Анисимов сергей Владимирович Применение стволовых клеток при возрастной нейродегенеративной патологии
|
|
Скачать 0.75 Mb.
|
|
Материалы и методы исследования |
|
^
Для изучения механизмов пролиферации и дифференцировки стволовых клеток, и разработки способа заместительной клеточной терапии локализованной, ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии использовались стволовые и фидерные клетки животных и человека, и экспериментальная модель локализованной возрастной патологии, а именно: Эмбриональные стволовые клетки мыши (мЭСК) линии R1 культивировали на фидерных (питающих) клетках - митотически инактивированных первичных культурах эмбриональных фибробластов мыши, в желатинизированных чашках Петри. Экспансию мЭСК линии R1 проводили в питательной среде на основе среды Игла в модификации Дюльбекко с высоким содержанием глюкозы (DMEM high glucose, Gibco BRL, США), с 15% сыворотки. Пассажи осуществляли энзиматически. Бесфидерные культуры мЭСК линии R1 вели с использованием среды BRL-CM «приспособленной» (кондиционированной) на культуре клеток мышиной печени (линия BRL) полученной из коммерческого источника (American Type Culture Collection, ATCC, США), с добавлением 1000 Ед/мл лейкемического ингибиторного фактора (LIF, Sigma, США или Chemicon, США), 0,01 мг/мл трансферрина (Sigma, США), и 0,45 мМ монотиоглицерина (Sigma, США). Эмбриональные стволовые клетки мыши (мЭСК) линии D3 (American Type Culture Collection, ATCC, США) культивировали на фидерных клетках - митотически инактивированных первичных культурах эмбриональных фибробластов мыши, в желатинизированных чашках Петри в присутствии лейкемического ингибиторного фактора (LIF, Sigma, США или Chemicon, США). Экспансию мЭСК линии R1 проводили в питательной среде на основе среды Игла в модификации Дюльбекко с высоким содержанием глюкозы (DMEM high glucose, Gibco BRL, США), с 10% сыворотки. Пассажи осуществляли энзиматически. Клетки эмбриональной карциномы (ЭК) мыши линии P19 культивировали в бесфидерной системе. Экспансию клеток ЭК линии Р19 проводили в питательной среде на основе среды Игла в модификации Дюльбекко с высоким содержанием глюкозы (DMEM high glucose, Gibco BRL, США), содержащей 10% сыворотки. Пассажи клеток ЭК линии Р19 осуществляли энзиматически. Полученные из первичных половых клеток (ППК) стволовые клетки мыши линии EG-1 культивировали на фидерных клетках - митотически инактивированных первичных культурах эмбриональных фибробластов мыши, в желатинизированных чашках Петри в присутствии LIF (Sigma, США или Chemicon, США). Экспансию клеток линии EG-1 проводили в питательной среде на основе среды Игла в модификации Дюльбекко с высоким содержанием глюкозы (DMEM high glucose, Gibco BRL, США), содержащей 15% сыворотки, 20 нг/мл LIF (Sigma, США или Chemicon, США) и 10 нг/мл лиганда с-Kit (BMA Biomedicals, Швейцария) также известного как soluble steel factor (SF), фактор стволовых клеток (SCF, также ростовой фактор тучных клеток (MGF)), KIT лиганд (KITLG, KL-1, Kitl) и DKFZp686F2250. Пассажи клеток линии EG-1 осуществляли энзиматически. Эмбриональные стволовые клетки человека (чЭСК) линии SA002 (также известна как SA02) были предоставлены компанией Cell Therepeutics Scandinvia / Cellartis AB (Швеция). Клетки культивировали на фидерных клетках - митотически инактивированных культурах эмбриональных фибробластов мыши или митотически инактивированных культурах неонатальных фибробластов крайней плоти человека, в желатинизированных плашках для искусственного оплодотворения (IVF-плашках). В качестве питательной среды для культивирования чЭСК линии SA002 использовали готовую питательную среду VitroHES (VitroLife, Швеция). Дополнительно в питательную среду добавлялся основной фактор роста фибробластов (bFGF, FGF-2) (R&D Systems, США) в концентрации 4 нг/мл. Пассажи осуществляли каждые 6 дней механически, с использованием стерильных клеточных ножей (диаметром 300 мкм, реже 200 мкм) и клеточных пипеток (диаметром 200 мкм, реже 300 мкм) (SweMed, Швеция) под 40-кратным увеличением инвертированного микроскопа CKX41 (Olympus, США), на установленной в манипулятор нагревательной площадке MATS-CKTS (вариант с утоньшением центральной части площадки) (Tokai Hit, Япония) с установкой температуры 42оС. Все манипуляции проводили исключительно под контролем электронного таймера, длительность пребывания IVF-плашек с чЭСК вне инкубатора во всех случаях не превышала 6 минут ровно. В ходе механических пассажей чЭСК линии SA002, использовали колонии чЭСК без признаков спонтанной дифференцировки и массовой клеточной, что указывалось следующими основными показателями: 1) полигональная или каплевидная форма колоний чЭСК, 2) отсутствие в пределах колоний фокусов темного (темно-серого, желтого, бурого) или светлого (очень светло-серого) цветов, 3) четкое контрастирование краев колоний на фоне фидерных клеток. В ходе экспансии использовали заморозку клеток чЭСК линии SA002 методом витрификации (остекленения) в соломинках, в целом согласно протоколу [Reubinoff B. E. et al., 2001]. При этом использовали крио-среды на основе человеческого сывороточного альбумина, трехалозы, этиленгликоля и диметилсульоксида (ДМСО). Эмбриональные стволовые клетки человека (чЭСК) линии HUES-3 были предоставлены кафедрой молекулярной и клеточной биологии Гарвардского университета (Кембридж, Массачусетс, США). Клетки культивировали на фидерных клетках - митотически инактивированных культурах эмбриональных фибробластов мыши или митотически инактивированных культурах неонатальных фибробластов крайней плоти человека, в желатинизированных чашках Петри. В качестве питательной среды для культивирования чЭСК линии HUES-3 использовали стерилизованную фильтрованием питательную среду Игла в модификации Дюльбекко (DMEM, Invitrogen, США), содержащую 10% плазманата (Plasmanate, Green Cross Corp., Япония). Дополнительно в питательную среду добавляли bFGF в концентрации 4 нг/мл. Пассажи чЭСК линии HUES-3 осуществляли каждые 4 дня (для культивирования на культурах эмбриональных фибробластов мыши) или 6 дней (для культивирования на культурах неонатальных фибробластов крайней плоти человека), энзиматически. Эмбриональные стволовые клетки человека (чЭСК) линии #237 были предоставлены отделением акушерства и гинекологии госпиталя Хаддинге (Karolinska University Hospital Huddinge) (Стокгольм, Швеция). чЭСК линии #237 культивировали на фидерных клетках - митотически инактивированных культурах эмбриональных фибробластов мыши или митотически инактивированных культурах неонатальных фибробластов крайней плоти человека, в желатинизированных IVF-плашках, как описано выше. В качестве питательной среды для культивирования чЭСК линии #237 использовали стерилизованную фильтрованием питательную среду Игла в модификации Дюльбекко в варианте «Нокаут» (КО-DMEM, также DMEM КО, Invitrogen, США), содержащую 20% заменителя сыворотки (Invitrogen, США). Дополнительно в питательную среду добавляли bFGF в концентрации 4 нг/мл. Пассажи чЭСК линии #237 осуществляли механически как описано выше для чЭСК линии SA002, или энзиматически при помощи обработки диспазой. В ходе экспансии использовали заморозку клеток методом витрификации в соломинках, в целом согласно описанному выше методу, но с использованием крио-среды на основе 4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES, Invitrogen, США), заменителя сыворотки, этиленгликоля, сахарозы и ДМСО. В качестве фидерных (питающих) клеток использовали эмбриональные фибробласты мыши (мЭФ) или фибробласты крайней плоти новорожденных (чНФ). Первичную культуру мЭФ получали из диссоциированных тканей мышиных эмбрионов (3 недели) линии С57BL/6; экспансию проводили в питательной среде на основе среды Игла в модификации Дюльбекко с высоким содержанием глюкозы (DMEM high glucose, Gibco BRL, США), с 10% сыворотки. Культуру неонатальных фибробластов крайней плоти человека (линия CCD-1112Sk) получали из коммерческого источника (American Type Culture Collection, ATCC, США; региональный центр в Голландии). Для пролиферации клеток использовали питательную среду на основе среды Искове (Iscove’s medium, IMDM; Invitrogen, США), с 10% сыворотки. Антимитотическую обработку мЭФ проводили митомицином С или гамма-радиацией (мЭФ, 30 Гр; чНФ, 40 Гр) с использованием экранированного облучателя Gammacell 1000 (MDS Nordion, Канада). Стромальные клетки мыши линии РА6 (также известны как MC3T3 G2; RICKEN, Япония) культивировали в стандартных условиях в питательной среде на основе минимальной среды Игла в модификации альфа (α-МЕМ); митотическую инактивацию не проводили. Дифференцировку стволовых клеток мыши разных линий запускали методом «висячей капли». Метод висячей капли основан на приготовлении серийных разведений суспензии стволовых клеток в специфической концентрации, 20-мкл капли которых инкубируются в течение 2 суток в присутствии ДМСО. Сформировавшиеся «эмбриональные тельца» доращиваются в течение 1 суток в большом объеме суспензионной культуры, и высаживаются на желатиновую подложку. Дифференцировку чЭСК в функциональные дофаминергические нейроны проводили с использованием протокола SDIA, основанном на совместном культивировании (ко-культивировании) чЭСК и стромальных клеток мыши в сложной клеточной системе в течение 14-23 дней. Фактор роста фибробластов 20 (FGF-20) использовался в протоколах направленной дифференцировки чЭСК в концентрации 100 пг/мл - 200 нг/мл питательной среды. Формирование агрегатов производных чЭСК проводили отбором спонтанно формирующихся эмбриональных телец, с использованием метода «висячей капли» описанного выше, на основе фрагментов колоний чЭСК, и с применением самостоятельно разработанного двухэтапного метода, позволяющего получить гомогенную популяцию «трансплантационных единиц» (Transplant Units, TU) с заданными свойствами. Разработанная техника создания «трансплантационных единиц» основана на последовательном применении двух технологий: 1) нейрональной дифференцировки чЭСК по протоколу SDIA и 2) культивировании коммитированных клеток в суспензионной культуре. На первом этапе работы, культивирование линий чЭСК и стромальных клеток мыши линии РА6 в сложной клеточной системе производилось в течение 14-18 дней. После завершения этапа, производилось отделение колоний производных чЭСК от подложки (стромальных клеток) при помощи обработки папаином (Worthington Biochemical Corporation, США). Инкубацию клеток с ферментом сочетали с механической обработкой, с соблюдением технологии известной как «метод звездного одеяла», и последующей диссоциацией клеток при помощи аккутазы (Innovative Cell Technologies, США). Клетки концентрировали центрифугированием и ресуспинзировали в питательной среде NS (Neurosphere Medium), состоящей из питательной среды N2 (Neurobasal Medium, Invitrogen, США), содержащей 2,0% заменителя сыворотки (реагент В27), 0,5 мМ L-глутамина и 4 нг/мл основного фактора роста фибробластов (FGF-2). Варинатами протокола являлись использование приспособленной на клетках линии PA6 среды NS (среды CNS), а также фактора роста фибробластов 20 (FGF-20). Диссоциированные клетки (производные этапа 1 направленной дифференцировки чЭСК в дофаминергические нейроны) исследовали в отношении жизнеспособности при помощи окраски трипановым синим (TrBlue, Sigma, США), после чего разводили питательной средой до концентрации 50 000-500 000 жизнеспособных кл/мл. При этом испытывались следующие варианты концентрации: 50 000, 100 000, 150 000, 200 000, 250 000, 500 000 кл/мл. 2 мл клеточной суспензии (то есть 100 000-1 000 000 жизнеспособных клеток) переносили в чашки Петри диаметром 35 мм с высокой адгезивностью (Nalgene, Дания), и инспектировали под микроскопом. Используя стерильные носики для механических пипеток, из чашек Петри (то есть из клеточной суспензии) удаляли все замеченные аггрегаты клеток и артефакты (фрагменты пластика, волокна, и т.п.). После этого маркированные чашки Петри помещали на рабочую площадку шейкера типа ES-X (Kühner AG, Швейцария), помещенную на дно СО2-инкубатора типа BBD6620 (Heraeus, Германия), с выносом управляющего (контрольного) блока шейкера на крышку инкубатора через пуповину, проведенную через технологическое отверстие на задней панели инкубатора. Значение скорости работы шейкера устанавливали 60 об/мин, с постепенным разгоном и торможением. После 2 суток инкубации, сформировавшиеся аггрегаты клеток (трансплантационные единицы) переносили в чашки Петри диаметром 20 мм с низкой адгезивностью типа NUNC (Дания) или Ultra Low Attachment (Corning, США). Для анализа функциональности дофаминергических нейронов-производных чЭСК использовали технологию высокопроизводительной жидкостной хроматографии (HPLC): при этом применяли прибор ESA Coulochem III (ESA Biosciences Inc., США). Клетки растворяли в хлорной кислоте с использованием ультразвуковой обработки (соникации). Супернатант собирали, фильтровали, и использовали для электрохимической детекции дофамина и метаболитов дофамина. Подвижная фаза (смесь ацетата натрия в концентрации 5 г/л, октансульфоновой кислоты 100 мг/л, ЭДТА 30 мг/л и 12% метанола; рН = 4,2) добавлялась с относительной скоростью 500 л/мин в колонку для обращенной хроматографии типа С18 (Chrompack/Varian, США). Анализ интенсивности пиков, соответствующих дофамину и 3,4-дигидрофенилуксусной кислоте (DOPAC) проводили с использованием программного пакета Azur Chromatographic (DATALYS, Theix, Франция). Для проведения иммуноцитохимического (ИЦХ) анализа, клетки фиксировали холодным 4% раствором параформальдегида (ПФА). Для ИЦХ анализа образцов «трансплантационных единиц» (ТЕ), их предварительно насыщали 30% раствором сахарозы и после фиксации замораживали в лунках пластиковой формы типа CryoMold (Sakura Finetek; Япония) с реактивом Tissue-Tek О.С.Т. (Sakura Finetek; Япония). Для проведения иммуногистоохимического (ИГХ) анализа тканей экспериментальных животных, крысы умерщвлялись введением 0,4 мл фенобарбитала интраперитонеально; используя перистальтический насос модели SciQ 323 (Watson Marlow Bredel, США) осуществляли перфузию большого круга кровообращения холодным 4% раствором ПФА (использовали минимум 300 мл ПФА). Головной мозг насыщали 30% водным раствором сахарозы с 0,5% азида натрия (NaN3). «Трансплантационные единицы» или образцы головного мозга экспериментальных животных помещали на площадку микротома поверх капли реагента O.C.T. Tissue-Tek (Sakura, Япония), и позиционировались/ориентировались по трём осям. Площадку микротома обкладывали сухим льдом, и образец примораживали; в ходе работы добавляли сухой лёд по мере необходимости. ТЕ нарезали на слои толщиной 6-8 мкм, образцы головного мозга - на слои толщиной 40 мкм. Слои последовательно раскладывали в 10 маркированных виалов. Гистологические образцы окрашивали по DAB с использованием системы АВС (ABC Staining System; Santa Cruz Biotechnology, США), либо стандартным методом. Фиксированные образцы пермиабилизировали 0,1% раствором Тритон Х-100, инкубировали с первичными антителами при комнатной температуре в течение 2 часов, в темноте, затем инкубировали с вторичными антителами в течение 2 часов при комнатной температуре, в темноте. При необходимости, после промывок образцы докрашивали 4',6-диамидино- 2-фенилиндолом (разведение до 300 нг/мл в 1% сыворотке). Для создания экспериментальной модели локализованной, ассоциированной с возрастном нейродегенеративной патологии в интересах отработки хирургической техники и изучения возможностей клеточной терапии, была использована технология, основанная на токсическом воздействии 6-гидроксидофамина (6-OHDA) на дофаминергические нейроны. В работе была использованы 121 половозрелая самка крыс линии Sprague-Dawley, полученных из питомника B&K Universal Ltd. (г. Соллентуна, Швеция) весом 180-220 г. За 10 мин до начала хирургической операции, крыс анастезировали интраперитонеальным введением фентанила и домитора (0,3 мг/кг живого веса и 6,3 мл/кг живого веса, соответственно). Анестезированных и маркированных крыс укладывали на рабочую площадку системы (рамки) стререотаксической хирургии (David Kopf Instruments, США). Крыс фиксировали в системе последовательным введением в оба ушных отверстия тупоконечных стержней (с контролем возможности движения в единственной оси) и установкой ограничителя (ТВ) с зацепом за передние резцы. Увеличение обеспечивалось применением систем хирургической стереомикроскопии SMZ-168 и SMZ-645 (Nikon, Германия). Координаты брегмы регистрировали в карте операции. Расчеты координат будущих инъекций токсина по продольной и сагиттальной осям проводили из расчета: Инъекция 1: сагиттальная ось: -4,4 мм от брегмы; продольная ось: -1,2 мм от брегмы (при установке ограничителя (ТВ, от “tooth bar”) -2,3 мм от нуля). Инъекция 2: сагиттальная ось: -4,0 мм от брегмы; продольная ось: -0,8 мм от брегмы (при установке ограничителя (ТВ) +3,4 мм от нуля). При этом перемещение расчетной точки производили вперёд по сагиттальной оси и вправо по продольной оси. Гамильтоновский шприц объемом 10 мкл устанавливали в рамку стререотаксической хирургии в строго вертикальное положение (контроль осуществляли по стеклянной призме). Иглу трижды промывали ледяным 0,02% раствором аскорбиновой кислоты (Sigma, США) в физрастворе. Раствор токсина готовили непосредственно пред началом серии инъекций, с соблюдением мер предосторожности. Инъекции токсина осуществляли по следующим суммарным координатам: Инъекция 1: 2,5 мкл токсина; сагиттальная ось: -4,4 мм от брегмы; продольная ось: -1,2 мм от брегмы; фронтальная ось: -7,8 мм от твердой мозговой оболочки (при установке ограничителя (ТВ) -2,3 мм от нуля). Инъекция 2: 2,0 мкл токсина; сагиттальная ось: -4,0 мм от брегмы; продольная ось: -0,8 мм от брегмы; фронтальная ось: -8,0 мм от твердой мозговой оболочки (при установке ограничителя (ТВ) +3,4 мм от нуля). При этом перемещение расчетной точки производили вперёд по сагиттальной оси, вправо по продольной оси, и вентрально по фронтальной оси. После проникновения под твёрдую мозговую оболочку, иглу погружали на заданную глубину. Инъекцию 1 токсина проводили со скоростью 0,5 мкл за 30 сек (не постоянно, а с интервалами длительностью 30 сек). После окончания инъекций, продолжали оказывать давление на поршень шприца в течение 5 мин, затем (не отпуская поршень) иглу медленно извлекали, используя соответствующий винт собственно стереотакса. После завершения Инъекции 2, крысам делали подкожные инъекции темгезика (разведение физраствором 1:10) в дозировке 1,7 мл разведения на кг веса животного и подожную инъекцию 2 мл физраствора. После 5 минут вне рамки, крысам делали подкожные инъекции антидота (разведение антиседана в дистиллированной воде 1:5) в дозировке 1 мл разведения на кг веса животного, затем вновь подожную инъекцию 2 мл физраствора. Частичное пробуждение наступало приблизительно через 6 мин после введения антидота. В опытах по трансплантации клеточной суспензии (производные чЭСК) животным модельным в отношении локализованной ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии, после завершения дифференцировки чЭСК по протоколу SDIA (дни 16, 20 и 23 протокола дифференцировки) производили отделение колоний производных чЭСК от подложки (стромальных клеток) при помощи обработки папаином (Worthington Biochemical Corporation, США), с последующей диссоциацией клеток при помощи аккутазы (Innovative Cell Technologies, США), как описано выше. Диссоциированные клетки исследовали в отношении жизнеспособности при помощи окраски трипановым синим (TrBlue, Sigma, США), после чего разводили в сбалансированном солевом растворе (солевом буфере) Хэнкса (HBSS) с добавлением 0,05% деоксирибонуклеазы I (ДНКазы I; Sigma, США) до концентрации 50 000 жизнеспособных кл/мкл. Используя систему для стереотаксической хирургии, модельным животным (крысы, получившие интрастриатальные инъекции 6-гидроксидофамина (6-OHDA)) вводили 100 000 жизнеспособных клеток (2 мкл клеточной суспензии). Инъекции проводили с использованием техники, полностью совпадающей с описанной выше. Инъекцию клеточной суспензии осуществляли по следующим суммарным координатам: сагиттальная ось: +1,0 мм от брегмы; продольная ось: -3,0 мм от брегмы; фронтальная ось: -5,0 мм от твердой мозговой оболочки. Клеточный материал хранили на льду, клетки использовали для трансплантаций в течение максимум 4 часов после отделения от подложки. Скорость инъекции составляла 0,5 мкл клеточной суспензии за 30 сек (не постоянно, а с интервалами длительностью 30 сек). После окончания инъекций, продолжали оказывать давление на поршень шприца в течение 5 мин, затем (не отпуская поршень) иглу медленно извлекали, используя соответствующий винт собственно стереотакса. Клеточный материал, не использованный для трансплантации модельным животным, применяли для засева индивидуальных лунок готовых 8-луночных «рамочных» плашек, покрытых смесью полиорнитина и ламинина (Becton, Dickinson, США), - по 14 000 живых клеток на лунку. Cпустя 24 часа плашки фиксировали, и изучали для уточнения клеточного состава пула использованных для трансплантации клеток. Трансплантация «трансплантационных единиц» животным модельным в отношении локализованной ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии проводилась с использованием техники стереотаксической хирургии, аналогичной описанной выше, однако с рядом важных изменений и дополнений. Перед началом трансплантации, «трансплантационные единицы» под контролем микроскопа пипеткой переносили из суспенизонной культуры в стерильную пробирку с небольшим объемом питательной среды. При этом проводилась селекция «трансплантационных единиц», не содержащих посторонних включений (обычно ворсинок или фрагментов пластика), имеющих правильную форму (шаровидную или округлую, вытянутую по одной из осей). Несколько (2-3) репрезентативных «трансплантационных единиц» диссоциировали аккутазой для измерения числа содержащихся в них клеток. Концентрацию суспензии диссоциированных клеток измеряли в счетной камере и нормализовали по числу диссоциированных «трансплантационных единиц». Все остальные, предназначенные для трансплантации «трансплантационные единицы» переносили в солевой буфер (сбалансированный солевой раствор) Хэнкса (HBSS) с добавлением 0,05% деоксирибонуклеазы I (ДНКазы I; Sigma, США) и пробирку помещали на лёд. Собственно трансплантацию производили в течение 40 минут - 2 часов после извлечения из СО2-инкубатора. Для трансплантации «трансплантационных единиц» в структуры головного мозга животных модельных в отношении локализованной, ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии использовали специальные иглы для Гамильтоновских шприцев объемом 10 мкл. Использовали остроконечные иглы размера 22G (Gauge) и 23G (Gauge). При этом наружные диаметры игл составляли 0,72 и 0,64 мм, соответственно; внутренние диаметры игл составляли 0,41 и 0,34 мм, соответственно; толщина стенок игл в обоих случаях составляла 0,15 мм. Загрузка «трансплантационных единиц» в Гамильтоновский шприц производилась под контролем световой микроскопии, на малом увеличении (х 3,5) микроскопа модели CK30 (Olympus, Япония). После подготовки животного к трансплантации и выверки координат стереотаксической хирургии, как описано выше, шприц вынимали из зажимов. На крышку стерильной чашки Петри наносили 2 отдельно лежащих капли солевого буфера Хэнкса (HBSS). Необходимое количество «трансплантационных единиц» (соответствующее 100 000 живых клеток) переносили из пробирки микропипеткой в одну из капель, затем, под контролем микроскопа - в другую. Для предупреждения выпадения «трансплантационных единиц» из шприца в ходе манипуляций, иглы Гамильтоновских шприцев после промывок загружали следующими слоями (считая от поршня к острию иглы): физраствор (целиком заполняет мертвое пространство иглы), «воздушный замок» (объем 0,3 мкл), чистый солевой буфер Хэнкса (HBSS; объем 1,5 мкл), солевой буфер Хэнкса (HBSS) с «трансплантационными единицами» (объем 2,5 мкл), «воздушный замок» (объем 0,3 мкл). Скорость инъекции составляла 0,5 мкл общего объема содержимого шприца за 30 сек (не постоянно, а с интервалами длительностью 30 сек). После окончания инъекций, продолжали оказывать давление на поршень шприца в течение 5 мин, затем (не отпуская поршень) иглу медленно извлекали, используя соответствующий винт собственно стереотакса. Эффективность трансплантации «трансплантационных единиц» контролировалась промывкой использованного для инъекций Гамильтоновского шприца физраствором, с изучением лаважа под световым микроскопом. Для предупреждения отторжения ксеногенного для модельных животных клеточного материала, проводилась агрессивная иммуносупрессорная терапия. За 1 сутки до проведения трансплантационной процедуры, крысам делали интраперитонеальную инъекцию циклоспорина А (Сандимунн, Novartis, Швейцария; разведение в физрастворе до 100 мг/мл) в дозировке 15 мг/кг живого веса. Также за 1 сутки до проведения трансплантационной процедуры, крысам делали интраперитонеальную инъекцию бетапреда (Бетаметазон, Glaxo-Wellcome, Швеция) в дозировке 0,12 мг/живого веса. В послеоперационном периоде животные содержались в полипропиленовых клетках, помещенных в стерильный кондиционируемый шкаф типа Scantainer (Scanbur Ltd., Дания). Инъекции циклоспорина А производили ежедневно в течение всего эксперимента, однако начиная с 15 дня после трансплантационной процедуры дозировку уменьшали до 10 мг/кг живого веса. Инъекции бетапреда производили ежедневно в течение 10 дней после трансплантационной процедуры, после чего прекращали. Анализ моторных параметров (моторных функций) животных модельных в отношении локализованной ассоциированной с возрастом нейродегенеративной патологии до и после трансплантации клеточного материала был основан на исследовании ротационного поведения со стимуляцией амфетамином. При использовании этого метода, значимые изменения ротационного поведения наблюдаются при потере 40-50% секреции дофамина в полосатом ядре (что соответствует потере >50% дофаминергических нейронов в substantia nigra pars compacta), при этом использование модели, основанной на «полном» токсическом поражении дофаминергических нейронов 6-гидроксидофамином («complete lesions») не сопровождается спонтанным и быстрым восстановлением моторных функций [128]. 3-4 недели спустя после введения модельным животным 6-гидроксидофамина, либо после трансплантации клеточного материала, с промежутками по 2-3 недели, крысам интроперитонеально вводили амфетамин из расчета 2,5 мг/кг веса, разведенный в стерильном физрастворе. Немедленно после этого крыс помещали в чашки системы ротометрии, и фиксировали защащенной пласиковым покрытием петлёй поперек тела. Мониторинг поворотов (ротометрия) производили с использованием автоматизированной системы Rotomax Analyzer (AccuScan Instruments Inc., США), при этом запись показателей ротометра производился с использованием программного обеспечения RotoMax v.1.40 (AccuScan Instruments Inc., США), а форматирование показателей и их импорт в формат MS Excell - с использованием программного обеспечения Rotolyze v.1.20 (также AccuScan Instruments Inc., США). В настройках программного обеспечения задавали: 1) идентификацию поворотов животного на каждые ¼ оборота (т.е. на 90о; регистрировалось как 0,25 оборота) и 2) проведение анализа промежутками по 5 минут, то есть минуты 0-5, 5-10, 10-15 анализа, и т.д. Общая длительность исследования составляла 90 минут. Одновременно могло исследоваться до 8 крыс. Исследование проводили в отдельном помещении с постоянным освещением; в ходе исследования минимизировали перемещения людей поблизости от испытуемых животных. Значение моторной функции животных (ротационный показатель) рассчитывали как отношение общего числа полных правых минус полных левых поворотов к длительности исследования в минутах. В опытах по изучению транскриптома стволовых клеток разных линий, тотальную РНК выделяли из клеток с использование систем RNase AWAY (QIAGEN, США). мРНК выделяли из тотальной РНК олиго(dT)-целлюлозой системой Messagemaker (Gibco BRL, США). кДНК синтезировали из 5 мкг мРНК с использованием системы cDNA Synthesis kit (Gibco BRL, США), с мечением продукта радиоактивным изотопом [α32P] (1 мккюри) (Amersham, США). Создание SAGE-библиотек осуществлялось на основе протокола 1.0с серийного анализа генетической экспрессии (SAGE) с многочисленными модификациями, в том числе собственными. При этом последовательно проводили создание ярлыков кДНК; создание, амплификацию, и очистку спаренных ярлыков кДНК; конкатемеризацию и клонирование спаренных ярлыков кДНК; контроль качества созданных SAGE-библиотек и их секвенирование; создание и пре-процессинг SAGE-каталогов; и процессинг SAGE-каталогов. В ходе работы, ярлыки кДНК создавали с использованием рестрикционных ферментов NlaIII (якорный фермент) и BsmFI (ярлыковый фермент) (New England Biolabs, США). Конкатемеры ярлыков кДНК клонировали в клетки E.coli ElectroMAX DH10B (Gibco BRL, США) при помощи плазмидного вектора pZeRO-1 (Invitrogen, США) и электропорационного аппарата Gene-Pulser II (Bio-Rad, США). Селекцию бактериальных клонов производили на низкосолевом LB-агаре с зеоцином (50 мкг/мл). Качество клонирования контролировали при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) и структурирование конкатемеров проверяли определением их нуклеотидной последовательности (секвенированием) на полуавтоматическом секвенаторе MBI310 Prizm (PE Applied Byosistems, США). Бактериальные клоны выращивали в 96-луночных плашках с питательным бульоном ТВ/зеоцин, крупномасштабное секвенирование производилось фирмой Celera Genomics/PE Applied Byosistems (США). Ярлыки кДНК идентифицировали при помощи программного пакета SAGE 2000 Version 4.12, идентификация ярлыков кДНК производилась с использованием баз данных Национального Центра биотехнологической информации США. Для работы по анализу характеристик транскриптома стволовых клеток и их производных, в том числе в динамике, была создана собственная высокоспециализированная микрочиповая платформа «NeuroStem». Основными группами генов мишеней платформы являются: I. Гены «стволовости» (установленные/общепринятые маркеры, кандидатные маркеры, вторичные гены-мишени, биологически связанные с генами «стволовости»); II. Гены нейральных и нейрональных клеток разных типов (в том числе пан-нейральные маркеры, имеющие разный уровень специфичности маркеры клеток нейрального/нейронального рядов, маркеры роста таких клеток, их окончательной дифференцировки, созревания (матурации), миграции, миелинизации, разветвления (браншинга) аксонов нейронов, образования синапсов, и т.п., гены вовлечённые в патогенез различных нейродегенеративных заболеваний); III. Гены коммитирования/дифференцировки стволовых клеток в клетки нейрального/нейронального рядов (маркеры роста и деления клеток, дифференцировки, регенерации, нейральной/нейрональной дифференцировки, и т.п.); дополнителельно (без выделения в собственные группы) были использованы гены, соответствующие многочисленным типам контролей: а) положительных и б) отрицательных), в том числе гены, обладающие относительно высоким уровнем экспрессии в клетках любых типов (так называемые «гены домашнего хозяйства»), гены, соответствующие маркерам отдельных типов клеток, не являющихся нейронами и глиальными клетками, и т.д., в) гены, относящиеся к системе апоптоза (программируемой клеточной гибели), г) так называемые «часовые гены», имеющие отношение к синхронизации биологических ритмов, д) гены, относящиеся к антиоксидантной системе, е) импринтинговые гены, ж) гены (члены семейств генов), вовлеченные в сигнальные системы FZD, WNT, BMP, STAT, FGF, з) гены систем каспаз и Kruppel-гены, и) гены, относящиеся к теломерной/теломеразной системе, й) маркеры раковых клеток. Длинные олигонуклеотидные зонды (длина = 69-71 нуклеотиду) соответствующие избранным генным мишеням были избраны из баз зондов человека AROS версий V2 (22272 вводных) и V3 (5520 вводных) (Operon Biotechnologies Inc., США). Печать микрочиповых платформ осуществлялась компанией SweGene (Швеция), являющейся автономным подразделением/дочерним предприятием Люндского университета (Швеция) (SweGene DNA Microarray Resource Centre, Department of Oncology at Lund University). Печать производилась роботизированой системой (споттером) типа MicroGrid II 600R arrayer, с наконечниками (печатающими головками) типа MicroSpot 10 K (Harvard BioRobotics, США). Платформы печатали на стеклянных пластинках (слайдах) формата предметных стёкол, типа UltraGAPS aminosilane slides (Corning Inc., США). Плотность печати составляла 140 мкм между центрами точек нанесения генетического материала (зондов) и 90-110 мкм диаметр точек нанесения генетического материала. Непосредственно после печати готовые платформы маркировались наклейками с уникальными штрих-кодами, сушились и хранились до момента использования в закрытых непрозрачных пластиковых контейнерах в вакууме. Срок хранения готовых микрочиповых платформ не превышал 4 месяцев после печати. Тестирование готовых микрочиповых платформ (тестирование качества печати) осуществлялось визуальным обследованием (микроскопией) и пробной (тестовой) гибридизацией с образцом РНК гарантированно имеющим высокий уровень экспрессии широкого спектра генов разных семейств, - представляющим собой готовую смесь РНК человека, Human Universal Reference RNA (Stratagene, США). Оценивалась точность печати как в отношении правильности размеров и однородности размеров точек нанесения генетического материала (зондов), так и точности нанесения точек отосительно друг друга в пределах одного блока, и отдельных блоков отосительно друг друга в пределах одной платформы (слайда), а также положение всей зоны печати в пределах слайда и ориентировка блоков (по экспрессии β-актина, уникальная точка нанесения в левом верхнем углу каждого из блоков) и зоны печати целиком, отсутствие артефактов (ворсин, царапин, и т.п.). Для применения микрочиповых платформ «NeuroStem» в эксперименте по изучению транскриптома стволовых клеток и их производных, последовательно проводили синтез кРНК-зондов, меченных флуоресцентными красителями; прегибридизацию; гибридизацию; постгибридизационные отмывки; сканирование и трансформацию данных; анализ данных. Синтез кРНК-зондов с интегрированным этапом мечения флуоресцентными красителями проводили с использованием системы Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification Kit (Agilent Technologies, США). Предварительно тестированные образцы высококачественной тотальной РНК (50-500 нг) разводили или концентрировали (с использованием вакуумного концентратора SpeedVac; Thermo Scientific, США)). В качестве контроля использовали готовую смесь РНК человека (400 нг) Human Universal Reference RNA (Stratagene, США). В каждую пробирку с образцом РНК добавляли смесь, содержащую обратную транскриптазу MMLV (RT MMLV), а на следующем этапе - флуоресцентный краситель цианин-3-ЦТФ (Су3) либо цианин-5-ЦТФ (Су5) (Perkin-Elmer, США). Для синтеза кРНК, в пробирки с продуктами первой реакции добавляли смесь, содержащую неорганическую пирофосфатазу и Т7 РНК-полимеразу. Продукты второй реакции экстрагировали с применением системы RNeasy mini (QIAGEN, США). Качество образца оценивали по флуоресценции Су3 или Су5 с помощью спектрофотометрии на спектрофотометре ND-1000 (Nano-Drop, США). Стеклянные слайды системы “NeuroStem” облучали УФО в ДНК-кросслинкере Biolink (BioMetra, США) с установкой уровня энергии 800 мДж/см2. Гибридизацию проводили с использованием системы MAUI в рабочем режиме гибридизации «А», при этом применяли сборные камеры типа 1 MAUI Mixer AO plate (BioMicro Systems, США). Гибридизацию флуоресцентных проб с микрочиповыми платформами (слайдами) проводили при 42оС в течение 17 часов. После постгибридизационных отмывок, слайды помещали (с использованием адаптеров) в гнёзда карусели роботизированного сканера высокого разрешения типа DNA Microarray Scanner G2565CA (Agilent Technologies, США). Ориентация штрих-кодов соответствовала требованиям сканера штрих-кодов. Запись данных (с инкорпорацией штрих-кода, считанного с соответствующей позицией на карусели сканера) осуществлялась с использованием программного пакета DNA Analytics Software (Agilent Technologies, США), немедленный контроль качества сканирования (в частности, полноты сканирования) - с использованием программного пакета GenePix Pro (Axon Instruments, США). Изображения форматировали (переворачивали и разводили на «зелёное» и «красное») с использованием программного пакета Tiff Image Channel Splitter Utility (Agilent Technologies, США). После форматирования изображения производили приложение координатной сетки, с адаптацией её положения вручную для слайда в целом, и для каждого блока в отдельности. Для каждого слайда затем проводился контроль отсутствия артефактов для каждой точки нанесения материала в пределах каждого блока. Под артефактами понимались следующие варианты: 1) кристаллы флуоресцентных красителей, совпадающие по координатам с индивидуальными точками нанесения материала, 2) ворсинки или 3) царапины, совпадающие по координатам с индивидуальными точками нанесения материала (или несколькими точками сразу). В каждом таком случае точка нанесения материала маркировалась «флагом», отрицающим её использование для анализа. Одновременно проводилась уточнение размеров автоматически наложенной на координатную сетку разметки сбора сигнала в соответствие с интенсивностью сигналов для индивидуальных точек. В отдельных случаях, особыми «флагами» маркировались точки без сигнала, что отрицало их использование для анализа, но не для расчета интенсивности фонового сигнала. Данные трансформировали из изображений в цифровую форму (интенсивность сигнала, ассоциированная с конкретной точкой нанесения генетического материала (зонда), обладающей уникальным ярлыком (именем) с использованием программного пакета GenePix Pro (Axon Instruments, США); использовалась функция сокращения («вычитания») интенсивности фонового сигнала, рассчитываемая индивидуально для каждого гибридизованного слайда. Нормализацию данных проводили индивидуально для каждого блока микрочиповой платформы с использованием алгоритма LOWESS со значением фактора сглаживания принятым равным 0,33. Сведение данных от технических репликатов и анализ данных проводили с использованием базы данных и комплекса аналитического программного обеспечения BioArray Software Environment database (BASE; http://base.thep.lu.se/, Люндский университет, Швеция). Визуализацию графиков вариации интенсивности сигнала осуществляли с использованием программы TIGR MultiExperiment Viewer (MEV; http://www.tm4.org/mev/; http://www.tigr.org) из состава программного пакета TM4 Microarray Software Suite (Dana-Farber Cancer Institute, США). Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ) производилась на программируемом амплификаторе типов GeneAmp PCR System 9600 (Perkin-Elmer, США) или MiniOpticon (Bio-Rad, США). Праймеры для ПЦР-ОТ были избраны из опубликованных ранее работ или разработаны с использованием программного обеспечения Oligo 4.0 (Molecular Biology Insight, США), Primer3 или Clone Manager Suite 7.1 (Sci Ed Software, США). Использовали Tth полимераза (Promega, США), либо полимеразу REDTaq (Sigma-Aldrich, США). Переменные (число циклов амплификации, температура отжига) отрабатывались на этапе отработки оптимальной технологии ПЦР-ОТ, в том числе с использованием функции «градиента температуры» программируемого амплификатора MiniOpticon (Bio-Rad, США). Продукты ПЦР-ОТ анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле, с визуализацией окрашиванием бромидом этидия. Интенсивность сигналов продуктов ПЦР-ОТ анализировалась при помощи программного пакета Multi-Analyst 1.1 (Bio-Rad, США). |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям