Отчет о научно-исследовательской работе
|
|
Скачать 1.97 Mb.
|
|
^
Скорость прямой реакции максимальна при рН 9,0; обратной – при рН 6-8. В организме равновесие сдвинуто в сторону обратной реакции. Активность фермента повышается под влиянием ионов магния, марганца, кальция, глутатиона и цистеина, а ионы цинка, меди и ртути, напротив, оказывают ингибирующее воздействие [16]. Креатинкиназа (типа КК-ВВ) из мозга цыпленка (Gallus gallus) состоит из двух В-субъединиц (рис. 6): код 1qh4 (PDB-EBI). Полипептидная цепь В-субъединицы креатинкиназы (типа КК-ВВ) из мозга цыпленка состоти из 380 аминокислотных остатков. Хотя эта последовательность отличается, но порядок аминокислотных остатков в калитическом центре этой В-субъединицы Arg132 - Arg320 - Glu232 - Arg292 - Arg236 полностью совпадает с таковой для М-субъединицы креатинкиназы (типа ММ) из мышц человека код 1i0e (PDB-EBI). Безусловно «супрамолекулярным» является строение ассиметрического комплекса и биологически активного октамера (рис. 7) митохондриальной креатинкиназы (КК-мит.) из сердечной мышцы цыпленка (Gallus gallus): код 1crk (PDB-EBI). Полипептидная цепь субъединицы КК-мит. из сердечной мышцы цыпленка состоит из 380 аминокислотных остатков, как и для приведенной выше В-субъединицы типа КК-ВВ из мозга цыпленка. Однако порядок аминокислотных остатков в калитическом центре этой митохондриальной субъединицы Arg231(A) - Arg287(A) - Arg127(A) - Arg315(A) - Glu227(A) существенно отличается от приведенной выше В-субъединицы креатинкиназы (типа КК-ВВ) из мозга цыпленка. Необычным является строение ассиметрического комплекса и биологически активного димера креатинкиназы из сердечной мышцы кролика (Oryctolagus cuniculus) (рис. 8). Полипептидная цепь субъединицы креатинкиназы из сердечной мышцы кролика состоит из 365 аминокислотных остатков. Как эта последовательность, так и порядок аминокислотных остатков в калитическом центре этой субъединицы Arg132 - Arg320 - Glu232 - Arg292 - Arg236 полностью совпадает с таковой для М-субъединицы креатинкиназы (типа ММ) из мышц человека.
Одним из объяснений этого феномена может служить наличие внутри каждой группы изоферментов нескольких изоформ, отличающихся по своим физико-химическим свойствам. Эти факты усложняют и делают поистине «супрамолекулярной» ставшую уже классической теорию о том, что «комбинация двух субъединиц в димерную структуру приводит к образованию трех изоферментов, называемых по входящим в их состав субъединицам КК-ММ, КК-ВВ и КК-МВ изоэнзимами, и локализованных в скелетных мышцах, клетках мозга и сердечной мышце, соответственно» [16]. Кроме того, в тканях миокарда содержится и ММ-изофермент КК. В сыворотке крови здорового человека имеет место следующее соотношение изоферментов КК: активность КК-ММ составляет 94-96 %, КК-МВ - 4-6 %, изофермент КК-ВВ присутствует в следовых количествах. Согласно современным представлениям, в энергетическом обеспечении функции миофибрилл и саркоплазматического ретикулума сердечной мышцы ведущее место занимает креатинкиназный механизм, который в значительной мере определяет скорость и характер внутриклеточного перераспределения энергии и утилизацию ее субклеточными структурами. Поэтому активность креатинкиназы в сыворотке крови повышается при остром инфаркте миокарда. При этом активность креатинкиназы увеличивается раньше, чем изменяется активность других ферментов. Однако значительное повышение активности креатинкиназы в сыворотке крови может наблюдаться также при повреждении скелетной мускулатуры и при самых различных нарушениях центральной нервной системы. Считается, что повышение общей активности КК при ряде заболеваний центральной нервной системы связано с увеличением проницаемости клеточных мембран скелетных мышц и сердца, а также понижением скорости инактивации и выделения фермента из кровотока. На основании всех известных данных можно сделать вывод, что наибольшее распространение в клинической лабораторной практике приобрело определение общей КК и ее МВ-составляющей, причем определение активности МВ-изофермента КК имеет особо важное значение при диагностике инфаркта миокарда и мониторинге постинфарктного состояния. Аспартатаминотрансфераза и аланинаминотрансфераза Считается оптимальным рассматривать совместно ферменты КФ 2.6.1.1. или аспартатаминотрансферазу (АСТ) и КФ 2.6.1.2. или аланинамино-трансферазу (АЛТ), которые имеют много общего в строении и свойствах, а также учитывая недостаток детальных структурных данных по АЛТ в отличие от АСТ. Как АЛТ, так и АСТ состоят из двух полипептидных субъединиц одинакового типа с ММ порядка 45000, т.е. ММ каждого фермента составляет порядка 90000 [16]. Субъединицы имеют «богатую» вторичную структуру с двумя выраженными доменами, один из которых необходим для связывания кофермента (пиридоксальфосфата). По последним данным, полученным методом рентгеновской дифракции кристаллов митохондриального фермента с разрешением 0,28 нм, считается, что оба активных центра димера находятся на границе между субъединицами и состоят из аминокислотных остатков обеих субъединиц. Для АСТ показано, что остаток Arg292 в обычном ферменте в основном «отвечает» за специфичность к субстрату. Мутантный по данному остатку фермент (замена на Asp-292 приводит к инверсии зарядового баланса) становится активным в реакции трансаминирования аргинина, а не аспартата [16]. АСТ из митохондрий сердечной мышцы цыпленка (gallus gallus): код 1map (PDB-EBI) состоит из двух одинаковых субъединиц (рис. 9). Поли-пептидная цепь субъединицы АСТ из митохондрий сердечной мышцы цыпленка состоит из 401 аминокислотного остатка. Считается, что кофермент ПФ всегда связывается с Lys258 (рис. 10) и порядок амино-кислотных остатков в каталитическом центре этой субъединицы Trp140 - Asp222 - Lys258 достаточно консервативен для всех АСТ. Всего в активном центре субъединицы АСТ насчитывается 19 аминокислотных остатков. Надо обязательно учитывать, что в этом активном центре находятся также еще 4 аминокислотных остатка из другой субъединицы АСТ. Интересно, что АСТ из цитоплазмы клеток сердечной мышцы цыпленка (gallus gallus): код 2cst (рис. 11) состоит из двух одинаковых субъединиц, но состоящих из 411 аминокислотных остатков каждая. Всего в активном центре субъединицы (обозначенной А) этой АСТ насчитывается 19 аминокислотных остатков (с рядом отличий) и еще 4 аминокислотных остатка из другой субъединицы (В) этой же АСТ. Важно, что порядок и положение аминокислотных остатков в каталитическом центре субъединицы этой АСТ неизменен Trp140(A) - Asp222(A) - Lys258(A), несмотря на увеличение (на 10 единиц) общего числа аминокислотных остатков для АСТ из цитоплазмы клеток сердечной мышцы цыпленка, по сравнению с АСТ из митохондрий этой же мышцы. АСТ катализирует обратимый перенос аминогруппы с аспарагиновой кислоты на α-кетоглутаровую кислоту с образованием оксалоацетата:
Наибольшее содержание АСТ обнаружено в сердечной мышце, в печени, скелетной мускулатуре, головном мозге, почках, семенниках. Так, активность АСТ в сердечной мышце почти в 10000 раз выше, чем в сыворотке крови. Поскольку даже в эритроцитах активность АСТ в 10 раз выше, чем в сыворотке, то исследуемая сыворотка крови не должна иметь следов гемолиза. Увеличение активности АСТ в сыворотке крови происходит при инфаркте миокарда (в 4-5 раз) и сохраняется 3-5 дней. Умеренное увеличение активности АСТ обнаруживается также у больных с метастазами в печень, циррозом печени, при прогрессивной мышечной дистрофии, а также при некрозе или повреждении печеночных клеток любой этиологии, включая холестатическую и обтурационную желтуху, острый и хронический гепатит, причем в большинстве этих случаев уровень активности АЛТ выше уровня активности АСТ [16].
Наиболее высокая активность АЛТ обнаруживается в печени, поджелудочной железе, сердце, и скелетной мускулатуре. Повышение активности АЛТ является наиболее специфичным признаком заболеваний печени, особенно острых, что имеет большое диагностическое значение. Как правило, оно возникает за 1-4 недели до развития клинических симптомов и за 7-10 дней до обнаружения максимального уровня билирубина в крови, более чем в 5-10 раз превышая норму. Длительное увеличение активности АЛТ или повышение активности в поздние сроки заболевания может означать начало массивного печеночного некроза. Повышение активности АЛТ в сыворотке крови отмечается при гепатитах различной этиологии, механической желтухе, циррозе печени, введении гепатотоксических препаратов, инфаркте миокарда. В норме соотношение активностей АСТ/АЛТ (коэффициент де Ритиса) для человека равно 1,33±0,42. У больных инфекционным гепатитом происходит снижение коэффициента, а при остром инфаркте миокарда резко возрастает [16]. Гамма-глутамилтрансфераза Фермент КФ. 2.3.2.2. или γ-глутамилтрансфераза (ГГТ) – мембрано-связанный белок сложного строения: димер ГГТ состоит из субъединиц А и В, содержащих разное число аминокислот (рис. 12). Таких димеров может быть несколько в «мембранно-трасферазном комплексе», который с полным основание можно считать «ферментной» СБС (рис. 12). К сожалению, детали структур ГГТ животных в доступной литературе отсутствуют, поэтому здесь приведены данные для бактерий. Димер ГГТ, выделенный из бактерий (Escherichia coli. Strain: k-12.), состоит из субъединиц, содержащих 359 (А) и 109 (В) аминокислотных остатков. Несмотря на то, что В-субъединица этой ГГТ почти в 3,5 раза короче А-субъединицы, но в ней взаимодействует с лигандом или субстратом в 3 раза больше амино-кислотных остатков (15), чем в А-субъединице (6), что следует из строения активного центра ГГТ (рис. 13). ГГТ является ключевым из 6 ферментов γ-глутамильного цикла, служащего для переноса ряда аминокислот через плазматические мембраны. Данный фермент присутствует в высоких концентрациях в печени, почках и поджелудочной железе. Его активность в плазме является чувствительным индикатором заболеваний гепатобилиарной системы, хотя он и не дает возможности разграничить холестатический и гепатоцеллюлярный типы патологии. При обструкции желчных путей увеличение активности ГГТ в плазме может предшествовать подъему активности щелочной фосфатазы. Активность ГГТ в плазме возрастает при отсутствии заболеваний печени у пациентов, принимающих антиконвульсанты (аналогичное действие может оказывать рифампицин при лечении туберкулеза). В указанных выше случаях повышение активности ГГТ в плазме происходит не вследствие повреждения клеток, а в результате усиления внутриклеточного синтеза фермента и освобождения его повышенного количества в циркуляцию в процессе нормального метаболизма клеток. Повышение активности ГГТ плазмы связано также с холестазом (превышение верхнего предела нормы более чем в 10 раз); гепатитом (острый и хронический); циррозом (без холестаза); панкреатитом (превышение верхнего предела нормы в 5-10 раз); многими состояниями, отражающими «вторичные воздействия» на печень: с лекарствами, вызывающими индукцию фермента; с сердечной недостаточ-ностью (превышение верхнего предела нормы менее чем в 5 раз) [16].
Все эти ферменты и их изоформы в крови животных составляют характерный набор – «ферментный профиль», который изменяется при патологических изменениях тканей, что активно используют в клинической биохимической диагностике. ^ Различные типы липаз традиционно относятся к липолитическим ферментам (это прежде всего гидролазы эфиров карбоновых кислот) и играют важную роль в обмене липидов у животных [20–25]. Наиболее важной для данной работы являлась панкреатическая липаза или триацилглицероллипаза (КФ 3.1.1.3) как гидролаза сложных эфиров глицерина и жирных кислот или, по-другому, ацилгидролаза различных триацилглицеридов. Панкреатическая липаза преимущественно вырабатывается поджелудочной железой животных и принимает участие в расщеплении нейтральных жиров, поступающих в кишечник с пищей. Панкреатическая липаза – один из активно исследуемых липолитических ферментов, поэтому ее часто используют в качестве модели для других липаз (как животного, так и растительного или микробного происхождения). Использование идеологии супрамолекулярных систем особенно полезно при структурно-функциональном исследовании комплексов молекул субстрата и димеров или октамеров панкреатической липазы в комплексе с колипазой (рис. 14), выделенных из поджелудочной железы свиньи (Sus scrofa): код 1eth (PDB-EBI). На рис. 15 и 16 приведены полипептидные последовательности для субъединиц липазы и колипазы свиньи (Sus scrofa), состоящих из 448 и 87 аминокислотных остатков, соответственно. Для правильного структурного представления этой достаточно сложной супрамолекулярной системы необходимо добавить 1071 молекулу воды, хотя бы по одному катиону Са2+ и одной молекуле субстрата (рис. 17) на каждый комплекс липазы с колипазой в димере или октамере (рис. 14 и 18). Строение каталитического центра липазы: Ser153, Asp80 и Gly77, отличается от «субстрат-связывающего» центра. Предполагается, что комплекс липазы с колипазой образуется 16 и 12 аминокислотными остатками соответствующих белков с использованием 8 водородных связей и от 96 до 100 «других контактов», хотя «критическими» для такой супрамолекулярной организации организация этих комплексов являются только 4 аминокислотных остатка с каждой стороны и 15 «других типов» контактов. Гидролиз триглицеридов в желудочно-кишечном тракте животных осуществляется панкреатическими липазами, которые продуцируются у млекопитающих в ацинарных клетках поджелудочной железы и накапливаются в зимогенных гранулах, содержащих набор пищеварительных ферментов или их проферментов. Из этих гранул липаза высвобождается в специальный проток, по которому панкреатический сок поступает к месту своего назначения — в тонкий кишечник. Данных, свидетельствующих о наличии профермента (зимогена) липазы, не имеется и нет никаких причин думать, что таковой существует. В отличие от протеиназ или фосфолипаз, панкреатическая липаза обладает особой специфичностью, которая заключается в том, что липаза действует на свой субстрат — триглицерид только в том случае, если он находится в эмульгированном состоянии. Такое эмульгирование липидов эффективно осуществляется желчью при участии солей желчных кислот (в печени синтезируются холевая, дезоксихолевая, гликохолевая и таурохолевая кислоты), что увеличивает скорость расщепления триглицеридов панкреатической липазой. Адсорбируясь и уменьшая поверхностное натяжение жировых капелек, желчные кислоты раздробляют их и превращают жиры и масла в тонкую эмульсию, диаметр частиц которой не превышает 0,5 мкм. Эмульгирование жира приводит к увеличению поверхности соприкосновения триглицерида с водным раствором липазы, т. е. облегчает ферментативный гидролиз [16, 24].
Панкреатическая липаза свиньи является гликопротеидом, имеющим молекулярную массу порядка 50 000 и оптимум рН 8-9 [24]. Данный фермент расщепляет триглицериды, находящиеся в эмульгированном состоянии, но может гидролизовать также ди- и моноглицериды [24].
Широко известны и активно используются бактериальные липазы из различных источников, например, ^ Pseudomonas cepacia, Pseudomonas fluorescens [23–26]. В ходе исследования бактериальных липаз было обнаружено, что у них имеется два связывающих места: широкий карман для спирта и узкий – для карбоновых кислот. Так как липаза катализирует гидролиз триглицеридов, то два углеводородных остатка направляются в широкий карман, а другая ацильная группа – в узкий и длинный карман. Липаза из Pseudomonas может узнавать энантиомер вторичных спиртов благодаря специфической структуре широкого кармана и показывать при этом высокую энантиоселективность для вторичных спиртов, а липаза из Candida показывает низкую энантиоспецифичность для спиртов из-за плоской структуры широкого связывающего кармана. После того как липаза подвергалась импринтингу субстратами, происходило изменение структуры этого связывающего кармана, вследствие чего изменялась энантиоселективность [26]. Плесневый гриб Мucor javanicus продуцирует ферменты с протеиназной и липазной активностью. Запатентованы по крайней мере два ферментных препарата из этого плесневого гриба, предназначенных для использования в производстве сыров [24]. В этих неочищенных препаратах протеиназ обнаружена липолитическая активность, поэтому в сырах, созревающих при участии неочищенных протеиназ, накапливаются свободные жирные кислоты, которые придают сыру специфический вкус и которые при избыточном содержании могут вызвать нежелательные изменения вкуса у сыра. Микроорганизм выращивают на среде, содержащей 4 % пшеничных отрубей, при рН 6,7 и 35ºС. Из химических свойств фермента приводятся только данные об ингибировании липолитической активности диизопропил-фторфосфатом. Цистеин, ЭДТА не влияли на активность. На этом основании фермент можно отнести к группе сериновых ферментов, однако он отличается от большинства других липаз рН оптимумом (около 5,5). В качестве субстратов этой липазы были испытаны несколько природных триглицеридов и моноглицеридов. Хотя липаза гидролизовала все эти соединения, максимальная активность наблюдалась только в отношении тридеканоина и триоктаноина. Метиловые эфиры жирных кислот с короткой цепью (4:0, 6:0 и 8:0) гидролизовались плохо, в то время как эфиры кислот с длинной цепью – хорошо. О строении этой липазы и кинетике гидролиза ею субстратов доступная информация отсутствует. ^ Согласно основному постулату энзимологии, фермент и субстрат образуют комплекс, в котором протекает реакция и который затем распадается на исходный фермент и продукты реакции. Кинетические уравнения, выведенные на основании этого постулата, в целом, применимы также к реакциям липолитических ферментов с их субстратами. Так, было показано, что гидролиз триглицеридов липазой поджелудочной железы подчиняется основному уравнению Михаэлиса-Ментен [15, 16, 24]. Однако, это уравнение в случае липолитических реакций носит довольно формальный характер, поскольку ферментативный гидролиз липидов – это гетерогенная реакция, происходящая на границе раздела фаз, поскольку фермент растворим в воде, а субстрат - нет. Следовательно, фермент-субстратное взаимодействие должно также протекать на поверхности раздела между агрегированным субстратом и водой [15, 24]. К липолитическим ферментам относятся и внутриклеточные фосфолипазы, которые связаны с мембранами и не отличаются в этом отношении от других мембранных ферментных комплексов [27]. Однако типичные липолитические ферменты - липазы и фосфолипазы пищеварительных желез, ядов, жировой ткани и крови - функционируют в специфических условиях: субстрат практически «неподвижен» по отношению к ферменту. Такое поведение субстрата обусловлено его агрегацией в мицеллы. Во время липолиза, очевидно, фермент должен находить субстрат, а не наоборот; в этом случае под «субстратом» подразумевается не отдельная его молекула, а неводная фаза агрегированного липида (мицеллы) [24]. Тем не менее, липолиз в среде и биомембраннах имеют то общее, что их кинетика ограничивается двумя измерениями вместо трех и один из участников реакции (фермент или субстрат) частично иммобилизован на границе раздела фаз (в «отдельной матрице»). Термин «суперсубстрат» был предложен для обозначения матрицы, в которую встроена молекула субстрата [24]. В липолитических реакциях такой матрицей может служить поверхность триглицеридной капли или фосфолипидной мицеллы, и тогда она представляет собой агрегат многих молекул субстрата. Матрица может быть поверхностью, модифицированной включением несубстратных участников реакций, таких, как амфифильные катионы или анионы. Необходимо, чтобы ферменты не только перемещались к «суперсубстрату» и связывались с ним, но чтобы при этом соблюдалась бы и правильная ориентация активных центров вблизи молекул субстрата, находящихся в «суперсубстратной» фазе. Таким образом, кинетика липолиза соответствует общим критериям кинетики ферментативной реакции, но имеет также существенные отличия. Скорость всех химических реакций зависит от температуры, поэтому катализируемые ферментами реакции также чувствительны к изменениям температуры. Установлено, что скорость большинства биохимических реакций повышается в 2 раза при повышении температуры на 10 °С и, наоборот, снижается в 2 раза при понижении температуры на 10 °С [29]. Этот показатель получил название температурного коэффициента. Однако вследствие белковой природы фермента тепловая денатурация при повышении температуры будет снижать эффективную концентрацию фермента с соответствующим снижением скорости реакции. Так, при температуре, не превышающей 45-50 °С, скорость ферментативной реакции увеличивается согласно теории химической кинетики. При температуре выше 50 °С на скорость реакции большое влияние начинает оказывать тепловая денатурация белка-фермента, приводящая к постепенному прекращению ферментативного процесса [16, 24]. Оптимальной для действия большинства ферментов теплокровных животных является температура порядка 36 - 40 °С; в этих условиях скорость реакции оказывается максимальной вследствие увеличения кинетической энергии реагирующих молекул. При высоких температурах белковая глобула претерпевает денатурацию и теряет свою активность. При низких температурах (0 °С и ниже) ферменты, как правило, не разрушаются, хотя активность их падает почти до нуля. Во всех случаях имеет значение время воздействия соответствующей температуры. Следует отметить, что на термолабильность ферментов определенное влияние оказывает концентрация субстрата, рН среды и некоторые другие факторы [16, 24]. Ферменты активны только в определенном интервале рН. Многие аминокислоты, звенья белковых молекул, обладают функциональными группами, способными к ионизации. Возможность участия данной группы в катализе зависит от ее ионного состояния. Оптимальный для катализа баланс протонированных и непротонированных групп определяет величину рН-оптимума данного фермента, который обычно лежит в физиологическом интервале значений рН среды. Вид зависимости активности фермента от величины рН реакционной среды будет иметь вид колоколообразной зависимости, а значение рН, при котором достигается максимальная активность фермента, называется рН-оптимумом ферментативной реакции. Если ионизационные процессы не меняют константу связывания субстрата с ферментом, то величина константы Михаэлиса от рН зависеть не будет. Если же ионизация групп в активном центре фермента переводит его в форму, не способную связывать субстрат, то независимой от величины рН становится константа каталитическая. На практике, конечно, картина обычно бывает гораздо более сложной, поскольку в состав активного центра могут входить много ионизующихся групп. Большое значение имеет состояние ионизации субстратов и кофакторов, величина ионной силы среды. На скорость гидролиза липазой любого выбранного субстрата может оказывать влияние целый ряд различных соединений. В системе, используемой для определения липазы, часто содержатся хлористый натрий и кальций, соли желчных кислот, другие белки и различные виды эмульгаторов [29]. Таким образом, для каждого типа ферментов (из рассмотренных выше и многих других) использование идеологии супрамолекулярных ферментативных систем позволяет как глубже понять их сложную структурную организацию, так и наиболее адекватно отразить реальные ситуации их функционирования в организмах животных и человека. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям