Анисимов сергей Владимирович Применение стволовых клеток при возрастной нейродегенеративной патологии
|
|
Скачать 0.75 Mb.
|
|
Результаты исследований и их обсуждение Большинство перечисленных генов может также выполнять иные функции, не имеющие отношение к дофаминергической системе. |
Для статистической обработки результатов исследования использовали современные математические методы анализа полученных данных, включая однофакторный дисперсионный анализ и критерий Шеффе (расчет влияния времени пребывания в культуре in vitro на выход дофаминергических нейронов), дисперсионный анализ Краскала-Уоллеса (анализ результатов трансплантации: выживаемость, трансплантация, дифференцировка), критерий U Манна-Уитни (попарное сравнение между группами в один момент времени, либо между двумя временными точками в пределах одной группы), t-критерий Стьюдента (анализ воздействия биологических факторов на клеточные культуры in vitro), локально взвешенную регрессию (LOWESS curve fitting; нормализация данных гибридизации образцов с микрочиповыми платформами). Сравнительный анализ распределения частот встречаемости SAGE-ярлыков в индивидуальных SAGE-библиотеках производили |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
Гены |
Функция |
Aadc, Ant2 (Slc25a5), Calb1, Dat (Slc6a3), Girk2 (Kcnj6), Igf1, Ptx3, Th |
Маркеры дофаминергических нейронов |
Dll1 1, En1, En2, Lmx1b 2, Pax5, Shh, Wnt1 |
Маркеры дофаминергических прогениторных клеток (клеток-предшественников) |
Adh2, Lhx1 (Lim1), Lhx5 (Lim2) |
Маркеры созревания дофаминергических нейронов |
Drd2 2, Vmat2 |
Маркеры зрелых дофаминергических нейронов |
Gfra1, Gfra2, Gfra3, Gfra4, Otx2 |
Маркеры незрелых (ранних) дофаминергических нейронов |
Dlx1, Dlx2, Flj38973, Lmx1a, Metrn 1, Mgc33365 1, Tafa4 (Fam19a4) 1 |
Гены, имеющие отношение к процессам дифференцировки дофаминергических нейронов |
Adcy7, Alcam, Art (Artn), Bcl11a, Calca, Cart, Cbln1, Cdh2, Col11a1, Cx43, D1lip (Drd1ip), Darpp32 (Ppp1r1b), Dbh, Doc2a, Drd1, Drd3, Drd4, Drd5, Drip78 (Dnajc14), Egln3 (Phd3), Egr1, Fos, Fxyd6, Galm, Ghr, Grin2c, Grp, Gsbs (C7orf16), Hs6st2, Igfbp4, Kcna5, Kcnab1, Math2, Mlp (Marcksl1), Moxd1, Mpp3, Nrip3, Nrp2, Nt (Nts), Ntn (Nrtn), Nurr1 (Nr4a2), Pac1 (Adcyap1r1), Pacap, Plagl1 (Zac), Pvrl3 (Nectin 3), Rab3c, Rcn1, Slc17a6 (Vglut2), Slc6a1, Sox6, Spp1, Tacr3, Trhr, Zfp161, Vav3, Zdhhc2 |
Гены, имеющие отношение к дофаминергической системе |
1 Кандидатные молекулярные мишени, идентифицированные в ходе собственных пилотных экспериментов.
2 Могут также выполнять иные функции, имеющие отношение к дофаминергической системе.
^
После производства и тестирования, микрочиповая платформа “NeuroStem” была активно использована в экспериментах по изучению транскриптома клеток разных типа. В полном соответствии с назначеним микрочиповой платформы, воплощенном в её дизайне, она была, в частности применена в сериях экспериментов по изучению транскриптома эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК), в том числе дифференцированных in vitro в дофаминергические нейроны, клеток-предшественников дофаминергических нейронов, «питающих» (фидерных) клеток используемых для экспансии чЭСК in vitro, стромальных клеток, и др. Используя комплекс аналитического программного обеспечения BioArray Software Environment database (BASE; Saal L. H., et al., 2002), производили селекцию данных, с вычитанием фонового сигнала и сигнала с точек нанесения генетического материала, помеченных «флагами». Полученные данные обладали высоким уровнем достоверности: так, например, в экспериментах с недифференцированными чЭСК коэффициент корелляции составлял для технических репликатов > 0,96, а в экспериментах с противопоставлением транскриптома недифференцированных чЭСК контролю со «сменой цвета» он был равен 0,78. В ходе экспериментов было получено подтверждение экспрессии в недифференцированных чЭСК линии SA002 многих признанных маркеров стволовых клеток (Hesx1, Grem1, Gja1, Zic3 и др.). С другой стороны, при дифференцировке чЭСК в функциональные дофаминергические нейроны было отмечено снижение уровня экспрессии многих маркерных генов стволовых клеток (Hesx1, Grem1, Dnmt3b, Utf1 и Nanog) и динамическое повышение (Log2 >1,0) уровня экспрессии генов имеющих отношение к дофаминергической системе (а именно, Igf1, Ptx3, Th, Wnt1, Lhx1 (Lim1), Drd2, Gfra1, Adcy7, Bcl11a, Col11a1, Doc2a, Drip78 (Dnajc14), Ghr, Igfbp4, Kcnab1, Moxd1, Mpp3, Nrp2, Nt (Nts), Ntn (Nrtn), Plagl1 (Zac), Slc17a6 (Vglut2), Trhr, Zdhhc2). Разнообразие молекулярных мишеней представленных на микрочиповой платформе “NeuroStem” и отвечающих изменением уровня экспрессии на дифференцировку чЭСК в функциональные дофаминергические нейроны полностью отвечает сложности биологических механизмов, вовлеченных в это направление дифференцировки. После 16 дней протокола in vitro дифференцировки, клеточная популяция является чрезвычайно гетерогенной. Лишь около 0,2% содержащихся в ней клеток экспрессируют тирозингидроксилазу (TH+) и способны синтезировать дофамин. Одновременно, в культуре находятся резидуальные (остаточные) недифференцированные чЭСК; остальные же клетки являются промежуточными типами разного уровня дифференцировки.
Рис. 2. Фрагмент микрочиповой платформы “NeuroStem”. ДНК-материал визуализирован (фактический эксперимент по анализу транскриптома недифференцированых чЭСК линии SA002). Репрезентативный блок (31 х 31 точка). Белые квадраты указывают на повторяющиеся как квадрипликаты группы молекулярных мишеней, разнесенные в пространстве. Параметры печати: расстояние между центрами точек нанесения генетического материала = 140 мкм; средний размер точек = 90-110 мкм.
С целью подтверждения результатов экспериментов с микрочиповой платформой была проведена серия экспериментов с использованием технологии ОТ-ПЦР, в которой были использованы те же образцы РНК. Было проведено исследование экспрессии в образцах следующих групп репрезентативных генов: снижение уровня экспрессии, Sox2, En1 и Nanog; без изменений, Gadph, Aldh1a1, Sdha, Tubb и Nestin; повышение уровня экспрессии, Actb, Th, Msx1 и Pitx2. Среднее нормализованное отношение интенсивности сигнала микрочиповой платформы для дифференцированных и недифференцированных чЭСК соответствовало результатам анализа продукта ОТ-ПЦР для всех групп мишеней. Принимая во внимание разные принципы, лежащие в основе этих двух технологий (гибридизация и амплификация, соответственно) данные этого эксперимента подтверждают высокую надёжность проводимого с использованием микрочиповой платформы “NeuroStem” качественного и количественного анализа динамики экспрессии генов на ранних этапах дифференцировки чЭСК в дофаминергические нейроны.
Дифференцировка стволовых клеток в функциональные дофаминергические нейроны in vitro
Использованная технология направленной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) в дофаминергические нейроны была основана на принципе, «индуцирующей активности, ассоциированной со стромальными клетками» (stromal cell-derived inducing activity, SDIA) [Kawasaki H., et al., 2000]. чЭСК культивировали в сложной клеточной системе, совместно со стромальными клетками мыши линии РА6. В ходе ко-культивирования, чЭСК продолжали активно пролиферировать (с активным ростом исходных колоний) и одновременно дифференцироваться. Последний процесс сопровождался значимыми морфологическими изменениями. В частности, для чЭСК линии SA002 было отмечено появление «кратерообразных» структур, а после продолжительного ко-культивирования наблюдалась массивная компартментализация производных чЭСК, с формированием в пределах почти каждой колонии множественных отсеков большей или меньшей величины и сложности, иногда с выделением настоящих цист. В отдельных случаях наблюдалось также отрастание от колоний нейритов типичной морфологии, иногда сливающихся в тяжи (Рис. 3). Встречались и морфологически смешанные типы колоний производных чЭСК.
Рис. 3. Примеры «кратерообразных» структур, компартментализации колоний и формирования тяжей нейритов, формируемых дифференцирующимися чЭСК линии SA002 при ко-культивировании со стромальными клетками мыши линии РА6. Шкала = 100 мкм.
Эффективность принятого протокола направленной дифференцировки чЭСК в функциональные дофаминергические нейроны подтверждалась следующими путями: 1) Экспрессия производными чЭСК биохимических маркеров нейронов и дофаминергических нейронов: тирозингидроксилазы (ТН) и β-III-тубулина (TUBB3) клетками человеческого происхождения (окраска на ядерный белок человека), - иммуноцитохимический анализ. 2) Экспрессия производными чЭСК генетических маркеров нейронов и дофаминергических нейронов: Aldh1, Msx1, Th, и других, - применение специализированной олигонуклеотидной микрочиповой платформы “NeuroStem” и ОТ-ПЦР. 3) Синтез производными чЭСК дофамина, - хроматографический анализ (HPLC).
После ко-культивирования с клетками линии РА6 в течение 2,5 недель, 42+20% (среднее значение + стандартное отклонение) колоний чЭСК экспрессировали маркер незрелых нейронов β-III-тубулин (TUBB3), и 38+22% - маркер функциональных дофаминергических нейронов тирозингидроксилазу (TH); данные о составе клеточной популяции (производных чЭСК) в целом представлены в таблице 2. После ко-культивирования с клетками линии РА6 в течение 6 недель лишь 1,0+2,0% TH+ клеток экспрессировали периферин, маркер нейронов периферической нервной системы (ПНС). Это указывает на то, что подавляющее большинство TH+ нейронов полученных с использованием данного протокола имеют фенотип, характерный для нейронов центральной нервной системы (ЦНС). Иммуноцитохимический анализ позволил также установить, что экспрессирующие тирозингидроксилазу нейроны-производные чЭСК ко-экспрессируют везикулярный транспортер моноаминов 2 (VMAT-2), вовлеченный в везикулярный транспорт дофамина и транскрипционный фактор PITX3, необходимый для развития дофаминергических нейронов substantia nigra. В совокупности, эти данные подтверждают успех используемого протокола направленной дифференцировки чЭСК в функциональные дофаминергические нейроны.
Таблица 2
Процентная доля β-III-тубулин+ и ТН+ клеток в клеточной суспензии,
подготовленной для трансплантации
Длительность ко-культивирования |
|||
16 дней |
20 дней |
23 дня |
|
Процентная доля β-III-тубулин+ клеток от общего числа клеток |
8,8 |
31,9 |
20,0 |
Процентная доля ТН+ клеток от числа β-III-тубулин+ клеток |
1,9 |
13,7 |
37,1 |
Процентная доля ТН+ клеток от общего числа клеток |
0,2 |
4,4 |
7,4 |
Исследование биологических свойств фактора роста фибробластов 20 (FGF-20)
Фактор роста фибробластов 20 (FGF-20) был открыт в 2000 г. [Kirikoshi H., et al., 2000]. Было показано, что этот фактор преимущественно экспрессируется в substantia nigra pars compacta головного мозга [Ohmachi S., et al., 2000]; в связи с этим, нами была выдвинута гипотеза о том, что FGF-20 играет важную роль в дифференцировке нейрональных клеток-предшественников в дофаминергические нейроны и установлено, что этот рецептор экспрессируется недифференцируемыми чЭСК, стромальными клетками мыши линии РА6,
и производными чЭСК, дифференцированными в дофаминовые нейроны, что может указывать на способность FGF-20 непосредственно влиять на чЭСК и на дофаминергические нейроны. Мы также предположили, что FGF-20 может стимулировать синтез и секрецию стромальными клетками линии РА6 факторов, способствующих дофаминергической дифференцировке чЭСК и выживанию дофаминергических нейронов-производных чЭСК. Чтобы выявить эффект FGF-20 на чЭСК, FGF-20 добавляли в питательную среду при ко-культивировании чЭСК линии SA002 со стромальными клетками мыши линии РА6.
В пилотной серии экспериментов исследовали эффект, оказываемый FGF-20 в разных концентрациях (100 пг/мл, 1 нг/мл и 10 нг/мл), при этом выявили, что наилучшее соотношение эффекта/дозы достигается при добавлении FGF-20 в культуру в концентрации
1 нг/мл. После окончания этапа культивирования анализировали итоговый клеточный состав. В результате анализа морфологии колоний производных чЭСК, количества клеток-производных чЭСК после окончания протокола культивирования, профиля экспрессии биохимических и генетических маркеров, были сделаны следующие основные заключения: 1). bFGF (FGF2) является необходимым фактором пролиферации чЭСК в культуре.
В вариантах протокола, в которых bFGF не добавляли в культуральную среду, дифференцировка чЭСК в нейроны проводилась в соотношении близком к 1:1 (то есть, большинство исходных клеток дифференцировали в нейроны, но не пролиферировали).
2). FGF-20 является важным фактором стимуляции дифференцировки чЭСК
в дофаминергические нейроны. По сравнению с базовым протоколом (без добавления
FGF-20), эффективность протокола, основанного на добавлении в культуральную среду
FGF-20, возросла пятикратно. 3) В высоких дозах (≥10 нг/мл), FGF-20 способен также
в ограниченной степени стимулировать пролиферацию клеток. В меньших дозах этот эффект не выражен: так, при добавлении в культуральную среду FGF-20 в концентрации 1 нг/мл, число клеток экспрессирующих человеческий ядерный белок (HNuc), то есть производных чЭСК, ко-экспрессирующих маркер пролиферирующих клеток белок Ki67 возрастало незначительно, с 7,0+2,0 до 8,0+1,0.
Рис. 4. Пример иммуноцитохимического окрашивания колоний производных чЭСК линии SA002 ко-культивированных со стромальными клетками мыши линии РА6 в течение 21 дня; (А) без добавления FGF2 и FGF-20 и (Б) с добавлением bFGF и FGF-20 в течение всего времени культивирования. Светлые клетки экспрессируют тирозингидроксилазу (ТН)
и человеческий ядерный белок (HNuc). (В) Отношение числа клеток, экспрессирующих ТН
к числу клеток, экспрессирующих HNuc. FGF-20, 1 нг/мл, (**), p<0,002.
При добавлении в культуральную среду FGF-20, эффективность протокола направленной дифференцировки чЭСК в дофаминергические нейроны возрастает по сравнению с базовым протоколом (SDIA + bFGF), что было оценено по расчету отношения числа клеток экспрессирующих тирозингидроксилазу (ТН) к общему числу клеток, экспрессирующих человеческий ядерный белок (HNuc) (Рис. 4). При добавлении FGF-20
в концентрации 200 нг/мл, этот показатель возрос с 2,2+1,3 (базовый протокол) до 8,6+2,3; при добавлении FGF-20 в концентрации 1 нг/мл - с 3,0+1,0 до 15,0+2,0. Также отмечали возрастание экспрессии иных нейрональных маркеров, включая нестин и β-III-тубулин: при добавлении FGF-20 в концентрации 200 нг/мл, эти показатели возросли с 43,3+3,7 (базовый протокол) до 83,4+2,1 для нестина, и с 6,2+1,7 до 26,5+5,5 для β-III-тубулина, соответственно. В более низкой концентрации (1 нг/мл) FGF-20 повышал экспрессию клетками β-III-тубулина не значимо: с 16,0+2,0 до 18,0+1,0. Эти данные позволили заключить, что FGF-20 является специфичным промотором дифференцировки чЭСК в дофаминергические нейроны, - но не промотором нейрональной дифференцировки в целом. В ходе работы мы также идентифицировали апоптотические клетки в культуре по экспрессии активной каспазы (cleaved caspase) 3, 8 и олигомеризованного белка BCL2-associated X protein (ВАХ). В культурах чЭСК/РА6 обнаруживаются многочисленные клетки, экспрессирующие активную каспазу 8 и ВАХ, однако при добавлении в культуральную среду FGF-20, такие клетки практически не обнаруживаются, а клетки экспрессирующие активную каспазу 3 обнаруживаются гораздо реже: снижение с 2,5+0,2 до 1,2+0,5. Это указывает на то, что снижение частоты апоптотических событий в культуре под влиянием нейротрофической активности FGF-20 может повысить выживаемость дофаминергических нейронов.
Трансплантация производных чЭСК модельным животным и анализ результатов трансплантации
На следующем этапе работы объектом исследования являлась экспериментальная модель возрастной нейродегенерации, основанная на использовании 6-гидроксидофамина
(6-OHDA) (Ungerstedt U., 1968). Крысам проводили стереотаксические инъекции токсина
в область полосатого тела. Поскольку поражение одного полосатого тела (проекции дофаминергических нейронов substantia nigra) вызывает «гемипаркинсонизм», крысы не инвалидизируются полностью. Оценку эффективности поражения дофаминергической системы (полноты токсического поражения дофаминергических нейронов) проводили
3-4 недели спустя, методом исследовании ротационного поведения со стимуляцией амфетамином, с использованием автоматизированной системы Rotomax Analyzer. В ходе отработки хирургической техники, эффективность модели дополнительно подтверждали окраской препаратов головного мозга модельных животных на тирозингидроксилазу (ТН).
В течение 6 недель после подготовки модельных животных, им производили инъекции клеточной суспензии производных чЭСК линии SA002, содержащие дофаминергические нейроны. Используя технику стереотаксической хирургии, животным модельным
в отношении локализованной, ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии вводили в область полосатого тела 100 000 жизнеспособных клеток (2 мкл клеточной суспензии). При этом были сформированы следующие экспериментальные группы общей численностью 38 крыс: 1) Трансплантация производных чЭСК, длительность протокола
in vitro дифференцировки в дофаминергические нейроны = 16 дней; 2) Трансплантация производных чЭСК, длительность протокола in vitro дифференцировки в дофаминергические нейроны = 20 дней; 3) Трансплантация производных чЭСК, длительность протокола in vitro дифференцировки в дофаминергические нейроны = 23 дня (табл. 2). Клеточный материал, не использованный для трансплантации модельным животным, применяли для засева плашек, и изучали для уточнения клеточного состава пула использованных для трансплантации клеток. Через 2 недели после трансплантации, по 4 крысы из каждой группы умертвляли для проведения гистологического исследования, направленного на изучение выживаемости и пролиферации донорских клеток. Остальных крыс использовали для исследования моторных функций в динамике и умертвляли через 13 недель после трансплантации; крысы, погибшие от онкологических осложнений трансплантации, также использовались для изготовления гистологических препаратов.
Окраска гистологических образцов антителами к маркерам ядер человеческих клеток по DAB подтверждала наличие донорских клеток в анатомических структурах, являющихся мишенью трансплантации с миграцией в латеральном направлении. Иммуногистохимическое исследование подтвердило выживаемость части донорских клеток, являющихся производными чЭСК: в том числе глиальных клеток (астроцитов, маркер S100β), нейронов (нейрон-специфический ядерный антиген, NeuN), и дофаминергических нейронов (ТН). При этом отмечали, что выживаемость собственно дофаминергических нейронов была лучшей (~15,0%) в группе 1 (16 дней); хуже (~0,5%) в группе 2 (20 дней) и худшей (~0,3%) в группе 3 (23 дня) (р<0,05). В то же время, донорские клетки
не экспрессировали маркеров иных типов нейронов, в том числе холинергических (холинацетилтрансфераза, CHAT), ГАМК-эргических (глутаматдекарбо-ксилаза, GAD) и серотонинергических (5-гидрокситриптамин, 5-HT), и глиальных клеток, включая олигодендроциты (гомолог хондроитин-сульфат протеогликана NG2); идентифицированы клетки таких типов не коэкспрессировали человеческий ядерный антиген (HNuc) и принадлежали животным-реципиентам. Чрезвычайную важность имела информация о том, что в отдельных трансплантатах число клеток экспрессирующих человеческий ядерный белок в 2,5-8,0 раз превосходило число клеток, введенных в ходе трансплантации, свидетельствуя о пролиферации донорских клеток после трансплантации. Для того чтобы оценить пролиферативную активность производных чЭСК, в течение последних суток перед умерщвлением, модельным животных вводили 5-бром-2-дезоксиуридин (БДУ; 3 инъекции через 8 часов), визуализируемый в препаратах головного мозга иммуногистохимическими методами. Спустя 2 недели после трансплантации, все трансплантаты содержали значительное количество меченных БДУ клеток (средние значения: группа 1, 30%; группа
2, 6%; группа 3, 12%). Однако спустя 13 недель после трансплантации, доля меченных БДУ клеток снизилась (группы 2 и 3, 2%), что свидетельствует об истощении пролиферативного потенциала клеток донорского происхождения в условиях микроокружения трансплантата. Дополнительное подтверждение пролиферативного потенциала донорских клеток в составе трансплантата получили анализом экспрессии в клетках транскрипционных факторов POU domain, class 5, transcription factor 1 (OCT3/4) и SRY-box containing gene 2 (SOX2). Наконец, важнейшее значение имеют полученные данные о развитии агрессивно растущей («злокачественной» или «незрелой» по терминологии рекомендованной журналом Nature Biotechnology (2007. - Vol. 25 (11)); тератокарциномы по классификации Дыбан П. А., 1979)) тератомы в сайтах трансплантации донорских клеток, что совпадает с данными независимых экспериментов [Björklund L. M., et al., 2002; Erdö F., et al., 2003]. В каждом случае модельные животные начинали проявлять признаки быстро прогрессирующего структурного поражения головного мозга (неподвижность, оцепенение, затрудненное дыхание), либо погибали в течение ночи. Макроскопическое и микроскопическое исследование головного мозга животных (подвергнутых перфузии либо погибших, соответственно) подтверждало наличие опухоли, имеющей классическую микроскопическую структуру тератомы (солидной тератокарциномы) (содержащей хрящевые и эпителиальные структуры), иногда занимающей до ¼ объема больших полушарий головного мозга (Рис. 5). Развитие злокачественной тератомы отмечали исключительно в группе 1 (100% животных, между 6 и 11 неделями спустя трансплантации) и группе 2 (50% животных, между 12 и 13 неделями спустя трансплантации). В группе 3 случаев развития злокачественной тератомы отмечено не было, хотя гистологическое исследование подтверждало экспрессию в клетках α-фетопротеина (АФП).
Рис. 5. Развитие злокачественной тератомы (тератокарциномы) в сайтах трансплантации. (А-Б) Макроскопическая картина, (А) аксиальная, (Б) сагиттальная. Видимый объем опухоли очерчен белым пунктиром. (В) Микроскопическая картина.
Необходимо отметить, что данное исследование стало первым, в котором было доказано наличие обратной корреляции между длительностью пребывания чЭСК в культуре in vitro (как функции степени их дифференцировки) и риском развития злокачественной тератомы (солидной тератокарциномы) в сайте трансплантации производных чЭСК. Исследование же динамики моторных функций модельных животных не выявило даже тенденции к улучшению ни в одной из групп. Это, несомненно, обусловлено неадекватным количеством функциональных дофаминергических нейронов, переживших трансплантационную процедуру по сравнению с объемом токсического поражения. В этом отношении, полученный результат совпал с результатами более ранних экспериментов по трансплантации производных чЭСК структуры головного мозга животных, модельных в отношении возрастной нейродегенерации, в которых число выживших дофаминергических нейронов донорского происхождения было минимальным [Zeng X., et al., 2004] или равно нулю [Park C. H., et al., 2005]. Таким образом, исход трансплантации (в аспектах выживания клеток и развития опухолей) прямо зависит от уровня дифференциации используемых клеток-производных ЭСК, что представляет собой трудноразрешимый технологический парадокс. С одной стороны, по сравнению с незрелыми клетками, относительно зрелые дофаминергические нейроны (то есть клетки на высоком уровне дифференциации) являются в значительно большей степени чувствительными к стрессам, неизбежно сопровождающим работу с клетками в ходе трансплантационной процедуры, а также на непосредственно предшествующем ей этапе (подготовка клеточной суспензии) и после трансплантации [Brundin P., et al., 2000]. Можно предположить, что чистая популяция дофаминергических нейронов является значительно менее устойчивой к подобным стрессам, по сравнению
с гетерогенной популяцией, содержащей в том числе нейральные клетки других типов, способные оказывать дофаминергическим нейронам некоторую трофическую поддержку.
С другой стороны, в случае, если в используемой для трансплантации клеточной популяции содержатся резидуальные клетки с низким уровнем дифференциации, они могут стать причиной возникновения в сайте трансплантации злокачественной тератомы или нетератомных опухолей, с фатальными последствиями для реципиентов. Следовательно, поиск «окна возможности» проведения успешной трансплантации в уровне дифференциации дофаминергических нейронов-производных чЭСК (Рис. 6) является необходимым этапом отработки основанных на применении этих клеток подходов к заместительной клеточной терапии БП.
Рис. 6. Балансировка параметров трансплантационного материала. Сплошная линия, фракция зрелых клеток в гетерогенной популяции производных ЭСК; штрих-пунктирная линия (---), относительный риск формирования злокачественной тератомы в сайте трансплантации клеточного материала; пунктирная линия (…), способность клеток пережить трансплантационную процедуру (минимальна для недифференцированных ЭСК и зрелых нейронов с длинными отростками).
Получение «трансплантационных единиц» и их трансплантация модельным животным
Концепция применения «трансплантационных единиц» (Transplant Units, TU) была предложена автором как мера радикального повышения выживаемости нейронов-производных чЭСК при трансплантации. Выше отмечалось, обсуждалось, что массовая гибель донорских нейронов в сайте трансплантации (острая или отсроченная) является одним из критичных факторов, препятствующих успеху заместительной клеточной терапии возрастной нейродегенерации. Многочисленные вариации используемых протоколов направленной дифференцировки чЭСК в дофаминергические нейроны основаны
на культивировании клеток in vitro в течение продолжительного времени, и после накопления в клеточной популяции значительного количества функциональных дофаминергических нейронов, - диссоциация клеток и трансплантация клеточной суспензии. При этом жизнеспособность клеток резко снижается (до <2%) в ходе диссоциации исходной клеточной культуры с получением высококачественной суспензии (содержащей единичные клетки и минимальные (по 2-3 клетки) агрегаты клеток). Этот эффект может в значительной степени быть опосредован аноикисом: использующей механизмы апоптоза клеточной гибелью в результате утери межклеточных контактов и контактов с внеклеточным матриксом [Raff M. C., 1992; Meredith J. A., et al., 1993]. Выживаемость же зрелых дофаминергических нейронов (выделенных из эмбрионального/фетального мезенцефалона) является значительно меньшей, чем выживаемость незрелых нейронов, что обусловлено аксотомией. Между тем, длительность пребывания клеток в культуре обратно пропорциональна риску развития онкологических осложнений трансплантации. Отсюда, выбор популяции клеток-производных чЭСК не способных вызвать развитие онкологических осложнений в сайте трансплантации (безопасных), но при этом хорошо переносящих трансплантацию (эффективных) представляет собой серьезную проблему. Теоретически, применение агрегатов клеток-производных чЭСК могло бы позволить повысить выживаемость дофаминергических нейронов. В случае если бы конечной точкой протокола дифференцировки чЭСК in vitro в функциональные дофаминергические нейроны, могли стать не индивидуальные клетки (адгезивная культура), а агрегаты клеток (суспензионная культура), можно было бы избежать диссоциации клеток. При этом не проводилось бы энзиматическое и механическое воздействие на клетки; сохранялись бы установившиеся межклеточные контакты в пределах микроокружения дофаминергических нейронов, в том числе между нейронами и иными типами клеток.
Подобные агрегаты клеток-производных чЭСК должны удовлетворять следующим ключевым требованиям: 1) содержать максимально возможное число функциональных дофаминергических нейронов: т.е. эффективность протокола должна быть сравнимой
со стандартным протоколом; 2) не содержать резидуальных недифференцированных чЭСК; 3) быть достаточно малого размера для проведения трансплантации с использованием отработанной практики (т.е. проходимыми через носик микропипетки и иглу Гамильтоновского шприца); 4) быть достаточно большого размера, чтобы содержать значительно число клеток; 5) являться в значительной степени однородными
по величине/числу содержащихся клеток.
Поскольку эффективное формирование агрегатов недифференцированных чЭСК
(с последующей дифференцировкой в суспензионной культуре) с использованием стандартных методов (спонтанное образование ЭТ, «висячая капля», и т.д.) оказалось невозможным, было принято решение разделить протокол на 2 этапа:
Этап I: ко-культивирование чЭСК в течение 14-17 дней со стромальными клетками мыши линии РА6, с дифференцировкой в нейрональные/ дофаминернические прогениторные клетки, как описано выше; Этап II: перевод адгезивной культуры в суспензионную, с формированием в течение 6-7 дней «трансплантационных единиц» с заданными свойствами, содержащих дофаминергические нейроны и постмитотические дофаминергические прогениторные клетки. В основу протокола были положены несколько ключевых факторов:
1) Нейрональные/ дофаминернические прогениторные клетки значительно более устойчивы к диссоциации по сравнению с недифференцированными чЭСК и зрелыми дофаминергическими нейронами;
2) Получение большого количества таких клеток отработано (базовый протокол, основанный на принципе SDIA) и не вызывает значительных технических трудностей; Формированию агрегатов способствует непрерывное перемешивание клеточной суспензии непосредственно в СО2-инкубаторе, что обеспечивается обладающим уникальными характеристиками шейкером ES-X (Kühner AG, Швейцария; [Berglund C. M., et al., 2004];
3) Поддержанию клеток (а затем агрегатов) в суспензии способствует применение культурального пластика с особыми физическими свойствами;
4) На Этапе II протокола возможно продолжение индукции дофаминергической дифференцировки производных чЭСК за счет применения приспособленной (кондиционированной) питательной среды, обогащенной растворимыми факторами, секретируемыми стромальными клетками мыши линии РА6.
В результате отработки технологии, основанной на перечисленных выше ключевых факторах удалось получить однородную популяцию агрегатов клеток-производных чЭСК («трансплантационных единиц»), обладающих заданными свойствами и готовых
к непосредственной трансплантации (без диссоциации). В то время как технология Этапа I и диссоциации клеток папаином и аккутазой была отработана полностью как описано выше,
в ходе отработки технологии Этапа II, испытывали вариации всех ключевых параметров, включая следующие: 1) концентрацию клеточной суспензии: 50 000-500 000 кл/мл;
2) скорость перемешивания клеточной суспензии шейкером: 20-200 об/мин; 3) режим работы шейкера; 4) тип используемой питательной среды; 5) технология смены питательной среды; 6) параметры культурального пластика на подэтапах; 7) длительность каждого подэтапа
(II-a - II-в; по 2 или 3 дня) и Этапа II в целом (6, 7, 8 дней). Все эти параметры были отработаны в ходе пилотных экспериментов. После окончания Этапа I и диссоциации, суспензию клеток (во всех случаях жизнеспособность этих клеток составляла 66-88%) переносили в чашки Петри малого диаметра, изготовленных из пластика высокой адгезивности. Таким образом, на этом этапе (подэтап II-а) на суспензию клеток воздействовало перемешивание, но при этом клетки стремились прикрепиться дну чашки Петри. В результате, осуществлялась селекция клеток по адгезивным свойствам: высокоадгезивные стромальные клетки (контаминирующие клеточный пул стромальные клетки мыши линии РА6, используемые как фидерные на Этапе I), а вероятно и резидуальные недифференцированные чЭСК, прилипали к дну плашек, - в то время как менее адгезивные нейрональные/дофаминернические прогениторные клетки в большинстве включались в состав формируемых агрегатов клеток. После окончания подэтапа II-а, сформировавшиеся агрегаты клеток переносили из чашек Петри, изготовленных из пластика высокой адгезивности, в чашки Петри, изготовленные из пластика низкой адгезивности.
В результате, на этом этапе (подэтап II-б) продолжался рост агрегатов клеток, при этом проводилось отмывание мертвых клеток из суспензии. После окончания подэтапа II-б, сформировавшиеся агрегаты клеток продолжали культивировать в суспензионной культуре, заменяя питательную среду. На этом этапе (подэтап II-в) продолжался рост агрегатов клеток при непрерывном перемешивании.
Рис. 7. Получение чистой культуры «трансплантационных единиц»: день протокола 16+6. Использовались среда CNS (кондиционированная на клетках линии РА6 среда NS) и FGF-20 (1 нг/мл). Шкала = 100 мкм.
В результате исследования морфологии клеточных культур на подэтапах,
в соответствии с различными значениями перечисленных выше параметров была отработана технология, позволяющая получить значительное число однородных, пригодных для непосредственной трансплантации «трансплантационных единиц» (ТЕ) (Рис. 7). Иммуноцитохимическое исследование клеточного состава «трансплантационных единиц» подтвердило то, что в них широко представлены клетки нейронального ряда, в том числе экспрессирующие тирозингидроксилазу (ТН) дофаминергические нейроны. Также было выявлено, что находящимися в составе «трансплантационных единиц» клетками экспрессируются и другие маркеры, в том числе маркеры пролиферирующих клеток (Ki67, фосфорилированный гистоновый белок Н3 (РН3)) и плюрипотентных клеток (Nanog), нейронов (нестин, β-III-тубулин) и дофаминергических нейронов (питуитарный гомеобоксный белок 3 (PITX3), альдегиддегидрогеназы 1 (Aldh1a1), белка сходного
с ядерным рецептором 1 (Nurr1)); при этом экспрессия маркера плюрипотентных клеток Oct3/4 обнаружена не была. Содержание нейронов (оценивалось по экспрессии
β-III-тубулина) и дофаминергических нейронов (оценивалось по экспрессии ТН в ТЕ) было значительным: большой интерес представляла при этом их высокая концентрация в «корковых» областях ТЕ. Показательно, что содержание нейронов и дофаминергических нейронов в ТЕ значительно увеличивалось как при удлинении Этапа I протокола (16 или
18 дней), так и при добавлении в питательную среду FGF-20, являющимся, как показано выше, важным фактором стимуляции пролиферации производных чЭСК и выживаемости дофаминергических нейронов. Если в ТЕ сформированных в течение 16+6 дней обнаруживали 47,0+5,0% нейронов, в том числе 2,00,4% дофаминергических нейронов, - то в ТЕ сформированных в течение 18+6 дней обнаруживали уже 64,0+5,0% нейронов, в том числе 4,2+0,7% дофаминергических нейронов. При добавлении же в питательную среду FGF-20 (в концентрации 1 нг/мл), наблюдали дальнейшее увеличение содержания дофаминергических нейронов в ТЕ (до 13,02,0%). При этом увеличение содержания
в ТЕ нейронов было незначимым, что ещё раз свидетельствует в пользу специфичности действия FGF-20. Несколько репрезентативных ТЕ использовали для измерения количества содержащихся в них клеток: для этого проводили диссоциацию ТЕ в растворе аккутазы и подсчетывали число клеток в образовавшейся суспензии, с расчетом среднего значения.
В наших экспериментах, для протокола длительностью 16+6 дней, среднее значение числа клеток в одной ТЕ составило: для варианта, основанного на применении питательной среды NS и FGF-20 - 700 клеток/ТЕ; для варианта, основанного на применении питательной среды СNS (среды NS, кондиционированной на клетках линии РА6) - 14 800 клеток/ТЕ; и для варианта, основанного на применении питательной среды СNS и FGF-20 - 28 800 клеток/ТЕ.
В течение 6 недель после подготовки животных модельных в отношении локализованной, ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологией,
им производили инъекции ТЕ, являющихся агрегатами производных чЭСК линии SA002, содержащими дофаминергические нейроны (длительность протокола = 16+6 дней) (Рис. 7). Используя технику стереотаксической хирургии, модельным животным вводили в область полосатого тела число «трансплантационных единиц» эквивалентное 100 000 жизнеспособных клеток (общий объем около 4 мкл). Трансплантация ТЕ потребовала отработки особой техники введения основанной на применении «воздушного замка», при этом после завершения каждой трансплантации иглу шприца промывали и лаваж исследовали под микроскопом: это позволяло идентифицировать случаи, когда часть ТЕ оставались в игле шприца, и таким образом объем трансплантата снижался по сравнению
с запланированным. В ходе серий трансплантаций, техника трансплантации ТЕ была отработана, и суммарное время операции снизилось с 3-4 часов до 40 мин - 1,5 часов на серию из 6-8 крыс. При этом были сформированы следующие экспериментальные группы общей численностью 65 крыс: 1) Трансплантация «трансплантационных единиц», сформированных в присутствии FGF-20; 2) Трансплантация «трансплантационных единиц», сформированных без добавления FGF-20. В каждой серии трансплантаций проводили диссоциацию репрезентативных ТЕ для установления числа содержащихся в каждой ТЕ клеток: в соответствие с этим, каждой проводили трансплантацию 4-10 ТЕ. Так, например,
в отдельных сериях были получены следующие репрезентативные данные: 17 060 клеток/
ТЕ FGF20- (6 ТЕ/трансплантацию); 21 100 клеток/ТЕ FGF20- (5 ТЕ/трансплантацию);
19 800 клеток/ТЕ FGF20+ (5 ТЕ/трансплантацию); 11 658 клеток/ТЕ FGF20-
(9 ТЕ/трансплантацию), и т.д. Через 48 часов (2 суток) и через 2 недели после трансплантации, по 2 крысы из каждой группы в каждой серии умерщвляли для проведения гистологического исследования, направленного на изучение выживаемости и пролиферации донорских клеток. Остальных крыс использовали для исследования моторных функций в динамике, и умертвляли через 13-16 недель после трансплантации. В каждом случае, в ходе гистологического исследования выявляли наличие живых клеток донорского происхождения (т.е. клеток экспрессирующих человеческий ядерный белок, HNuc) в составе трансплантата, а также производных чЭСК экспрессирующих маркеры нейронов экспрессирующих нейрон-специфический ядерный антиген (NeuN), в том числе незрелых нейронов экспрессирующих β-III-тубулин и дофаминергических нейронов экспрессирующих ТН. При этом отмечали наличие в составе трансплантата двух морфологически отличающихся друг от друга типов клеток, экспрессирующих тирозингидроксилазу (ТН+ клеток): крупных клеток с длинными отростками и относительно мелких клеток с короткими отростками. Во многих случаях отмечали наличие кластеров ТН+ клеток, в том числе содержащих значительное число клеток. В общей сложности, во трансплантатах многих животных, принадлежащих к обеим экспериментальным группам идентифицировали от 500 до 1000 экспрессирующих тирозингидроксилазу клеток донорского происхождения, т.е. переживших трансплантационную процедуру дофаминергических нейронов-производных чЭСК.
Этот результат, обусловленный принципом трансплантации ТЕ без диссоциации, в корне отличается от результата трансплантации клеточной суспензии (когда в трансплантатах идентифицировали порядка 10-50 живых ТН+ клеток). При этом общий объем трансплантата (клеточная суспензия или ТЕ) был равным (100 000 жизнеспособны клеток), а доля дофаминергических нейронов в составе гетерогенной клеточной популяции была сравнима: 4,4% и 7,4% для клеточной суспензии (длительность протокола 20 и 23 дня, соответственно) и 2,0% и 13,0% для «трансплантационных единиц» (длительность протокола 16+6 дней, без добавления FGF-20 и в присутствии FGF-20, соответственно). Двадцатикратное повышение выживаемости дофаминергических нейронов в ходе трансплантации полностью оправдывает усложнение протокола дифференцировки (двухэтапный протокол) и трансплантации (манипуляции с ТЕ в ходе собственно трансплантации) и прямо подтверждает то, что выживаемость донорских клеток является функцией не только числа пересаженных клеток, но и техники трансплантационной процедуры. Различий в числе выживших дофаминергических нейронов между группами животных-реципиентов трансплантации ТЕ сформированных в присутствии FGF-20 и без добавления FGF-20, выявлено не было. Чрезвычайно важным является отсутствие признаков развития быстро растущей, злокачественной тератомы (тератокарциномы) в сайте трансплантации ТЕ у всех животных-реципиентов. Это подтверждает то, что двухэтапный протокол формирования ТЕ адекватен в отношении удаления из клеточной среды большинства или всех резидуальных недифференцированных/плюрипотентных чЭСК.
Исследование динамики моторных функций животных модельных в отношении локализованной, ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии не выявило статистически значимого улучшения в общем объеме групп реципиентов трансплантации ТЕ (эквивалент 100 000 жизнеспособных клеток). Между тем, отдельные модельные животные демонстрировали тенденцию к улучшению моторных функций, проявляющуюся в снижении соотношения между числом ипсилатеральных и контралатеральных поворотов животного
в течение ротометрического исследования (Рис. 8). Обнаружение данной тенденции, отличающей результаты эксперимента с трансплантацией «трансплантационных единиц»
от результатов всех проведенных ранее трансплантаций суспензии производных чЭСК, вероятнее всего обусловлены значительным повышением выживаемости донорских дофаминергических нейронов в ходе трансплантационной процедуры.
Рис. 8. Динамика моторных функций у модельных животных-реципиентов трансплантации «трансплантационных единиц», по данным ротометрического исследования перед трансплантацией (0 недель) и спустя 2, 6 и 8 недель. Показаны результаты для отдельных репрезентативных животных, продемонстрировавших тенденцию к улучшению моторных функций. Ипсилатеральный ответ рассчитан как соотношение между числом ипсилатеральных и контралатеральных поворотов в течение 90 минут исследования.
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям