Реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение. 14. 00. 16 патологическая физиология 03. 00. 13 физиология
|
|
Скачать 278.68 Kb.
|
|
На правах рукописи Шаинидзе Кристина Зурабовна Реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение. 14.00.16 – патологическая физиология 03.00.13 – физиология АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2009 Работа выполнена в отделе Общей патологии и патофизиологии, Научно-исследовательском институте Экспериментальной медицины Северо-Западного отделения Российской Академии Медицинских Наук и на кафедре анатомии и физиологии человека и животных Российского Государственного Педагогического Университета им. А.И. Герцена Научные руководители: Академик РАМН Корнева Елена Андреевна Д.б.н. проф. Даринский Ю.А. Официальные оппоненты: 1. Чернышева Марина Павловна, доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии общей физиологии человека и животных Санкт-Петербургского Государственного Университета. 2. Петрищев Николай Николаевич, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой патофизиологии Санкт-Петербургского медицинского университета им. И.П. Павлова. Ведущая организация: Российская Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова. Защита состоится «23» июня 2009 г. в «11» часов на заседании диссертационного совета Д001.022.02 при Научно-исследовательском институте Экспериментальной медицины СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Научно-исследовательского института Экспериментальной медицины СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12. Автореферат разослан «22» мая 2009 г.
^ Актуальность проблемы. На протяжении многих десятилетий главной задачей нейроиммунофизиологии являлось изучение возможных связей между нервной и иммунной системами. Применение прецизионных методов молекулярно-биологического и молекулярно-генетического анализа в сочетании с иммуногистохимическими методами исследования дало возможность оценить вовлеченность различных структур мозга, а также степень участия различных биологически активных веществ, вырабатываемых нервными клетками, в механизмах реализации нейроиммунных взаимодействий. В настоящее время широко изучается влияние стресса на функции нервной и иммунной систем. Стресс-индуцированные изменения в работе этих систем исследуются на экспериментальных моделях и в клинической практике у пациентов после длительных психоэмоциональных переживаний. Имеется большое количество работ, отражающих возможность позитивного и негативного эффектов действия стресса на защитные функции организма (Rybakina E.G. et al., 1996; Shanin S.N. et al., 2005; Sheridan J.F. et al., 1991; Brenner G.J. and Moynihan J.A., 1997; Glaser, R. Et al., 1990), причем характер их влияния зависит от интенсивности и длительности стрессорного воздействия, а также от исходного функционального состояния (Меерсон и др., 1984; Фролов., Б.А., 1987; Rybakina E.G. et al., 1997). Применение подобных моделей экспериментального стрессорного воздействия позволяет изучить и возможную роль различных нейромедиаторов и нейропептидов в механизмах реализации реакций мозга на стрессорные воздействия. Есть основания полагать, что открытые в 1998 году нейромедиаторы орексин А и орексин В могут принимать участие в реализации реакции мозга на стрессорные воздействия. Установлено, что основное количество орексин-содержащих нейронов расположено в области латерального гипоталамического поля (LHA) (De Lecea L. et al., 1998). Небольшое количество их также представлено в паравентрикулярном (PVN), дорзомедиальном (DMH) ядрах и заднем поле гипоталамуса (PH) ( Peyron C., 1998). С помощью иммунногистохимического метода выявления c-Fos белка и орексина А в клетках мозга установлена избирательность реакции орексин-содержащих нейронов при различных стресс-индуцирующих воздействиях. Показано, что данные воздействия приводят к активации доли орексин-содержащих нейронов гипоталамуса, которая варьируется в зависимости от силы и длительности применяемого воздействия (Moriguchi T., 1999; Kurose T. et al., 2002; Estabrooke I.V. et al., 2001; Zhu L. et al., 2002). При охлаждении и ограничении подвижности молодых крыс показано увеличение количества c-Fos-позитивных орексин-содержащих клеток гипоталамуса на 15 и 24 % соответственно (Ida T. et al., 2000; Sakamoto F. et al., 2004), тогда как применение болевого разражения активирует более 90% орексин-позитивных нейронов гипоталамуса (Zhu L. et al., 2002). Однако изменения интенсивности синтеза м-РНК препроорексина не столь однозначны: при ограничении подвижности, охлаждении, гипогликемии и ограничении питания количество м-РНК препроорексина возрастает, тогда как при реакциях страха – напротив снижается (Ida T., et al. 2000; Sakamoto F. et al., 2004; Kurose T. et al., 2002; Zhu L. et al., 2002). По-видимому, избирательность реагирования орексин-содержащих нейронов на стрессорные воздействия разного рода, может быть связана с функциональными различиями популяции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса. Внутрижелудочковое введение орексина ведет к стимуляции секреции адренокортикотропного гормона (АКТГ) (Ida T. et al., 2000; Sakamoto F. et al., 2004; Kuru M., et al. 2004; Samson W.K., 2002), активации ГГАС (Kuru M. et al., 2004), повышению уровня кортикостерона в плазме крови (Kuru M. et al., 2004; Kurose T., et al., 2002; Jaszberenyi M., et al., 2000; Jaszberenyi M., et al., 2001; Hagan J.J., et al., 1999; Al-Barazanji K.A., et al., 2001; Russell S.H., et al., 2001; Mullett M.A., et al., 2000), а также увеличению количества с-Fos-позитивных нейронов в мелкоклеточной части PVN, на мембранах которых были обнаружены рецепторы к орексинам (Trivedi P. et al., 1998). Появившиеся в последнее время данные свидетельствуют о том, что орексин-содержащие нейроны помимо участия в ответе на стрессорные воздействия, вовлечены в процесс терморегуляции и теплопродукции (Monda M, 2001; Monda M, 2003; Monda M, 2003; Monda M, 2004; Jaszberenyi M, 2002; Digby J. E., 2006; Székely M, 2002). Однако, данные работ, в которых показана причастность орексин-содержащих нейронов к процессу терморегуляции, неоднозначны. Известно, что дорзомедиальное (DMH) и паравентрикулярное (PVH) ядра, а также латеральное и заднее (PH) гипоталамические поля, в которых представлены орексин-содержащие нейроны, имеют причастность к процессу теплопродукции (Imai-Matsumura K. et al 1984; Amir, 1990; Zaretskaia, 2002; Cao 2004, Tanaka, et al 2001). При разных условиях внутрижелудочковое введение орексина А может вызывать как повышение температуры животного, так и понижение (Monda M, 2001; Monda M, 2003; Monda M, 2003; Monda M, 2004; Jaszberenyi M, 2002; Digby J. E., 2006; Székely M, 2002). У мышей, ноккаутных по гену препроорексина отсутствуют циркадные изменения температуры тела (Mochizuki T., 2005). Наряду с данными, свидетельствующими о действии орексина на процесс терморегуляции, известны и данные о контролирующем действии коры на терморегуляционный эффект орексина: подавление активности коры во фронтальной области блокирует повышение температуры тела, вызванное внутрижелудочковым введением орексина А (Monda M., 2004). Кроме того внутрижелудочковое введение орексина А снижает лихорадку, вызванную введением LPS (Jaszberenyi M., 2002). Известно, что ограничение подвижности, охлаждение животных и комбинированный стресс (ограничение подвижности в сочетании с охлаждением) запускают ярко выраженную стрессорную реакцию, инициируя значительные изменения содержания в плазме крови катехоламинов и глюкокортикоидов (Sheridan et al., 1991; Pacak K., 2001). Таким образом, применение адекватной экспериментальной модели стресс-индуцирующего воздействия позволит расширить представления о степени участия орексин-содержащих нейронов гипоталамуса в развитии комплекса реакций, протекающих в мозге в процессе формирования ответа на стрессорное воздействие. Решение данного вопроса представляется актуальным для фундаментальной науки и направлено на раскрытие механизмов реализации реакции нейронов гипоталамуса, синтезирующих орексин, на изменения, происходящие в центральной нервной системе на фоне стрессорного воздействия. ^ явилось изучение реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса на экспериментальное ограничение подвижности и охлаждение животного. ^
^
^ Работа является приоритетным экспериментальным исследованием и этапом в развитии нового научного направления по изучению участия нейромедиатора орексина в механизмах реализации реакций мозга на стрессорные воздействия. При помощи сочетанного применения методов оценки экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса и иммуногистохимического выявления орексина в нейронах перифорникальной гипоталамической области впервые проведен детальный анализ реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение. Определен паттерн вовлечения этих нейронов, локализованных в различных структурах гипоталамуса крыс, в процесс реализации реакции мозга на ограничение подвижности и охлаждение. Выявлена дискретность функциональных изменений, происходящих в орексин-содержащих нейронах, представленных в структурах гипоталамуса крыс, при ответе на данные стрессорные воздействия. Определены структуры и зоны гипоталамуса крыс, в которых наблюдается нарушение баланса синтеза и утилизации орексина А в орексин-содержащих нейронах при ограничении подвижности и охлаждении. Результаты работы расширяют и дополняют сложившиеся в настоящее время представления о системе орексин-эргичеких нейронов и могут быть использованы в научной практике, связанной с исследованием клеточных и молекулярных механизмов формирования ответа организма на стрессорное воздействие, а также могут войти в курс преподавания по физиологии, патофизиологии, нейрофизиологии и иммунологии. ^ Материалы исследования изложены в 6 публикациях, в том числе представлены на Российских и Международных конференциях:
^ Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований, выводов и списка цитируемой литературы из 258 источников, из них 249 - зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 17 рисунками и 5 таблицами. ^ Работы была выполнена на 80 крысах-самцах, породы Wistar, весом 200-250г. Опыты начинали в 11 часов утра с целью нивелирования различий, связанных с суточными колебаниями содержания орексина в клетках гипоталамуса. Экспериментальные животные были поделены на 2 группы. I-ой группе животных ограничивали подвижность в течение 1 часа. II группе также ограничивали подвижность в течение часа, но после первых 20 минут они подвергались охлаждению: – 20 С. в течение 20 минут. После охлаждения животные II группы находились в контейнерах, ограничивающих подвижность оставшиеся 20 минут. Взятие материала проводили через 20, 40, 60, 90, 120 минут от начала опыта. По завершению опыта животные были наркотизированы фенобарбиталом (в/б 60мкг/кг веса животного). В качестве контроля использовали интактных животных, которых наркотизировали фенобарбиталом (в/б 60мкг/кг веса животного) одновременно с экспериментальными. Для проведения полимеразно-цепной реакции в реальном времени (PCR RT) по завершению опыта у наркотизированных крыс извлекали мозг и помещали в Purezol (BioRad). Выделение пула РНК клеток гипоталамуса производилось с помощью набора «Aurum Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Pack» (Bio-Rad). Реакция синтеза к-ДНК/Обратная Транскрипция (ОТ) осуществлялась с использованием набора One Step RT PCR Kit (BioRad). Для проведения реакции использовались праймеры, рассчитанные по программе и произведенные лабораторией «СинТол». Регистрация длины продукта была проведена методом электрофореза в агарозном геле. Контроль над ходом реакции и регистрацию данных производили с помощью ПК и программы «Opticon Monitor 3.1». Уровень экспрессии гена препроорексина определяли относительно уровня экспрессии гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы и рассчитывали по формуле встроенным программным обеспечением амплификатора. Для иммуногистохимического анализа животных подвергали интракардиальной перфузии с последующим приготовлением замороженных срезов мозга. Детекцию орексин-содержащих нейронов гипоталамуса осуществляли авидин-биотиновым методом с применением кроличьих антител к орексину А (1:5000) (Sigma) и моноклональных анти-кроличьих иммуноглобулинов (клон RG-16), конъюгированных с биотином (1:1000) (Sigma), выявление которых проводили с помощью авидин-пероксидазной метки. В качестве субстрата для пероксидазы использовали 3’3 диаминобензидин (DAB) (Sigma). При анализе иммуногистохимически окрашенных срезов мозга оценивали количество орексин-позитивных клеток во всех структурах, соотвтетствующих 25-32 уровням срезов гипоталамуса в соответствии с атласом мозга крыс (Swanson L.W., 1992). Окрашивание срезов мозга всех групп животных, проводили одновременно. Время окраски было строго стандартизировано. При подсчете клеток, учитывали только клетки, с четко окрашенными контурами и наполненные гранулами с орексином не меньше чем на 1/3 клетки. Результаты экспериментов обрабатывали с помощью стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивали по t-зависимому критерию Стьюдента. Подсчеты данных и построение гистограмм выполнены на IBM PC при помощи программы Excel. ^ Измерение уровня экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе крыс при ограничении подвижности и охлаждении. Для определения реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на применяемые стрессорные воздействия проводили исследование динамики изменения синтеза орексина косвенно по изменению уровня экспрессии гена препроорексина (Рис.1). У интактных животных в период с 11-40 до 13-00 часов в клетках гипоталамуса крыс происходит постепенное увеличение экспрессии гена препроорексина. Относительный уровень экспрессии гена препроорексина у интактных животных в 12-00 был в 3.6 раза выше по сравнению с ее уровнем у интактных животных в 11-40. Затем в 12-30 уровень экспрессии гена препроорексина значительно снижался (в 8 раз) и снова возрастал к 13-00. Сразу после окончания ограничения подвижности уровень экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса уменьшается в 10 раз по сравнению с его уровнем у интактных животных (Рис 1), а через 1 час – увеличивается в 5.7 раз по сравнению с его уровнем у интактных животных.  ^ По оси ординат – (Y) – уровень экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе крыс; по оси абсцисс (X) – время опыта. ^ ■- интактные; подвергнутые: ■- ограничению подвижности, ■- ограничению подвижности и охлаждению *p < 0.05, **p < 0.005 по сравнению с уровнем экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе у интактных животных, взятых в опыт в предыдущий срок; # p < 0.05, ## p < 0.005 по сравнению с уровнем экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе у интактных животных; ■ p < 0.05 по сравнению с уровнем экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе у животных, подвергнутых ограничению подвижности. Анализ интенсивности экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе крыс при комбинированном воздействии – ограничении подвижности и охлаждении – выявил снижение количества м-РНК препроорексина в 10 раз сразу после окончания стрессорного воздействия по сравнению с его уровнем у животных контрольной группы (животные, подвергнутые ограничению подвижности) (рис.1). Через 30 минут сохраняется значительное снижение уровня экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе крыс, а через 1 час констатировано снижение уровня экспрессии гена препроорексина в 6 раз в клетках гипоталамуса крыс по сравнению с его уровнем у животных контрольной группы. Сравнение данных, полученных в результате анализа экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса, крыс позволяет заключить, что наиболее значительные изменения интенсивности его экспрессии наблюдаются сразу и через час после окончания стрессорных воздействий. Поэтому в следующей серии экспериментов явился иммуногистохимический анализ реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и комбинированное воздействие (ограничение подвижности и охлаждение) проводили через час после их окончания. ^ Орексин-содержащие нейроны характеризуются разнообразием форм: сферическая, эллипсоидная, треугольная. У интактных животных нейроны заполнены орексиновыми гранулами, имеют четко окрашенные контуры. Показано, что орексин-содержащие нейроны локализованы, главным образом, в перифорникальной области латерального гипоталамического поля (LHA). Небольшое количество их также представлено в паравентрикулярном (PVN), дорзомедиальном (DMH) ядрах и заднем поле гипоталамуса (PH). В гипоталамусе интактных крыс орексин-содержащие нейроны расположены в структурах, представленных на срезах мозга с 25 по 32 уровни. Максимальное количество орексин-позитивных клеток располагается в структурах, локализованных на срезах мозга 28-го, 29-го, 30-го уровней. У животных после ограничения подвижности происходит снижение степени иммунореактивности орексин-позитивных нейронов в структурах гипоталамуса, расположенных на 28 уровне среза мозга крыс, что проявляется в снижении степени визуализации орексин-позитивных нейронов, локализованных в этой области и соответственно уменьшении количества определяемых орексин-позитивных нейронов. То есть значительная часть орексин-позитивных клеток на срезах мозга у животных экспериментальной группы содержит меньше орексина в сравнении с его содержанием в орексин-позитивных клетках гипоталамуса интактных животных, что на срезах проявлялось снижением общего количества нейронов, в которых иммуногистохимически выявляли орексин. При анализе общего количества иммунореактивных орексин-содержащих нейронов у экспериментальных животных после ограничения подвижности определено изменение степени иммунореактивности орексин-содержащих нейронов (Таблица 2). Как видно из таблицы, в структурах гипоталамуса, локализованных на срезах, относящихся к 28 уровню мозга крыс, иммунореактивность орексин-содержащих нейронов снижена на 17%. В противоположность этому на срезах мозга 31 уровня, выявлено увеличение количества орексин-позитивных нейронов на 19% (Рис 2). При комбинированном воздействии – ограничении подвижности и охлаждении – у экспериментальных животных на 31 % повышается количество орексин-позитивных нейронов в структурах гипоталамуса, расположенных на срезах мозга 28-го уровня (Рис. 2). В структурах гипоталамуса, локализованных на 31 уровне среза мозга крыс, наблюдается тенденция к снижению степени иммунореактивности орексин-содержащих нейронов (13 %). Изменений иммунореактивности орексин-содержащих нейронов в структурах гипоталамуса, расположенных на 29, 30 и 32 уровнях срезов, не выявлено. Таблица 1 Общее количество орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс, локализованных на срезе мозга определенного уровня, при ограничении подвижности и сочетанном применении ограничения подвижности и охлаждения.
 Рисунок 2 Количество орексин-позитивных нейронов в перифорникальной зоне латерального гипоталамуса крыс через 1 час после окончания ограничения подвижности и охлаждения. По оси ординат – (Y) – абсолютное количество орексин-позитивных нейронов на срезе; по оси абсцисс (X) –уровни срезов мозга крыс по атласу Swanson L.W. Группы животных: ■- интактные; подвергнутые: ■- ограничению подвижности, ■- ограничению подвижности и охлаждению *p < 0.05 по сравнению с количеством орексин-позитивных клеток у интактных животных; ##p < 0.005 по сравнению с количеством орексин-позитивных клеток у животных через час после ограничения подвижности. Распределение орексин-содержащих нейронов в различных структурах гипоталамуса крыс при ограничении подвижности и сочетанном применении ограничения подвижности и охлаждения. Как уже было отмечено выше, орексин-содержащие нейроны в основном расположены в LHA, DMH, PH. Для оценки особенностей распределения орексин-содержащих нейронов в гипоталамусе был произведен подсчет орексин-позитивных нейронов, локализованных в разных структурах (Рис 3). Дифференцированное определение количества орексин-позитивных клеток в исследуемых структурах гипоталамуса позволило установить, что после ограничения подвижности животных иммунореактивность орексин-содержащих нейронов, локализованных в LHA на срезах мозга 28-го уровня (Рис 3) снизилась на 17 % по сравнению с их количеством у интактных животных. После применения комбинированного воздействия количество орексин-содержащих нейронов, локализованных в LHA на срезах мозга 28-го уровня, повысилось на 29 % по сравнению с их количеством у животных после ограничения подвижности (Рис 3).    Рисунок 3. Количество орексин-позитивных нейронов, локализованных в латеральном гипоталамическом поле (LHA), дорзомедиальном ядре гипоталамуса (DMH), заднем гипоталамическом поле (PH) крыс через 1 час после ограничения подвижности и охлаждения. По оси ординат – (Y) - количество орексин-позитивных нейронов в конкретных структурах, расположенных срезе мозга определенного уровня; по оси абсцисс (X) –уровни срезов мозга крыс по атласу Swanson L.W. ^ ■- интактные; подвергнутые: ■- ограничению подвижности, ■- ограничению подвижности и охлаждению *p < 0.05 по сравнению с количеством орексин-позитивных клеток у интактных животных; #p < 0.05, ##p < 0.005 по сравнению с количеством орексин-позитивных клеток у животных через час после ограничения подвижности. В области DMH на срезах мозга 29-го уровня количество орексин-позитивных нейронов после ограничения подвижности животных повысилось на 39% по сравнению с их количеством у интактных животных (Рис. 3). В DMH на срезах 31 уровня количество орексин-позитивных нейронов в этих условиях повышается на 138% по сравнению с их количеством орексин-позитивных нейронов у животных контрольной группы. После применения комбинированного воздействия количество визуализированных орексин-содержащих нейронов, локализованных в DMH на срезах мозга 28-го уровня, увеличилось на 65% (Рис. 3). Распределение орексин-позитивных нейронов, локализованных в различных зонах исследуемых структур гипоталамуса, при ограничении подвижности и комбинированном воздействии – ограничении подвижности и охлаждении.Анализ количества орексин-позитивных клеток в различных зонах определенных структур гипоталамуса (LHA, DMH, PH, PVH) позволил установить, что их количество изменяется по-разному в различных зонах одних и тех же структур после стрессорных воздействий. Анализ количества орексин-содержащих клеток, локализованных в определенных зонах структур гипоталамуса, расположенных срезов мозга 28-го уровня крыс, позволил выявить снижение иммунореактивности нейронов только в LHAd на 31% через 1 час после окончания ограничения подвижности (Рис. 4). Применение комбинированного воздействия привело к повышению степени иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, локализованных на срезах мозга 28-го уровня, которое наблюдается в зонах LHAd (59%), DMH (65%), LHAjd (41%) (Рис. 4). В тех же структурах мозга, локализованных на срезах мозга крыс 29-го уровня, количество орексин-позитивных нейронов гипоталамуса после ограничения подвижности животных оставалось без изменений. Однако, при анализе изменений иммунореактивности орексин-содержащих нейронов в различных зонах тех же структур после данного воздействия, выявлены различия. В LHA на срезах мозга 28-го уровня количество иммунореактивных орексин-содержащих нейронов увеличивалось на 76% в области LHAs, тогда как в области LHAm происходило снижение числа орексин-позитивных клеток на 63% (Рис. 4).    ^ По оси ординат – (Y) - количество орексин-позитивных нейронов в структурах, расположенных на срезе; по оси абсцисс (X) –зоны и структуры гипоталамуса, согласно по атласу Swanson L.W. ^ ■- интактные, подвергнутые: ■- ограничению подвижности, ■- ограничению подвижности и охлаждению *p < 0.05 по сравнению с количеством орексин-позитивных клеток у интактных животных; #p < 0.05, ##p < 0.005 по сравнению с количеством орексин-позитивных клеток у животных через час после ограничения подвижности. В структурах гипоталамуса крыс, локализованных на срезах мозга 29-го уровня, после применения комбинированного воздействия изменения отмечаются в области LHAm, в которой количество иммунореактивных орексин-содержащих нейронов увеличивается на 135% (Рис 4). Количество орексин-позитивных клеток, представленных в структурах гипоталамуса на срезах мозга 31-го уровня, после ограничения подвижности повысилось на 19 %, главным образом, за счет увеличения степени иммунореактивности орексин-содержащих нейронов в дорзальной части PH на 41% (Рис 4). В дорзальной части PH степень иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, расположенных на срезах мозга 31-го уровня крыс, понизилась на 39 %. Однако, в области DMH количество орексин-позитивных нейронов повысилось на 138%. Таким образом, можно заключить, что изменение иммунореактивности орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс, как при ограничении подвижности, так и при сочетанном применении ограничения подвижности и охлаждения, происходит преимущественно в структурах дорзальной части перифорникальной области гипоталамуса (Рис 5). Иммунореактивность орексин-содержащих нейронов гипоталамуса, локализованных в структурах под сводом головного мозга, не изменяется. Детальный анализ гипоталамуса крыс на срезах мозга, соответствующих 29 уровню, после примененных стрессорных воздействий позволил установить наличие изменений иммунореактивности орексин-содержащих нейронов только в отдельных структурах и зонах гипоталамуса без изменений общего количества орексин-позитивных нейронов, локализованных на срезах данного уровня. В структурах гипоталамуса, локализованных на срезах мозга 29-го уровня, происходит увеличение количества орексин-позитивных нейронов на 76% в LHAs, а в LHAm – напротив, снижение на 63%. Таким образом, применение картирования орексин-содержащих нейронов по структурам и зонам гипоталамуса после примененных воздействий впервые позволило установить наличие функциональной дискретности популяции этих нейронов, не выявляемое при простом подсчете среднего количества орексин-позитивных нейронов, локализованных на одном срезе конкретного уровня и даже в одной структуре. Сопоставление данных, полученных в результате изучения экспрессии гена препроорексина, с данными иммуногистохимического анализа иммунореактивности орексин-содержащих нейронов гипоталамуса позволяет заключить, что наблюдаемое после ограничения подвижности увеличение уровня м-РНК препроорексина в структурах гипоталамуса ассоциируется с увеличением количества орексин-позитивных нейронов, локализованных в структурах PH, DMHa, и верхней части LHA. Однако, несмотря на повышенный синтез м-РНК препроорексина в гипоталамусе крыс при ограничении подвижности, иммунореактивность орексин-содержащих нейронов, локализованных в LHAs и LHAd, значительно снижается.  1 2 3 4 5 6 7 8 Рисунок 5 Изменение иммунореактивности орексин-позитивных нейронов в структурах и зонах гипоталамуса крыс, на срезах, соответствующих 28-31 уровням. 1-4 –после ограничения подвижности; 5-8 – после ограничения подвижности и охлаждения. Черным цветом обозначены структуры и зоны гипоталамуса крыс (по атласу Swanson L.W.), в которых наблюдается увеличение иммунореактивности орексин-позитивных нейронов, темно-серым – ее уменьшение. Иммунореактивность орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс повышается в LHAd, LHAjd, DMHa, LHAm при комбинированном применении ограничения подвижности и охлаждения. В LHAd, на срезах, соответствующих 28 уровню, а также в LHAm и PH на срезах соответствующих 29 и 31 уровню соответственно, при сочетанном применении ограничения подвижности и охлаждения наблюдается восстановление количества орексин-позитивных нейронов до его уровня, характерного для интактных животных. В DMHa, LHAjd, на срезах, соответствующих 28 уровню, в LHAs и DMHa, на срезах, соответствующих 29 уровню, а также в DMHa, на срезах, соответствующих 31 уровню, количество орексин-позитивных нейронов при ограничении подвижности и охлаждении крыс повышено. Синтез м-РНК препроорексина при комбинированном воздействии снижается по сравнению с его уровнем у животных после ограничения подвижности, и соответствует показателям, характерным для интенсивности синтеза м-РНК препроорексина у интактных животных. Таким образом, при комбинированном воздействии (ограничение подвижности и охлаждение) наблюдается нивелирование, наблюдаемых после ограничения подвижности изменений, уровня экспрессии гена препроорексина в структурах гипоталамуса. Анализ полученных данных позволяет полагать, что выявленные через 1 час после примененных стрессорных воздействий изменения, обусловлены как изменением интенсивности синтеза м-РНК препроорексина в клетках гипоталамуса крыс, так и по-видимому изменением скорости процесса утилизации орексина А в орексин-содержащих нейронах. Изменение соотношения интенсивности синтеза и утилизации орексина А в орексин-содержащих нейронах гипоталамуса проявляется снижением или повышением степени их иммунореактивности через 1 час после примененных экспериментальных воздействий. Установлено, что при данных видах воздействий происходит избирательное изменение степени иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, что свидетельствует о функциональной неоднородности популяции орексин-содержащих нейронов, расположенных в туберальной области гипоталамуса. Дискретность изменений, происходящих в орексин-содержащих нейронах, как при ограничении подвижности, так и при комбинированном воздействии, может свидетельствовать о существовании функционально разнородных популяций орексин-содержащих клеток, дающих, по-видимому, проекции в разные области мозга. Иммунореактивность орексин-содержащих нейронов, расположенных в DMH, PH, и некоторых зонах LHA существенно изменяется при ограничении подвижности и охлаждении. Известно, что дорзомедиальное ядро (DMH), латеральная гипоталамическая область (LHA), и заднее (PH) поле гипоталамуса причастны к процессу теплопродукции (Imai-Matsumura K, et al 1984 Amir, 1990, Zaretskaia, 2002, Cao, 2004, Tanaka et al 2001). Изменение иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, расположенных в областях, вовлеченных в систему регуляции теплопродукции, дают основание предположить возможность участия орексин-содержащих нейронов в процессах терморегуляции. Изменения уровня экспрессии гена препроорексина и содержания орексина в клетках разных структур гипоталамуса позволяет заключить, что орексин-содержащие нейроны гипоталамуса избирательно вовлекаются в развитие комплекса реакций, протекающих в мозге в процессе формирования ответа на ограничение подвижности и сочетанное применение ограничения подвижности и охлаждения. Таким образом, применение подробного картирования орексин-позитивных нейронов, локализованных в различных зонах структур гипоталамуса, впервые позволило установить функциональные различия популяции орексин-содержащих нейронов, не выявляемые при простой количественной оценке орексин-позитивных нейронов, расположенных на срезах мозга конкретного уровня. Комплекс полученных результатов свидетельствует об участии орексинэргических нейронов гипоталамуса в механизмах реализации реакций мозга на ограничение подвижности и сочетанное применение ограничения подвижности и охлаждения. Выявлены конкретные структуры, активирующиеся при этих воздействиях, определен характер и степень участия орексин-содержащих нейронов в механизмах реализации реакций мозга при такого рода стрессорных воздействиях. Показаны различия паттернов их активации при ограничении подвижности и комбинированном применении ограничения подвижности и охлаждения, что важно для понимания механизмов реализации реакций мозга в этих условиях. ВЫВОДЫ.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
Сдано в набор 20.05.2009. Подписано в печать 20.05.2009. усл. печат. листов 1.0 Уст. тираж 100 экз. Заказ 15-5/АР002. Издано в Центре стратегического анализа общественных процессов 193036, СПб, Лиговский пр. дом 29. |
|||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям