Отчет о научно-исследовательской работе
|
|
Скачать 1.97 Mb.
|
|
^ Иммобилизованные ферменты представляют собой важную и быстро развивающуюся область энзимологии и биотехнологии [24, 28, 29]. В 1971 г. на первой конференции по инженерной энзимологии в Хенникере (США) было введено в биохимическую терминологию понятие «иммобилизованные ферменты». Процесс иммобилизации ферментов можно рассматривать как методический прием, при котором молекулу белка включают в любую фазу, отделенную от фазы самого раствора, но способную обмениваться с ней молекулами субстрата или модификатора (ингибитора, активатора и т.д.). Иммобилизованные ферменты имеют существенные преимущества по сравнению с нативными ферментными препаратами. Так, например, они легко отделимы от реакционной среды. Это дает возможность остановить реакцию в любой момент, получить продукт, незагрязненный катализатором, и использовать ферментный препарат многократно. Иммобилизованные ферменты технологичны, что определяется возможностью вести биотехнологический процесс непрерывно и регулировать скорость катализируемой реакции и выход продукта путем изменения скорости протока. Подбором соответствующих носителей и методов иммобилизации можно целенаправленно модифицировать такие свойства ферментов, как специфичность, рН- и термозависимость, а также стабильность фермента при денатурирующих воздействиях. Успешное использование иммобилизованных ферментов определяется выбором подходящего сочетания носителя и метода иммобилизации, а также знанием кинетики реакций с участием таких катализаторов [29]. Иммобилизованные ферменты можно использовать, главным образом, в следующих направлениях: для анализа различных веществ; для бумажной, текстильной, химической и фармацевтической промышленности; для обработки сточных вод; как лекарственные средства [30-37]. Последнее является наиболее ценным для медицины и ветеринарии. Лечебные средства на основе иммобилизованных ферментов применяются либо в том случае, когда необходимый фермент отсутствует в тканях, вследствие генетических или других нарушений, либо в качестве агентов, разрушающих нежелательные компоненты, например, мочевину. Использование чужеродных (бактериальных) ферментов зачастую нежелательно, вследствие того, что они могут стать причиной аллергических реакций и, кроме того, они крайне неустойчивы. Иммобилизация позволяет обойти эти барьеры, так как она повышает стабильность фермента и препятствует его взаимодействию с иммунной системой организма (например, для освобождения крови от мочевины в аппарате "искусственная почка" использоваться колонка с иммобилизованной уреазой). Такие ферменты применяют в лечебных целях и тогда, когда они необходимы, но по причине различных патологических процессов их недостаточно в организме. ^ В качестве носителей для иммобилизованных ферментов могут использоваться различные вещества - природные и синтетические, органические и неорганические, высоко- и низкомолекулярные, но все они должны отвечать следующим требованиям: высокая химическая и биологическая стойкость; высокая механическая прочность, например, к истиранию; возможность получения различных форм - гранул, пластин, мембран, трубочек и т.д.; высокая гидрофильность, обеспечивающая возможность связывания фермента с носителем в водной фазе; легкость активации фермента, связанного с носителем; способность носителя к максимальной "нагрузке" ферментом, так как высокая концентрация фермента на носителе позволяет уменьшить размеры реактора; низкая стоимость. Органические высокомолекулярные носители делят, как правило, по происхождению на природные и синтетические полимеры. Природные полимеры, используемые для иммобилизации подразделяются на белковые, полисахаридные и липидные. Наиболее широко в качестве носителей используются полисахариды, такие как целлюлоза, декстран, агароза и их производные. Их преимуществом являются доступность, наличие различных функциональных групп, высокая степень гидрофильности, недостатком - чувствительность к действию микроорганизмов и высокая стоимость. Синтетические полимерные носители для иммобилизации ферментов создаются на основе многих полимеров (производные стирола, акриловая кислота, поливиниловый спирт, полиуретан и т.д.). Известно, что in vivo большинство ферментативных реакций протекает на поверхности внутриклеточных или клеточных мембран, поэтому модель фермент-липид наиболее приближена к условиям функционирования энзима в клетке. Липидные носители используются в виде монослоев на различных поверхностях или в виде бислоев сферической формы (липосомы или везикулы). Простота получения, легкость регенерации иммобилизованного катализатора, возможность использования его in vivo способствовали широкому применению липосом или везикул в качестве носителей ферментов и лекарственных препаратов. В настоящее время в качестве носителей внедряются синтетические аналоги липидов - поверхностно-активные вещества (ПАВ). Они имеют амфифильную природу и содержат неполярную углеводородную часть и полярную «головку», от содержания в которой различных функциональных групп различают 4 типа ПАВ: анионные, катионные, неионные и цвиттерионные. Многие из известных ПАВ являются продуктами крупнотоннажного производства. Синтетическими аналогами липидов в качестве носителей для иммобилизации являются моющие средства (СМС), в состав которых входят смеси ПАВ с протеолитические ферментом. Неорганические носители - это матрицы на основе силикагеля, глины, керамики, природных минералов и их оксидов. Они могут быть пористыми и непористыми и применяются в виде шариков и монолита. Преимущества этих носителей в легкости регенерации и придании им любой конфигурации. ^ Методы иммобилизации ферментов подразделяют на физические и химические (при использовании последних между ферментом и носителем образуются ковалентные связи). ^ Самым известным и доступным способом иммобилизации является физическая адсорбция. В основе этого способа лежит физическое или ионное взаимодействие фермента с носителем, который может быть как неорганическим, так и органическим веществом. Проведение адсорбции очень простой процесс и заключается в контакте водного раствора фермента с носителем и отмывке не адсорбированного фермента. Более удобным способом является колоночный, когда раствор фермента «прокачивают» через колонку с носителем и последующее отмывание проводят в этой же колонке. Преимущества адсорбционной иммобилизации - простота методики, доступность и дешевизна сорбентов, возможность придания им любой формы. Недостаток - десорбция и ее последствия. Это связано с тем, что сорбция обратима, она зависит от рН и ионной силы раствора, температуры, удельной поверхности и пористости носителя, концентрации субстрата и т.д. Недостатков адсорбции удается избежать при иммобилизации ферментов в поры геля. Это тоже физический метод, заключающийся в том, что энзим как бы погружают в матрицу геля, отделяющего его от субстрата полупроницаемой оболочкой. Методически такая процедура выполняется различными способами: а) готовый полимерный гель пропитывают раствором фермента, но поскольку этот способ требует много времени, а полученный препарат обладает низкой удельной активностью, он применяется редко; б) фермент вносят в раствор мономеров до проведения их полимеризации; в) фермент вносят в раствор готового полимера до его перехода в гель. Гели, используемые для иммобилизации ферментов, содержат 50-90% воды, заполняющей пространство между полимерными цепями. Фермент, заключенный в матрицу геля, не может выйти наружу, во-первых, потому что расстояние между соседними цепями полимера меньше размеров его молекулы и, во-вторых, из-за наличия ионных и водородных связей фермента с носителем. Для иммобилизации ферментов применяются как несшитые полимерные гели, образующиеся полисахаридами (крахмалом, агар-агаром, альгинатом, каррагинаном и др.) при охлаждении их горячих растворов; так и сшитые полимерные гели, образуемые поливиниловым спиртом (ПВС) или поливинилпирролидоном, в которых при воздействии ультрафиолетового света, гамма-излучения или потока электронов возникают свободные радикалы, что приводит к образованию ковалентных сшивок между цепями. В настоящее время широкое распространение получили сшитые гели на основе производных акриловой кислоты - полиакриламидные гели (ПААГ). Включение фермента проводится на стадии синтеза полимера из мономера - акриламида в присутствии сшивающего агента – метилен-бисакриламида. Образующийся блок геля с включенными в его матрицу молекулами фермента может быть подвергнут механическому воздействию для получения частичек разной величины и формы (шарики, волокна, пленки и т.д.). Преимущества для ферментов, включенных в матрицу геля, заключаются в том, что активный центр фермента не блокирован и фермент надежно защищен от действия бактерий. Недостатки: фермент может вымываться из геля и полимерная матрица может в какой-то мере препятствовать проникновению субстрата в гель, снижая таким образом активность фермента [30-37]. Другие взаимодействия возникают между носителем, ферментом и субстратом при иммобилизации ферментов с использованием полупроницаемых оболочек. Например, микрокапсулирование – достаточно простой метод, основанный на создании вокруг капелек ферментного раствора полупроницаемых микрокапсул определенных размеров и пористости. Метод двойного эмульгирования заключается в том, что эмульсию, полученную при микрокапсулировании, диспергируют повторно в воде. Из капель органического раствора полимера образуется водная эмульсия, содержащая еще более мелкие капли водного раствора фермента. При затвердевании органического раствора образуются полимерные сферические частицы, внутри которых заключены молекулы ферментов. Одним из новых и перспективных является метод включения ферментов в везикулы. Везикулы - это концентрические сферы из двойных фосфолипидных слоев. Везикулы с включенными в них препаратами используют в медицине для введения некоторых лекарств и в фундаментальных исследованиях в качестве системы, имитирующей клетки. Все методы с использованием полупроницаемых оболочек просты, универсальны и позволяют получать различные формы иммобилизованного биокатализатора - капсулы, волокна, шарики и т.п. При этом ферменты достаточно стабильны, их активность не ограничивается явлением диффузии, а деградация под действием микроорганизмов исключается. Как и для ферментов, заключенных в гелевую матрицу, использование высокомолекулярного субстрата не представляется возможным, вследствие того, что он не сможет пройти через полупроницаемую мембрану носителя. ^ При использовании химических методов иммобилизации между ферментами и носителем возникают ковалентные связи. Ковалентные связи образуются за счет того, что ферменты, являясь веществами белковой природы, содержат на поверхности молекулы различные функциональные группы: гидроксильные, карбоксильные, тиоловые, амино-, имидазольные, гуанидиновые и т.д. Самые реакционные - это SH-группы, принимающие участие в реакциях окисления, ацилирования, алкилирования и др. Эти группы играют большую роль в стабилизации белка-фермента при помощи дисульфидных мостиков. Так как сульфгидрильные группы входят в активный центр многих ферментов, их не используют для иммобилизации, а, напротив, защищают. В качестве группы - мишени при химической иммобилизации чаще всего используют высокореакционные аминогруппы белка, которых достаточно много и роль которых в поддержании структуры фермента второстепенна. Ковалентная иммобилизация ферментов позволяет получать препараты с заданными и контролируемыми свойствами, но, вследствие дороговизны и сложности получения таких биоматериалов, их производство и применение в крупных масштабных ограничено. ^ Ферменты испытывают на себе влияние окружающей среды, поэтому окружить фермент нерастворимым полимером - это модифицировать его свойства. Например, полимерная матрица, к которой прикреплен фермент, может препятствовать проникновению к ферменту субстрата или выходу в среду продуктов реакции или же она, надежно «прикрывая» фермент, лишает его подвижности, необходимой для выполнения каталитических функций. Таким образом, свойства иммобилизованных ферментов связаны с влиянием полимерной матрицы на «микроокружение» фермента и непосредственно на его активность, а также с различными эффектами, воздействующими на реальное поведение катализатора (термин «микроокружение» используется для наименования среды внутри полимерной матрицы). Обычно активность фермента регистрируют по изменению рН, концентрации субстрата и продукта и т.д. в среде («макроокружении» фермента). В «микроокружении» эти же параметры могут иметь другие значения. Влияние полимерной матрицы на «микроокружение» связано с эффектом распределения и с диффузионными ограничениями. Эффект распределения является следствием того, что полимер либо притягивает, либо отталкивает от своей поверхности субстрат, продукт реакции, ингибитор или активатор и различные ионы, тем самым повышая или понижая их концентрацию в растворе, в результате чего их содержание вокруг фермента и во всей системе будет отличаться. Определенную роль в создании эффекта распределения играют также гидрофобные взаимодействия растворенных веществ с полимерной основой, специфические реакции между носителем и растворенным веществом и т.д. В процессе иммобилизации может быть затронута пространственная структура фермента. Если это связано с химической модификацией функциональных групп белка, то для предотвращения такого явления необходимо либо защищать эти группы в ходе иммобилизации, либо подбирать такие методы, которые не затрагивают эти группы. Когда причиной нарушения конформации фермента являются неспецифические взаимодействия между ферментом и носителем (образование электростатических, гидрофобных и водородных связей), то, либо, с помощью сшивающего агента отделяют молекулу фермента от поверхности носителя, либо заменяют носитель на инертный по отношению к катализатору. Иммобилизация повышает устойчивость фермента к внешним воздействиям, что связано с рядом факторов: концентрацией субстрата, ограничением его диффузии и т.д.. Вследствие высокой локальной концентрации фермента и диффузионных ограничений при проникновении субстрата в гель, весь субстрат, проникший в гелевую ячейку, может быть «переработанным» даже тогда, когда часть молекулы фермента будет «инактивирована» (например, тепловой обработкой) и т.д. В ряде случаев иммобилизация приводит к снижению ферментативной активности. Причиной такого явления могут быть стерические ограничения, возникающие в том случае, когда иммобилизация каким-то образом мешает доступу субстрата и эффектора в полимерную матрицу. Для устранения таких ограничений используют водорастворимые носители с небольшой молекулярной массой, проводят деградацию носителей различными агентами и т.д., не изменяя первичную структуру и пространственную организацию иммобилизованного фермента. Стерические ограничения могут возникнуть вследствие "эффекта неправильного связывания", когда в процессе иммобилизации активный центр фермента блокируется полимерной матрицей. Инактивация фермента только через активный центр (без конформационных сдвигов) может возникнуть при проведении процесса иммобилизации в жестких условиях - высокое значение рН, присутствие свободных радикалов или окисляющих агентов и другие. Установлено, что изменение исходных или эффективных параметров ферментов (распределение протонов) при иммобилизации приводит к модификации их рН-зависимости. Эти явления обусловлены либо воздействием полиионных матриц на распределение протонов, либо ограничением диффузии протонов полимерной матрицей. Способность вызывать перераспределение протонов между фазой свободного раствора и микроокружением фермента является общим свойством полиионных матриц, обусловленным присутствием заряженных (ионизированных) групп. При этом полианионы стремятся сконцентрировать протоны, снижая при этом рН вокруг иммобилизованного фермента, тогда как поликатионы обычно отталкивают протоны, повышая тем самым рН. Полимерная матрица, на которой иммобилизован фермент, может препятствовать свободной диффузии протонов, что особенно заметно с возрастанием рН. Протоны же, в отличие от большинства других продуктов биохимических реакций, влияют на активность фермента даже в том случае, если их концентрация очень низка. Поэтому при определении рН-чувствительности иммобилизованного фермента необходимо учитывать тот факт, что в «микроокружении» значение рН может отличаться от такового в «макроокружении» [37]. Иммобилизация вызывает изменение активности ферментов (в частности, величины Км) вследствие вариаций свойств микроокружения. Например, когда молекулы фермента окружены не перемешиваемым слоем растворителя (слой Нернста), в котором концентрация субстрата ниже, чем в основной массе раствора, для насыщения иммобилизованного фермента требуется более высокая концентрация субстрата. На величину Км может оказывать влияние ионная природа носителя, в частности, если субстрат заряжен. Уменьшение Км при иммобилизации дает дополнительные практические преимущества, поскольку при низких концентрациях субстрата скорость реакции будет выше, чем в случае свободного фермента. Увеличение Км, напротив, означает, что для достижения данной скорости реакции требуется большая концентрация субстрата, чем для свободного фермента. На активность иммобилизованных ферментов, как и в случае свободных, могут оказывать влияние низко- и высокомолекулярные вещества, субстраты и продукты реакции. Любая полимерная матрица, затрудняющая свободную диффузию субстрата, ограничивает и свободную диффузию продукта, в результате чего концентрация продукта в «микроокружении» будет больше, чем в свободном растворе, и он будет ингибировать ферментативную реакцию. В основе технологичности иммобилизованных ферментов лежит их высокая стабильность. Известно, что инактивацию ферментов вызывают различные физические (температура, облучение, ультразвук и др.) и химические факторы, в основе действия которых лежат следующие молекулярные механизмы: а) агрегация за счет водородных связей и гидрофобных взаимодействий; б) изменение первичной структуры в результате разрывов в полипептидной цепи и модификация функциональных групп фермента в результате их окисления, расщепления дисульфидных связей, фосфорилирования, дезаминирования и т.д.; в) диссоциация олигомерных белков-ферментов на субъединицы при действии детергентов, мочевины, температуры и т.д. Одними из наиболее удобных полимерных материалов для иммобилизации ферментов являются заряженные полиэлектролиты благодаря эффективному электростатическому взаимодействию компонентов, а также возможности варьировать как знак, так и плотность заряда на поверхности комплекса. Несмотря на большое число публикаций по образованию комплексов между двумя (анионным и катионным) полиэлектролитами, одним полиэлектролитом и ПАВ, белком и противоположно заряженным полиэлектролитом [24, 38, 28-37], задача иммобилизации ферментов в комплекс из двух противоположно заряженных полиэлектролитов с образованием трехкомпонентной системы является важной и актуальной. ^ Послойная сборка чередующихся слоев противоположно заряженных полиэлектролитов и/или наночастиц позволяют формировать тонкие пленки (5-500 нм) с монослоями из различных веществ, растущими в заранее установленной последовательности на заряженном субстрате. Эта техника была названа “molecular beaker epitaxy” (молекулярная эпитаксия в пробирке) [30-37]. Это означает, что с помощью простых методов можно получить молекулярно организованные системы или СБС, аналогичные пленкам, полученным дорогим и сложным методом молекулярной лучевой эпитаксии. Процедура послойной самосборки представлена на рисунке 19 Основная идея этого метода состоит в адсорбции полиионов, приводящей к чередованию концевых зарядов после нанесения каждого слоя. Эта главная идея подразумевает, что теоретически не существует запрета в выборе полиэлектролитов, при этом получены композитные полимерные пленки в пределах от 5 до 1000 нм с точностью более чем 1 нм и с заранее определенным составом. Для успешной сборки пленки из наночастиц или белков важен порядок чередования их с полиионами. Гибкие линейные полиионы проникают между наночастицами и выступают в роли «электростатического клея» (рис. 1.18). Концепция «электростатического полиионного клея», который соединяет вместе соседние наночастицы, является основной в данном методе, особенно плодотворна для иммобилизации ферментов [30-37]. Этот метод уже применяется для производства ультратонких пленок из заряженных полимеров (полиионов) и наночастиц (металлов, полупроводников, магнитов, ферроэлектриков и изоляторов), белков, красителей и других супрамолекулярных веществ [30-37]. Чаще всего используются следующие полиионы: поликатионы – поли(этиленимин) (ПЭИ), поли(диметилдиаллиламмоний хлорид) (ПДДА), поли(аллиламин) (ПАА), полилизин, хитозан; полианионы – поли(стиролсульфонат) (ПСС), поли(винилсульфат), поли(акриловая кислота), гепарин, ДНК. Одна полимерная нанокомпозитная пленка может содержать до сотни коммерчески доступных полиионов. Мультислойные пленки, содержащие организованные слои белковых частиц были собраны путем чередующейся электростатической адсорбции главным образом с положительно заряженными ПЭИ, ПАА, ПДДА, хитозаном и отрицательно заряженными ПСС, ДНК и гепарином [30-37]. Величина рН белковых растворов выбиралась вдали от изоэлектирческой точки и таким образом белки были заряжены, что являлось необходимым условием эксперимента. Удачно была выполнена сборка пленок с 20 разными белками (в их числе, цитохром, карбоновая ангидраза, миоглобин, гемоглобин, родопсин, пероксидаза, алкогольдегидрогеназа, глюкоамилаза, глюкозооксидаза, иммуноглобулин, каталаза). Все белки подвергались чередующейся адсорбции с органическими полиэлектролитами неограниченное количество циклов. Белки, иммобилизованные в мультислои даже с сильными полиэлектролитами, как правило, не денатурировали [37].
 Рисунок 20 – Схема сборки полиион/наночастица на сферических микроядрах
Кроме того, в некоторых случаях послойная иммобилизация в линейные и разветвленные полиэлектролиты увеличивала стабильность ферментов. Ферментативная активность в мультислоях возрастала линейно с увеличением числа белковых слоев до 10-15, и в этой точке активность пленки становилась «насыщенной». Это «насыщение» возможно обуславливается ограничением диффузии субстрата в пленку, т.е. наступлением предела доступности субстрата для фермента при постоянной скорости транспорта субстрата через мультислой [30-37]. Развитие техники сборки «полиэлектролитных пленок» для различных белков позволило конструировать мультикомпонентные белковые пленки. Эти пленки чрезвычайно интересны в качестве новых биологически активных наноматериалов. Последовательные ферментативные реакции и перенос электронов и энергии становятся возможными путем приготовления анизотропных белковых слоев с точным контролем за расстоянием между активными слоями [30-37]. Процесс сборки, разработанный для твердых носителей, может быть перенесен на пористые носители (хроматографические пластины, мембраны, пористые волокна) или на поверхность микро- и наноядер. Сборка оболочек наночастица-фермент-полиэлектролит на микроядрах является многообещающим инструментом в создании комплексов ферментных коллоидов [30-37]. Недавно был описан [37] новый подход в построении трехмерных субмикронных структур с использованием заряженного латекса и липидных трубок. При этом поликатионный раствор добавлялся к отрицательно заряженному латексу или другим ядерным частицам. После того как прошла адсорбция, латекс отделяли от раствора поликатиона (обычно 10-мин. центрифугированием при 10000 g), и затем выдерживали латекс в полианионном растворе, и так далее. Например, на рисунке 20 представлена сборка кремниевых сфер диаметром 75-нм на латексе диаметром 100 нм. Сборка оболочки проводилась в 2 этапа: сначала путем адсорбции катионного поли(этиленимина) изменялся заряд поверхности отрицательного 200-нм латекса на положительный; а затем адсорбировались организованные частицы кремния. Смешивание видоизмененных и невидоизмененных наночастиц приводит к их флоккуляции и образованию суперкристаллов: большие частицы разделяются слоем более мелких частиц [37]. Метод послойной самосборки был применен для создания тонких организованных оболочек на латексных ядрах. Организованные мультислои наночастиц (9-, 20-, 45-нм в диаметре частицы кремния или 12-нм магнетит) и глюкозооксидазы (ГОД) были собраны чередованием с противоположно заряженными полиэлектролитами на 420-нм латексных частицах. Поэтапный рост мультислойной пленки был подтвержден методом микроэлектрофореза и электронной микроскопии. Введение слоя наночастиц на латексе дает увеличение площади поверхности, что приводит к большей адсорбции ГОД и, таким образом, к увеличению каталитической активности биореактора. Биоактивность была пропорциональна площади поверхности ядра и количеству монослоев ГОД в оболочке. Кроме того, присутствие магнитных наночастиц позволяет нанореакторам самостоятельно перемешиваться с изменением магнитного поля и увеличивает их продуктивность [35-37]. Существует также несколько другой подход в создании «биореакторов»: после того как будет сформирована «поликатион-полианионная» оболочка, растворяют меланоформальдегидные латексные ядра при рН=1 и получают полые полимерные капсулы с толщиной стенок 40 нм. Эти капсулы могут включать в себя различные ферменты. Продемонстрировано увеличение каталитической активности ферментов, инкапсулированных таким способом. Ферменты в этих «биореакторах» защищены от действия высокомолекулярных денатурирующих агентов и ингибиторов, в то время как маленькие молекулы субстрата могут свободно достигать фермента. Полые полиэлектролитные оболочки, собранные методом послойной самосборки, позволяют точно контролировать размер таких оболочек, толщину оболочки, состав оболочки и ее проницаемость. В оболочки из линейных полиионов могут быть включены липидные бислои, ферменты и наночастицы. Конструкция полых полиэлектролитных оболочек включает послойную адсорбцию противоположно заряженных полиэлектролитов на каком-либо ядре с последующим разрушением этого ядра. Процедура покрытия коллоидных частиц противоположно заряженными полиэлектроли-тами является модификацией метода «самосборки» (рис. 19). После того как все заданные полиэлектролитные слои были нанесены, покрытые частицы подвергали воздействию раствора HCl для разрушения ядра. После промывания системы были получены полые оболочки (рис. 21). Используют 2 способа нагрузки оболочек: а) нагрузка при низких значениях рН; б) нагрузка в смеси воды и спирта. Оболочки, выдерживаемые при рН 4,5, образуют дыры диаметром до 10 нм. По-видимому, изменение заряда полиэлектролитов под действием изменения рН вызывает образование пор или разрыхление полиэлектролитной структуры, делая полимерные слои проницаемыми. Оболочки, выдерживаемые в смеси вода:этанол 1:1 достаточно проницаемы для проникновения глобул уреазы 5-нм в диаметре через мембрану оболочки (рис. 21). Когда эти же оболочки помещали обратно в воду, то они снова становились непроницаемыми (рис. 21). Объяснение этого процесса заключается в том, что полиэлектролитная структура становится «доменной» в водно-спиртовой среде, позволяя проникновение уреазы внутрь оболочки, в то время как при возвращении капсул в водную среду полиэлектролитные стенки переходят в закрытую структуру. Алогичным методом были инкапсулированы глюкозооксидаза, каталаза, миоглобин, гемоглобин, и химотрипсин. Ферменты в оболочках сохраняли биоактивность и увеличивали свою стабильность [37]. Таким образом, реализация принципов создания супрамолекулярных ферментных систем или СБСф – это достаточно простые и эффективные методы иммобилизации или послойной «самосборки» полимер-ферментных комплексов. Эти методы не требуют высокой чистоты компонентов, могут быть автоматизированы и применены для массового производства организованных нанокомпозитных биоматериалов. ^ В процессе иммобилизации зачастую происходит частичная потеря активности фермента. Глубина этой «денатурации» зависит от свойств сшивающего агента и подложки, а также от условий проведения реакции. Экспериментальные данные свидетельствуют, что во многих случаях молекула белка при иммобилизации практически не меняет своей нативной конформации и потеря активности связана с экранировкой активного центра поверхностью носителя. При благоприятных обстоятельствах иммобилизованный фермент сохраняет исходную активность и даже превышает ее, возможно, за счет полезных конформационных изменений или влияния локальных свойств поверхности носителя. [1, 39] Чаще всего иммобилизация приводит к существенному возрастанию стабильности фермента но отношению к нагреванию и действию денатурирующих агентов. По данным П. Каплана (США), такой лабильный фермент, как лактатдегидрогеназа, пришитая к стеклу, сохраняет свою активность в кислой среде без малейшего изменения в течение месяца. Нативный фермент в тех же условиях полностью теряет активность в течение трех часов. [1, 39] При нагревании многие иммобилизованные на поверхностях ферменты частично теряют активность в начальный период, затем активность достигает некоторого постоянного значения, которое остается далее неизменным. Например, активность трипсина, пришитого к поверхности сефадекса с помощью бромциана, при 50 °С падает до 55 % от исходной, после чего инактивация практически прекращается. Гомогенно растворенный трипсин полностью инактивируется в этих условиях в течение 6 часов. [1] Можно думать, что скорость и глубина инактивации иммобилизованных ферментов в известной степени зависит от числа связей молекулы белка с поверхностью носителя. Так, Д. Габил (Швеция) показал, что молекулы трипсина, пришитые одним или двумя мостиками к поверхности сефадекса, полностью теряют свою активность в 8 М мочевине. Фермент, прикрепленный в трех точках, сохраняет в этой среде 30 % активности. Если трипсин связан с носителем в четырех точках, его активность полностью сохраняется [1]. Физико-химические закономерности иммобилизации ферментов изучены пока еще недостаточно, однако данные о стабильности ферментов свидетельствуют, что метод иммобилизации при правильном выборе носителя, сшивающего агента и условий позволяет получить препараты ферментов, близкие по свойствам к химическим гетерогенным катализаторам [1, 39, 40]. На рисунке 22 схематически представлены основные принципиально важные способы иммобилизации ферментов. В первом случае (а) фермент пришит одной связью к поверхности носителя. Даже такая простейшая иммобилизация позволяет стабилизировать фермент. Известно, что некоторые протеолитические ферменты подвержены реакции автопротеолиза, в результате чего быстро теряется их активность. Если же такой фермент (например, трипсин или химотрипсин) привязать к поверхности, то межмолекулярное взаимодействие будет исключено и автопротеолиз прекращается. Фермент можно привязать к поверхности и рядом связей, сочетая эти связи со связыванием ферментов между собой, например, глутаровым альдегидом, диметиловым эфиром диимида адипиновой кислоты (б), его можно включить в гель или в полимер (в). Можно сочетать включение фермента в гель с пришивкой его к полимерным молекулам геля (г). Кроме того, иммобилизацию фермента можно осуществить инкапсулированием – созданием около молекул фермента полупроницаемой капсулы, например, включением фермента в липосомы.  Рисунок 22 – Некоторые виды иммобилизации. Связывание фермента с носителем осуществляется путем образования ковалентных связей между ферментом и матрицей; полимеризацией мономера; благодаря электростатическому взаимодействию противоположно заряженных групп фермента и матрицы; сополимеризацией фермента и мономера, образующего матрицу; связыванием фермента и матрицы в результате невалентных взаимодействий – гидрофобных, с образованием водородных связей и др. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям