенеративной патологии;
3. Выявлена биологическая роль фактора роста фибробластов 20 (FGF-20), проявляющейся в стимуляции пролиферации, дифференцировки и выживания дофаминергических прогениторных клеток в культуре in vitro. Применение этого фактора повышает эффективность протокола направленной дифференцировки чЭСК
в дофаминергические нейроны in vitro с 3,0+1,0% экспрессирующих тирозингидроксилазу клеток от общего числа клеток-производных чЭСК (базовый протокол) до 15,0+2,0% (применение FGF-20 в концентрации 1 нг/мл питательной среды);
4. Установлена обратная зависимость между длительностью пребывания чЭСК
в культуре in vitro (как функции степени их дифференцировки) и риском развития злокачественной тератомы (тератокарциномы) в сайтах трансплантации клеточного материала, что позволяет выбрать условия дифференцировки клеток, обеспечивающие минимизацию риска развития злокачественной тератомы у реципиентов, и является одним из решающих факторов возможности использования клеточного материала в лечении больных, в том числе пожилого и старческого возраста;
5. Разработан принципиально новый двухэтапный протокол дифференцировки чЭСК в функциональные дофаминергические нейроны in vitro (I этап - дифференцировка
в адгезионной культуре, II этап - в суспензионной культуре), который позволил получить однородную популяцию клеточных агрегатов с заданными характеристиками («трансплантационных единиц»), содержащих большое количество дофаминергических нейронов (до 13,0+2,0% от общего числа клеток) и не требующих диссоциации при трансплантации;
6. Разработана и апробирована в эксперименте с использованием модельных животных техника трансплантации «трансплантационных единиц», применение которой впервые дало возможность многократно (до 20 раз) повысить выживаемость дофаминергических нейронов в сайтах трансплантации, что позволило получить функциональный эффект у модельных животных и свидетельствует о перспективности применения разработанной технологии для лечения ассоциированных с возрастом нейродегенеративных заболеваний у человека.
^
1. Учитывая общее постарение населения развитых стран, и связанный с этим рост распространенности локализованной, ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии, а также учитывая постепенное снижение эффективности фармакотерапии проводимой в течение длительного времени, продолжение работ по разработке основанных на принципах клеточной терапии подходов к лечению таких заболеваний является в высшей мере целесообразным;
2. Эмбриональные стволовые клетки человека (чЭСК) могут быть использованы в качестве исходного субстрата клеточной терапии локализованной, ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии. При этом целесообразно использовать линии чЭСК, способные эффективно пролиферировать вне присутствия фидерных (питающих) клеток ксеногенного происхождения (например линию SA002);
3. В ходе направленной дифференцировки чЭСК в дофаминергические нейроны in vitro, рекомендуется вводить в состав питательной среды фактор роста фибробластов 20 (FGF-20) в концентрации 1 нг/мл питательной среды;
4. Специализированную микрочиповую платформу “NeuroStem” целесообразно использовать в экспериментах по изучению фундаментальных биологических механизмов, лежащих в основе пролиферации, роста, дифференцировки и созревания клеток, а также процессов нейродегенерации, в том числе возрастной. Это является необходимым звеном работы по разработке основанных на принципах клеточной терапии подходов к лечению таких заболеваний;
5. В ходе разработки подходов к клеточной терапии локализованной, ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии рекомендуется использовать производные чЭСК в формате не клеточной суспензии, а микроагрегатов, - то есть без диссоциации на этапе непосредственно предшествующем трансплантации. При этом рекомендуется использовать разработанный метод получения «трансплантационных единиц» обладающих комплексом заданных физических и биологических свойств.
^
Статьи в журналах, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки РФ
Анисимов С.В. Клеточная терапия болезни Паркинсона: I. Трансплантация эмбриональной и взрослой ткани // Успехи геронтологии. - 2008. – T. 21 (4). – C. 575-592.
Анисимов С.В. Клеточная терапия болезни Паркинсона: II. Применение соматических стволовых клеток // Успехи геронтологии. - 2009. - T. 22 (1). - C. 150-166.
Анисимов С.В. Клеточная терапия болезни Паркинсона: III. Применение неонатальных, фетальных и эмбриональных стволовых клеток // Успехи геронтологии. - 2009. - T. 22 (2). - C. 296-315.
Анисимов С.В. Клеточная терапия болезни Паркинсона: IV. Риски и перспективы // Успехи геронтологии. - 2009. - T. 22 (3). - C. 418-439.
Получение дофаминовых нейронов из эмбриональных стволовых клеток человека in vitro/ И.В. Кожухарова, В.И. Земелько, З.В. Ковалева, Н.А. Пуговкина, Л.Л. Алексеенко, М.В. Харченко, Н.Д. Аксенов, А.Н. Шатрова, С.В. Анисимов, Т.М. Гринчук, И.И. Фридлянская, Н.Н. Никольский// Цитология. - 2010. - Т. 52 (10). - C. 875-882.
Anisimov S.V. A large-scale screening of the normalized mammal mitochondrial gene expression profiles/ S.V. Anisimov// Genetical Research. – 2005. – V. 86 (2). – P. 127-138.
Anisimov S.V. Cell-based therapeutic approaches for Parkinson’s disease: progress and perspectives/ S.V. Anisimov// Reviews in the Neurosciences. - 2009. - V. 20 (5-6). - P. 347-381.
Anisimov S.V. Incidence of "quasi-ditags" in catalogs generated by Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)/ S.V. Anisimov, A.A. Sharov// BMC Bioinformatics. – 2004. – V. 5(1). – 152.
Anisimov S.V. Serial Analysis of Gene Expression (SAGE): 13 Years of Application in Research/ S.V.Anisimov// Current Pharmaceutical Biotechnology. - 2008. - V. 9 (5). - P. 338-350.
Anisimov S.V. Serial Analysis of Gene Expression (SAGE). Editorial/ S.V. Anisimov// Current Pharmaceutical Biotechnology. – 2008. – V. 9 (5). – P. 337.
Anisimov S.V. Risks and mechanisms of oncological disease following stem cell transplantation/ S.V. Anisimov, A. Morizane, A.S. Correia// Stem Cell Reviews and Reports. – 2010. – V. 6 (2). – P. 411-424.
Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes/ K.R. Boheler, J. Czyz, D. Tweedie, H.-T. Yang, S.V. Anisimov, A.M. Wobus// Circulation Research. - 2002. - Vol. 91 (3). - P. 189-201.
Linkage of pluripotent stem cell-associated transcripts to regulatory gene networks/ K.V. Tarasov, G. Testa, Y.S. Tarasova, G. Kania, D.R. Riordon, M. Volkova, S.V. Anisimov, A.M. Wobus, K.R. Boheler // Cells Tissues Organs. – 2008. – V. 188 (1-2). – P. 31-45.
«NeuroStem Chip»: a novel highly specialized tool to study neural differentiation pathways in human stem cell/ S.V. Anisimov, N.S. Christophersen, S.A. Correia, J.Y. Li, P. Brundin// BMC Genomics. – 2007. – V. 8 (1). – P. 46.
SAGE identification of differentiation responsive genes in P19 embryonic cells induced to form cardiomyocytes in vitro/ S.V. Anisimov, K.V. Tarasov, D. Riordon, A.M. Wobus, K.R. Boheler// Mechanisms of Development. – 2002. – V. 117 (1-2). – P. 25-74.
Signals from embryonic fibroblasts induce adult intestinal epithelial cells to form nestin-positive cells with proliferation and multilineage differentiation capacity in vitro. 1, Joint first authorship/ C. Wiese 1, A.Rolletschek 1, G. Kania, A. Navarrete-Santos, S.V. Anisimov, B. Steinfarz, K.V. Tarasov, S.A. Brugh, I. Zahanich, C. Ruschenschmidt, H. Beck, P. Blyszczuk, J. Czyz, J. Huebach, U. Ravens, O. Horstmann, L. St-Onge, T. Braun, O. Brustle, K.R. Boheler, A.M. Wobus// Stem Cells. – 2006. – V. 24 (9). – P. 2085-2097.
Stern M.D. Estimation of biological complexity from SAGE catalogs: statistical limitations revealed by Monte Carlo simulation/ M.D. Stern, S.V. Anisimov, K.R. Boheler// Bioinformatics. – 2003. – V. 19 (4). – P. 443-448.
Transplantation of human embryonic stem cell-derived cells to a rat model of Parkinson’s disease: effect of in vitro differentiation on graft survival and teratoma formation. 1, Joint first authorship; 2, Joint last authorship/ A. Brederlau1, A.S.Correia1, S.V. Anisimov, M. Elmi, G. Paul, L. Roybon, A. Morizane, P. Bergkvist, I. Riebe, U. Nannmark, M. Carta, E. Hanse, J. Takahashi, Y. Sasai, K. Funa, P. Brundin, P.S.Eriksson 2, J.Y.Li 2// Stem Cells. – 2006. – V. 24 (6). – P. 1433-1440.
Статьи в других журналах
Fibroblast growth factor-20 increases the yield of midbrain dopaminergic neurons obtained from human embryonic stem cell cultures/ A.S. Correia, S.V. Anisimov, L. Roybon, J.Y. Li, P. Brundin/ Annals of Medicine// Frontiers in Neuroanatomy. – 2007. – V. 1 (1). – P. 4.
Growth factors and feeder cells promote differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons: a novel role for fibroblast growth factor-20/ A.S. Correia, S.V. Anisimov, J.Y. Li, P. Brundin// Frontiers in Neuroanatomy. – 2008. – V. 2 (1). – P. 26-34.
Identification of molecules derived from human fibroblast feeder cells that support proliferation of human embryonic stem cells. 1, Joint first authorship/ S.V.Anisimov 1, N.S.Christophersen 1, A.S. Correia, V.J. Hall, I. Sandelin, J.Y. Li, P. Brundin// Cellular and Molecular Biology Letters. – 2011. – V. 16 (1). – 79-88.
Stem cell-based therapy for Parkinson’s disease/ A.S. Correia, S.V. Anisimov, J.Y. Li, P. Brundin/ Annals of Medicine. – 2005. – V. 37 (7). – P. 487-498.
Монографии
Анисимов С.В. Микрочиповая технология в диагностике сердечно-сосудистых, гематологических и эндокринных заболеваний/ С.В. Анисимов// Нанотехнологии в биологии и медицине (Ред. Е.В.Шляхто). - СПб.: Любавич. – 2009. - C. 71-100.
Anisimov S.V. Selecting a proper platform for microarray experiment// In: Stem Cell Applications in Diseases/ Anisimov S.V. (Eds. W.B.Burnsides, R.H.Ellsley). - NOVA Publishers, USA. – 2008. – P. 1-10.
Anisimov S.V. Selecting a proper platform for microarray experiment// In: Oligonucleotie Array Sequence Analysis/ Anisimov S.V. (Eds. M.K.Moretti, L.J.Rizzo). - NOVA Publishers, USA. – 2008. – P. 27-36.
Being realistic about human embryonic stem cell-based therapy of Parkinson’s disease/ S.V. Anisimov, A.S. Correia, J.Y. Li, P. Brundin// In: Parkinson's Disease and Movement Disorders. 5th Edition/ J.J.Jankovic, E.Tolosa (Eds). - Philadelphia, PA, USA: Lippincott Williams & Wilkins. – 2006. – P. 642-652.
SAGE analysis of embryonic stem cells/ K.V. Tarasov, S.V. Anisimov, Y.S. Tarasova, D.R.Riordon, A. Younes, M.D. Stern, A.M. Wobus, K.R. Boheler// In: Serial Analysis of Gene Expression: Current Technologies and Applications/ S.M.Wang (Ed). - Norwich, UK: Horizon Scientific Press. – 2005. – P. 207-228.
Методические руководства
Anisimov S.V. Application of DNA microarray technology to gerontological studies/ S.V. Anisimov// Methods in Molecular Biology. – 2007. - V. 371. – P. 249-265.
Anisimov S.V. Serial Analysis of Gene Expression (SAGE): Detailed protocol and analysis/ S.V. Anisimov, K.V. Tarasov, K.R. Boheler// In: Cell Biology: A Laboratory Handbook. 3rd Edition/ J.Celis (Ed). - Academic Press, San Diego, CA, USA. – 2005. – P. IV.14.1-IV.14.10.
Тезисы докладов
Анисимов С.В. Клеточные технологии: реалии сегодняшнего дня/ С.В. Анисимов// Матер. конф. IV-я Международная конференция «Медицина долголетия и качества жизни». 17-18 апреля 2008 г., Москва, Россия. –2008 – C. 54.
Анисимов С.В. Основные принципы восстановительной и заместительной клеточной терапии/ С.В. Анисимов// Матер. V-й Международной конф. «Медицина долголетия и качества жизни». 28-29 января 2009 г., Москва, Россия. – 2009. – C. 34.
Анисимов С.В. Практические аспекты возможного применения эмбриональных стволовых клеток в клинике/ С.В. Анисимов// Всероссийская научно-практическая конф. с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов». Артериальная Гипертензия. 23-24 мая 2008 г., Санкт-Петербург, Россия. – 2008. – T. 14 (1). – C. 93.
Разработка способов направленной нейрональной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека, исключающих клетки с генетическими изменениями и/или туморогенным потенциалом/ Н.Н. Никольский, В.А. Поспелов, Т.М. Гринчук, Г.Г. Полянская, Т.В. Поспелова, С.В. Анисимов, Н.А. Михайлова, М.С. Лянгузова, И.В. Кожухарова, Т.А. Крылова, Л.Л. Алексеенко, З.В. Ковалева, Н.А. Пуговкина, В.С. Романов, А.М. Кольцова, Г.С. Синева, И.И. Суворова, Н.А. Виноградова, А.Д. Харазова, А.А. Заварзин, В.Ф. Синицина, Т.В. Серговская //Сб. тез. Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 г. в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». 25-27 ноября 2009 г. Москва, Россия. –2009. – С. 26-27.
Anisimov S.V. Application of microarray technology to experimental neurology/ S.V. Anisimov// From Neuron to Neurology and Psychiatry. The Baltic Summer School. University of Copenhagen, The Panum Institute. - Copenhagen, Denmark. - August 14-26, 2005. - Delegate manual. – 2005. – P. 30.
Developing human embryonic stem cell-based therapy for Parkinson’s disease/ S. Correia, A. Brederlau, S.V. Anisimov G. , Paul L. , Roybon, P. Eriksson, P. Brundin, J.Y. Li//Abstract book. Meeting of SRC-SDARF-JDRF Joint Programme in Stem Cell Research. - June 16-17, 2005 Sigtuna, Sweden. – 2005. – P.19.
Developing human embryonic stem cell-based therapy for Parkinsons disease/ S. Correia, A. Brederlau, S.V. Anisimov, G. Paul L. , Roybon, P. Eriksson, P. Brundin, J.Y. Li// International Society for Stem Cell Research 3rd Annual Meeting. - San Francisco, CA, USA. - June 23-25, 2005. - Delegate manual. – 2005. – P.85.
Discovering dopaminergic differentiation-associated gene expression profile alterations in an immortalized human mesencephalic cell line using specialized custom microarray/ N.S. Christophersen, S.V. Anisimov, B. Juliusson, J. Jørgensen, P. Brundin// Abstract book. Meeting of SRC-SDARF-JDRF Joint Programme in Stem Cell Research. - June 16-17, 2005. Sigtuna, Sweden. – 2005. – P.18.
Discovering dopaminergic differentiation-associated gene expression profile alterations in an immortalized human mesencephalic cell line using/ Christophersen N.S., Anisimov S.V., Juliusson B., Jørgensen J., Brundin P. //International Society for Stem Cell Research 3rd Annual Meeting. - San Francisco, CA, USA. - June 23-25, 2005. - Delegate manual. – 2005. – P. 181.
Identification of Gene Transcripts with Profiles Unique to Pluripotent Mouse R1 Embryonic Stem Cells Serial Analysis of Gene Expression/ K.R. Boheler, S.V. Anisimov, K.V.Tarasov, D. Tweedie, A.M. Wobus// Abstract Book. Stem Cells: Origins, Fates and Functions. Keystone, CO. March 17-23, 2002, Keystone Symposia. – 2002. – P.62.
In search of stemness: expression profile of ES (R1 and D3) and EC (P19) cell lines/ K.V.Tarasov, S.V. Anisimov, Y.S. Tarasova, A.M. Wobus, K.R. Boheler//Abstr. From Stem Cells to Therapy. Steamboat Springs, CO. - March 29 - April 3, 2003. - Keystone Symposia. – 2003. –P.114.
Survival and neuronal differentiation of human embryonic stem cells after grafting into a Parkinsonian rat model/ S. Correia, A. Brederlau J.Y. , Li, L. Roybon, S.V. Anisimov, G. Paul, P. Eriksson, P. Brundin// Abstr. 4th Forum of European Neuroscience. - Lisbon, Portugal. – July, 10-14, 2004. – P. A019.13.
^
БА - болезнь Альцгеймера
БДТЛ - болезнь [диффузных] телец Леви
БП - болезнь Паркинсона
ДМСО - диметилсульоксид
ДНКаза I - деоксирибонуклеаза I
ИГХ - иммуногистохимический анализ
ИЦХ - иммуноцитохимический анализ
мЭСК - эмбриональные стволовые клетки мыши
мЭФ - эмбриональные фибробласты мыши
ППК - первичные половые клетки
ПФА - параформальдегид
ПЦР-ОТ - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
СК - стволовые клетки
ТЕ - трансплантационные единицы
ЦНС - центральная нервная система
чНФ - фибробласты крайней плоти новорожденных
чЭСК - эмбриональные стволовые клетки человека
ЭСК - эмбриональные стволовые клетки
6-OHDA - 6-гидроксидофамин
bFGF - основной фактор роста фибробластов
DMEM - среда Игла в модификации Дюльбекко
DOPAC - 3,4-дигидрофенилуксусная кислота
FGF-2 - основной фактор роста фибробластов
FGF-20 - фактор роста фибробластов 20
HBSS - сбалансированный солевой раствор Хэнкса
LIF - лейкемический ингибиторный фактор
SAGE - серийный анализ генетической экспрессии
SCF - фактор стволовых клеток
SDIA - индуцирующая активность, ассоциированная со стромальными клетками
TrBlue - трипановый синий
АНИСИМОВ Сергей Владимирович. Применение стволовых клеток в терапии возрастной нейродегенеративной патологии (экспериментальное исследование)//Автореф. дис. … докт. мед. наук: 14.01.30; 03.03.04 - СПб., 2010. - 40 с.
Подписано в печать «___»_______2011. Формат 60*84 1/16.
Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0.
Тираж 100 экз. Заказ___ .
|
Отпечатано с готового оригинал-макета.
ЗАО «Принт-Экспресс»
197101, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5 лит. А.
|
