Отчет о научно-исследовательской работе
|
|
Скачать 1.97 Mb.
|
|
1.1.6 Применение иммобилизированных ферментов 1.1.7 ФКС – диагностические тест-системы 1.1.8 Инкапсулирование ферментов |
^ Уникальные качества иммобилизованных ферментов создают реальную базу для развития новых технологических процессов. Интересные возможности открылись в пищевой, химической и других отраслях промышленности. Сегодня в промышленности реализовано всего четыре крупномасштабные технологии на основе иммобилизованных ферментов (глюкозоизомеразы, аминоацилазы, пенициллинацилазы и лактазы). В качестве примера укажем на технологически реализованный процесс получения 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК) из природного бензилпенициллина. Раствор бензилпенициллина обрабатывают иммобилизованной пенициллинамидазой, в результате чего расщепляется амидная связь с остатком фенилуксусной кислоты и образуется 6-АПК.  Химически провести такое расщепление чрезвычайно трудно, так как в молекуле пенициллина существует другая, значительно более лабильная амидная связь в четырехчленном лактамном кольце. 6-АПК служит исходным продуктом для синтеза пенициллинов широкого антибактериального спектра действия. В настоящее время особый интерес приобретает использование ампициллина, аналога природного пенициллина, в молекуле которого остаток фенилуксусной кислоты замещен остатком D-фенилглицина. Ампициллин получают химическим путем из 6-АПК и D-фенилглицина, но в принципе этот процесс может быть также осуществлен с использованием иммобилизованной пенициллинамидазы. Как выяснилось, этот фермент в кислой среде катализирует реакцию синтеза пенициллинов из 6-АПК и подходящих кислот. [41]. В обозримом будущем иммобилизованные ферменты могут быть использованы для следующих целей [41]. Лактазу иммобилизовали на частицах кремнезема и применяли для конверсии лактозы сыворотки в глюкозу и галактозу. Холинэстераза может применяться для определения пестицидов. Степень ингибирования этого фермента в присутствии пестицидов оценивают электрохимическими или колориметрическими методами. Аналогичным образом другие ферменты могут использоваться для определения токсических веществ. Так, карбоангидраза очень чувствительна даже к малым концентрациям хлорпроизводных углеводородов, гексокиназа — к хлордану, линдану и токсафену. Иммобилизованная диизопропилфторфосфатаза нервных клеток кальмара может найти применение для обезвреживания фосфоорганических нервных газов (зомана, зарина). Иммобилизованная гепариназа может применяться для предотвращения тромбообразования в аппаратах искусственного кровообращения. Иммобилизованная билирубиноксидаза может использоваться для удаления билирубина из крови новорожденных, страдающих желтухой. Наиболее хорошо изучены и широко применяются иммобилизированные ферменты для производства продуктов, в том числе диетических. Изучались условия иммобилизации в полиакриламидном геле фермента глюкозоксидазы из Aspergillus niger штамма ATCC 166808, используемой для окисления глюкозы инвертного сахара в глюконовую кислоту. Установлено, что оптимум pH не изменяется при иммобилизации, а температурный оптимум сдвигается с 50 до 55 °C. В результате иммобилизации уменьшилась инактивация фермента под действием температуры и pH среды. Наблюдается увеличение кажущейся Km. Высокая активность иммобилизированного фермента свидетельствует о возможности использования полиакриламидного геля при иммобилизации глюкооксидазы [42]. В другой работе для повышения качества инвертного сиропа и его биологической ценности кислотную инверсию сахарозы заменили ферментативной. Для этой цели использовали иммобилизованную -фруктофуранозидазу. Рекомендованы следующие условия получения инвертного сиропа из сахарного р-pa концентрацией 80%: дозировка ферментного препарата 10 ед. активности на 1 г сахара, pH 4,0, t 70±2 °C, продолжительность гидролиза 3,0-4,0 ч. Предлагаемый способ получения инвертного сиропа позволяет уменьшить расход ферментного препарата в 1,5 раза и сократить продолжительность инверсии на 1-1,5 ч [43]. β-Фруктофуранозидазы (КФ 3.2.1.26) Aspergillus niger St-0018 и A. foetidus St-0194 использованы для получения фруктоолигосахаридов в периодических и непрерывных условиях. Наиболее эффективные иммобилизованные биокатализаторы получены включением клеток в гель альгината кальция. Установлена возможность превращения остаточной сахарозы в палатинозу и трегалулозу под действием изомальтулозсинтазы (КФ 5.4.99.11) [44]. Исследовали применение промышленной пектиназы (ПЕ) в производстве плодово-ягодных соков. Определяли кинетические характеристики иммобилизованной на анионообменной St-DVB смоле с макропористой основой с использованием электростатической адсорбции промышленной ПЕ (Pectinex Ultra SP-L). Пектолитическая активность иммобилизованной и свободной ПЕ определялась с помощью вискозиметрического метода с регистрацией данных снижения вязкости при 35 °C и pH 4,5. Для определения кинетических параметров модели Микаэлиса - Ментена использовались различные концентрации пектина (0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 % масс./об.). Установили, что иммобилизованная ПЕ проявляла относительно низкую активность в сравнении с растворимым ферментом. Препарат иммобилизованной ПЕ снижал вязкость пектинового р-ра (3,5 %) после 20 мин выдержки с 717 до 132,6 Пуаз. Ферментная активность измерялась при 6 рабочих температурах в диапазоне от 20 до 90 °C. Оптимальная ферментная активность была получена при 65 °C для свободной и иммобилизованной ПЕ. Было установлено, что иммобилизация повышает теплоустойчивость ПЕ. Была определена энергия активации биохимической реакции, катализированная свободным и иммобилизованным ферментами, на основании правила Аррениуса - 9,424 и 11,98 ккал/моль соответственно. Кроме того, было установлено, что оптимальная рабочая температура не зависела от иммобилизации [45]. Кроме того, исследовали иммобилизацию пектиназы в процессе фильтрации яблочного сока с использованием полого волокна из полисульфона; определяли способность физически иммобилизованного фермента гидролизовать гелевый слой; определяли влияние ферментного слоя на сопротивление пермеатному потоку; изучали влияние глютаральдегида на процесс иммобилизации. В качестве образцов использовался цитрусовый пектин промышленного производства, из которого приготавливались дисперсии с концентрацией 1,2-10 мг/л. Для ультрафильтрации использовалась пилотная установка Amicon модели DC50P с единичным картриджем с полым волокном (0,45 м2). Проводились 3 вида экспериментов: ультрафильтрация пектинового раствора (ПР) через чистое полое волокно; ультрафильтрация ПР через полое волокно с иммобилизованной пектиназой (ИП); ультрафильтрация ПР через неактивную ИП. Установили, что в процессе ультрафильтрации ПР на ИП эффективно развивался гелевый слой. Величины относительного пермеатного потока (Jr) для мембраны без фермента в основном были ниже, чем после иммобилизации пектиназы методом адсорбции. Подтвердилось также, что величина Jr в основном более стабильна при использовании ИП. Улучшение пермеатного потока было получено только при меньшей концентрации пектина (Ср) и повышенной концентрации фермента (Се). С другой стороны, при увеличении Ср иммобилизация фермента отрицательно влияла на поток пермеата (Jp). При снижении потока ретентата (Q) до ламинарного состояния поток пермеата через мембрану без фермента усиливался более чем на 60%. То же самое наблюдалось при исследовании ИП. При увеличении рН до 7 фермент инактивировался, пектиновый гелевый слой не снижался, а Jr повышался. ИП оставалась адсорбированной на мембране, увеличивая сопротивление пермеатному потоку. Результаты исследования гидролизованного пектина показали, что содержание галактуроновой кислоты (Са) быстро повышалось вместе с Се, достигая максимума при величине Се около 5 г/л. При использовании относительно концентрированного раствора глютаральдегида было получено заметное инактивирование фермента. Хотя физическая иммобилизация промышленной пектиназы практически не увеличивает пермеатный поток, она в некоторой степени контролирует гелевый слой, образованный при ультрафильтрации яблочного сока. Пектиназный слой частично гидролизует пектиновые молекулы, непрерывно осаждаемые в процессе ультрафильтрации, тормозя скорость образования гелевого слоя на мембране и вокруг отверстий мембраны. Такой эффект обеспечивает сохранение скорости пермеатного потока на достаточно высоком уровне, чтобы снизить число ступеней промывания мембраны, увеличивая, т.о., срок работы в пределах достаточного выхода сока [46]. Также, исследовали применение промышленной пектиназы в производстве морковного сока с целью изучения активности и возможности повторного использования иммобилизованной промышленной пектиназы (ИПЕ) Pectinex Ultra SP-L на морковном пюре. Промышленное получение пектолитического фермента представляло собой иммобилизацию с применением электростатической адсорбции на частицах пористых анионообменных смол. Активность ИПЕ определялась измерением снижения вязкости модельной системы пектинового р-ра при t 35 оC. Частицы ИПЕ добавлялись в морковное пюре в количестве 1,5 г/100 г пюре для разрушения растворимого и нерастворимого пектина и вызывающих помутнение полисахаридов. Была установлена нагрузка фермента на анионообменные смолы, которая составила 8,10-81,96 %. В то время как вязкость и pH пюре снижались, содержание сухих веществ и общий выход сока повышались в результате разрушения полисахаридов. В среднем увеличение выхода сока составило 30,23 % по отношению к использованию неферментативного метода производства. При первоначальной концентрации ИПЕ 2 % об./об. выход морковного сока достиг максимальной величины 81,96 %, однако видимая ферментная активность не была связана с выходом сока и составляла 2,52 пектина (% масс./об.)/мл фермента в с. При 2-кратном использовании ИПЕ значительного снижения стабильности не наблюдалось. После 9 циклов использования ИПЕ потеря активности составила всего 20 %. Исследование устойчивости ИПЕ при хранении показало, что первоначальная активность фермента сохранялась в течение не меньше 7 нед при 4 °C и pH 4,5 в нитратном буфере. Потеря активности составила только 7,80 %. Установили, что при обработке морковного пюре кислотность сока повышалась, а содержание сухого в-ва менялось с 9,2 до 10,8 % масс./масс. в основном в результате разрушения пектина, вязкость пюре снижалась с 90 до 6,5 Пуаз после 60 мин воздействия. После повторного использования значительного снижения устойчивости иммобилизованных частиц смолы не наблюдалось в течение 1 нед экспериментов. Общее снижение активности составляло примерно 6,5 %. Результаты показали, что иммобилизация промышленной пектиназы представляет интерес для обработки морковного пюре с целью повышения выхода морковного сока [47]. Качество плодово-ягодных соков в значительной степени зависит от упаковки, при выборе которой важно учитывать ряд факторов: сохранение вкуса/аромата, возможность изменения цвета на свету, скорость потери витаминов, микробиальная активность. В работе [48] рассмотрены различные виды упаковки (стекло, металлы, полимеры), их преимущества и недостатки. Представлена таблица с наиболее важными физическими (оптическими, механическими, термическими и др.) и химическими (газо- и водопроницаемость, абсорбция ароматов и др.) свойствами полимерных У. Для соков рекомендовано использовать комбинации различных полимеров или полимеров с картоном и алюминиевой фольгой с учетом того, что ни один материал не обладает всеми необходимыми свойствами. Подробно рассмотрены пленочные упаковки нового поколения, взаимодействующие с продуктом: антимикробные полимеры (АМ); обогащающие аромат (АО); с селективными барьерными свойствами (СБ). АМ продлевают сохранность соков и других продуктов, их готовят внедрением в съедобные пленки низина, сорбатов или иммобилизованных ферментов, в частности глюкозооксидазы. Используют также антимикробные свойства ионов серебра, покрывая солями серебра цеолиты и затем внедряя их в контактирующий с поверхностью пищевого продукта ПЭНП (полиэтилен низкой плотности). Дана таблица с рядом веществ, которые могут быть добавлены к полимерам, делая их АМ. ОА пленки содержат иммобилизованные ферменты, которые улучшают аромат соков из плодовых цитрусовых культур и гидролизуют вещества, придающие горечь соку. Упаковка в модифицированной газовой среде (3-6 % O2, 2-10 % CO2) в пленки СБ значительно повышает сохранение качества продуктов. Изучались условия иммобилизации и структурно-функциональные свойства иммобилизованной инулазы, фермента, перспективного для производства диетических продуктов из нетрадиционных видов растительного сырья. В качестве носителей для иммобилизации инулазы были апробированы ионообменные смолы, подготовленные к связыванию с молекулой фермента путем кондиционирования. Данные по исследованию аминокислотного состава фермента показали, что инулаза содержит преимущественно полярные аминокислотные остатки (аспарагиновые и глутаминовые), а также имеет в своем составе имидазольные группы гистадина. Эксперименты по исследованию влияния температуры на каталитическую активность инулазы свидетельствуют о том, что фермент является термостабильным: даже при 70 °С активность сохраняется на 22 % от максимальной. Температурный оптимум функционирования инулазы лежит в пределах 47-51 °С с максимальной активностью при 50 °С. Опыты с ионами железа (ИЖ) показали, что при концентрации 104 М/л ИЖ вызывают увеличение активности фермента на 20 %. Воздействие ИЖ на свободную инулазу также приводит к активации фермента, но повышает каталитическую активность на 25-30 %. Было также установлено, что ИЖ не влияют на кинетику ферментативного катализа реакции гидролиза субстрата, а лишь оказывают воздействие на реакцию воздействия фермента с субстратом, т.е. ИЖ выступают в роли структурного агента. Исследования показали, что иммобилизованную инулазу можно использовать для гидролиза инулина в реакторе колоночного типа в течение нескольких мес [49]. В работе Kochhar A. at al.[50] исследования посвящены идентификации штамма Aspergillus candidus (NCIM 883) (10 ед./см3 среды) с высоким производством инулиназы (ИН) для получения фруктозы из инулина. Межклеточная ИН этого плесневого гриба была очищена в 56 раз фракционированием с сульфатом аммония и методом колоночной хроматографии. Соотношение содержания инвертазы к ИН (1,8 в фильтрате культуры) было снижено до 0,14 в очищенном растворе. Оптимальные значения рН и температуры составили 5,5 и 45 оС, соответственно. Молекулярная масса ИН была определена равной 54±4 кДа, Km ИН с инулином в качестве субстрата был равен 3,8 мМ/дм3. Очищенный препарат позволил получать только фруктозу в качестве продукта гидролиза инулина, что указывает на то, что ИН обладает, главным образом, экзо-инулиназной активностью. ИН была иммобилизована на хитине и казеине с помощью глютаральдегида в качестве связующего агента и на целлюлозе с помощью FeCl3-HCl в качестве хелатообразователя. На целлюлозе был достигнут максимум иммобилизации (45,8 %). Все 3 иммобилизованных препарата имели более высокую оптимальную t 55 °С. ИН, иммобилизованные на целлюлозе и казеине, были стабильны при рН 5-7. Препарат, иммобилизованный на целлюлозе, был более устойчивым, чем другие 2 после нагревания в течение 1 ч при t 55 °С, и сохранял 76 % активности по сравнению с 52 % и 61 % для препаратов, иммобилизованных на хитине и казеине, соответственно. Нагревание выше 55 °С приводило к быстрому спаду активности. Препараты ИН гриба Aspergillus candidus были более устойчивы по сравнению с 50%-ной потерей активности иммобилизованной ИН Fusarium oxysporum при t 50 оС в течение 45 мин. Km ИН, иммобилизованной на целлюлозе, казеине и хитине составили 1,25, 0,3 и 1,66 мМ/дм3, соответственно. Следовательно, иммобилизация не оказала вредного воздействия на сродство инулина с ферментом [50]. Возможно, вскоре удастся создать системы из нескольких иммобилизованных ферментов. Так, если заключить в микрокапсулы три фермента — уреазу, глутаматдегидрогеназу и глюкозодегидрогеназу, то их можно будет использовать для удаления мочевины из крови больных с почечной недостаточностью. Иммобилизованные ферменты найдут дальнейшее применение в молочной промышленности. При производстве сыра могут использоваться иммобилизованные свертывающие молоко белки — реннин и пепсин. Для гидролиза жира в молоке можно использовать иммобилизованные липазы и эстеразы. Разнообразные иммобилизованные ферменты со временем найдут применение и в датчиках для быстрого анализа. Сегодня в таком качестве используются лишь несколько ферментов, но когда будет решена проблема стабилизации, их число увеличится. Особенно полезными из-за их высокой стабильности могут оказаться ферменты термофилов. Хорошие результаты дает применение ферментов иммобилизованных, т.е. фиксированных на твердых носителях, которые не реагируют с пищевым соком и устойчивы к механическим, химическим и микробиологическим воздействиям. К таким носителям относятся синтетические смолы, полистиролы, полимерные карбоновые соединения. Ферменты связываются с носителем в результате взаимодействия реактивных групп их белковых молекул (амино- и карбоксильные группы) с реактивными группами носителя (кислоты, альдегиды). Активность иммобилизованных ферментов в несколько сот раз выше, чем ферментов, растворенных в соке [51, 52]. В настоящее время ферменты широко используются в биотехнологическом производстве и лабораторных исследованиях. В связи с чем, актуальным является продление и увеличение их активности. Использование наночастиц, обладающих рядом уникальных свойств, открывает перспективу модуляции каталитических свойств ферментов. Показано, что связывание ферментов с наночастицам приводит к сохранению их активности при отклонении параметров реакции (рН, температуры) от оптимальных [53, 54]. Ферменты, иммобилизованные на наночастицах, имеют так же более длительный срок хранения. Однако в некоторых работах сообщается об угнетении активности ферментов при взаимодействии с наночастицами [55]. Глюкоамилаза препарата «Глюкоаваморин» иммобилизована адсорбцией на углеродном носителе марки «Сибунит». Полученный биокатализатор изучен в процессе осахаривания крахмала (гидролиз декстринов). Исследования по влиянию адсорбционной иммобилизации на кинетические характеристики глюкоамилазы, в том числе на константы скорости термоинактивации, показали, что при иммобилизации Глюкоаваморина на углеродном носителе Сибуните наблюдается 103-кратное повышение термостабильности глюкоамилазы по сравнению с ферментом в растворе. Значительный стабилизирующий эффект оказывает присутствие субстрата (декстрины) в реакционной среде, причем увеличение концентрации декстринов приводит к повышению термостабильности иммобилизованного фермента. Суммарный эффект стабилизации глюкоамилазы при ее адсорбции на углеродном носителе Сибуните в присутствии 53%-ных растворов декстринов составляет ~105 раз по сравнению с ферментом в растворе. Биокатализатор для процесса осахаривания крахмала, приготовленный на основе иммобилизованного на Сибуните Глюкоаваморина, отличается высокой операционной стабильностью: при 60 °С время его полуинактивации превышает 30 сут [56]. ^ Клинико-биохимические анализы относятся к числу самых распространенных методов используемых для диагностики заболеваний человека. Такого рода исследования, как известно, включают общие анализы крови и мочи, изучение состава ряда других биожидкостей организма. Не менее перспективным и многообещающим является применение наночастиц-ферментов в создании индикаторных и диагностических тест-систем (прототипов биочипов) для биологии и медицины. В частности, если фермент катализирует какую-нибудь реакцию с изменением рН, то любой рН-чувствительный электрод, покрытый пленкой иммобилизованного фермента, будет чувствовать только то вещество, которое превращается под действием данного фермента. Есть другой путь: поместить фермент на поверхность термистора, в этом случае термодатчик будет чувствителен к реакции субстрата, сопровождающейся выделением или поглощением тепла. При использовании абсолютно специфичных ферментов можно получить абсолютно специфичные электроды, настроенные только на одно определенное вещество [1]. Биологическим материалом биосенсоров являются ферменты и высокоселективные клетки микроорганизмов. Созданные биосенсорные системы являютсяя базовыми и могут быть настроены на анализ широкого спектра сахаров и алифатических спиртов сахарозы, ксилозы, арабинозы, метилового, изопропилового спиртов и т.д., оценки качества применяемых ферментов, оценки качества дрожжевой массы. Уже развиты быстрые клинические методы анализа на глюкозу, мочевину и ряд других компонентов. Созданные анализаторы имеют ряд важных преимуществ. К таковым в первую очередь относится высокая специфичность и чувствительность анализа, простота его аппаратурной реализации, выполнение анализа без привлечения высококвалифицированного персонала, возможность его автоматизации и выполнения в режиме реального времени. К упорядоченным белковым пленкам проявляется неослабевающий интерес при фундаментальных и прикладных исследованиях в ряде областей науки и техники, таких, как аналитическая биотехнология, биоэлектроника, микробиология, генетика, фармакология и т.д. К числу важнейших сфер практического применения белковых пленок относится использование таких структур в качестве активных элементов в биосенсорном приборостроении. Тонкие пленки на основе иммобилизированных ферментов широко используется в биологии, биохимии и медицине с диагностической целью – для иммуноферментного анализа. Конструирование упорядоченных на молекулярном уровне белковых ансамблей позволяет достигать максимальной чувствительности и специфичности биосенсора благодаря высокоаффинным взаимодействиям типа лиганд/рецептор. Кроме того, исследование адсорбированных ферментов является одним из хорошо известных методов изучения их структурной макромолекулярной организации, а также природы химических взаимодействий, лежащих в основе ферментативной активности. Применение белковых пленок позволяет моделировать отдельные этапы самоорганизации и получать информацию, важную для идентификации биосистем, находящихся как в нормальном, так и патологическом состоянии. Фундаментальное значение таких исследований обусловлено поиском ответа на вопрос, как из простейших элементов возникают сложные биологические системы. Несмотря на многолетние усилия предпринятые для создания способов нанесения упорядоченных белковых пленок, общего и надежного метода получения упорядоченных белковых наноструктур на твердых подложках до сих пор не было предложено. Главные трудности при формировании белковых пленок на твердых подложках связаны с частичной потерей функциональной активности, нарушением конформационного строения и другими деструктивными изменениями белковых молекул. Поэтому продолжают оставаться актуальными научные исследования, направленные на дальнейшее совершенствование методов нанесения белковых пленок на подложки, а также поиск новых иммобилизующих соединений, позволяющих обеспечить создание наиболее благоприятных условий для проявления каталитической активности при высокой степени связывания и упорядочение молекул в пленке. Одним из наиболее эффективных методов иммобилизации белков с сохранением их функциональной активности является адсорбция белков на предварительно сформированный ленгмюровский слой амфифильных соединений (липиды, полимеры), осуществляющие специфическую связь с определенными функциональными группами белковых молекул. В работе Степина Н.Д. и др. для получения упорядоченных белковых пленок на твердых подложках был использован органический полимер – ацетопивалинат целлюлозы. Ацетопивалинат целлюлозы имеет следующее строение: [(CH3)3 COO]х ·(OH)z ·(CH3COO)y. Количество заместителей ОН-группы (на 100 глюкозидных колец) в молекуле целлюлозы: х = 175 (пивалинат), у = 10 (ацетат), z = 115 – ( где ОН–группа обозначает оставшиеся незамещенные гидроксильные группы в полимерной цепи). Разработанный в Институте высокомолекулярных соединений РАН (Санкт-Петербург) метод синтеза ацетопивалината целлюлозы позволяет получать препарат с определенным содержанием гидроксильных групп полимерной цепи. Ацетопивалинат целлюлозы обладает улучшенными иммобилизирующими свойствами (по сравнению с другими полимерами и липидами) за счет оптимального соотношения гидрофильных и гидрофобных остатков. Предложен способ нанесения упорядоченных белковых пленок на твердые подложки, основанный на адсорбции белковых молекул на предварительно сформированный ленгмюровский монослой природного полимера – ацетопивалината целлюлозы. Была реализована комбинация метода Ленгмюра-Блоджетт с молекулярной самосборкой. Исследования методом атомно-силовой микроскопии показали, что разработанный способ обеспечивает нанесение однородных ультратонких белковых пленок, отличающихся высокой степенью заполнения. Проведена оценка функциональной активности белковых пленок [57]. ^ Общим недостатком существующих клинико-биохимических методов качественного и количественного анализа нативных биологических жидкостей является необходимость их фракционирования. До недавнего времени эти анализы проводились с помощью химических методов, но в связи с токсичностью многих из них, низкой чувствительностью и другими недостатками, в настоящее время широкое распространение получили энзимологические методы, когда используется «свободный» фермент. Однако, наряду с явными преимуществами такого подхода есть и ряд недостатков: неоднозначность анализа в присутствии других, агрессивных к ферменту высокомолекулярных соединений, в частности, протеаз и других внутриклеточных компонентов, одноразовое использование фермента и т.д. Таким образом, появляется необходимость защитить фермент-сенсор от неблагоприятного воздействия, сохранив при этом к нему доступ субстрата. Одним из видов такой защиты нам представляется инкапсулирование ферментов в полиэлектролитные нано- и микрокапсулы (ПНМК) изготавливаемые методом поочередного наслаивания противоположно заряженных полиэлектролитов на дисперсные частицы нано- и микро размеров с последующим разрушением и удалением этих частиц. В работе Сухорукова Б.И. [58] с соавт. описана разработка нового типа диагностикума широкого, в том числе и медицинского назначения. Основным элементом диагностикума является мультислойная полиэлектролитная нано- и микрокапсула с включенным в нее ферментом, исходным субстратом, ингибитором или активатором которого является один из компонентов анализируемой среды. По сравнению с существующими в медицине ферментативными методами анализа биожидкостей предлагаемый микродиагностикум имеет явные преимущества, поскольку инкапсулированный фермент, во-первых, сохраняет свою активность в течение нескольких месяцев, в то время как активность фермента в растворе в «свободном» состоянии падает практически до нуля через несколько дней, во-вторых, сохраняет активность в анализируемой биологической жидкости, содержащей протеиназы, исключая тем самым необходимость их удаления из анализируемой среды, в-третьих, может быть использован многократно, уменьшая тем самым расход фермента [58]. Полиэлектролитные нано- и микрокапсуы (ПНМК) относятся к изделиям новой области полимерной нанотехнологии. Начиная с 1998 г., в литературе был опубликован ряд работ[58-60] по получению и изучению свойств полых полиэлектролитных микрокапсул с нанометровой толщиной. Такие капсулы изготавливались путем поочередного наслаивания противоположно заряженных полиэлектролитов на дисперсные частицы нано- и микроразмеров, так называемые «коры», с последующим разрушением и удалением этих частиц. Основным свойством полиэлектролитной нано- и микрокапсулы (ПНМК), определяющим как само ее получение, так и другие свойства и особенности, является полупроницаемость оболочки капсулы – проницаемость для низкомолекулярных соединений и их мелких агрегатов и непроницаемость для высокомолекулярных веществ и крупных частиц. Для получения полых ПНМК в качестве «кора» были широко использованы монодисперсные микрочастицы (0,5–10 мкм) меламинформальда (МФ), латекса (ЛТ) и SiO2. Разрушались МФ микрочастицы подкислением среды до рН 1, ЛТ частицы – органическими растворителями, а SiO2 – плавиковой кислотой. В последнее время в качестве кора стали использовать микросферолиты СаСО3, которые способны разрушаться в мягких условиях (комнатная температура, нейтральные рН в присутствии ЭДТА или небольшое подкисление среды). Это позволяло снять практически все существующие ограничения на типы полиэлектролитов, пригодных для получения мультислойных ПНМК и, что особенно важно, решить проблему загрузки ПНМК различными ферментами-сенсорами и сделать возможным создание микродиагностикума на анализ низкомолекулярных веществ в нативных биологических жидкостях и сточных водах. При использовании СаСО3 в качестве кора загрузка фермента в полиэлектролитную капсулу принципиально отличается от тех подходов, которые использовали ранее. Она состоит в том, что первоначально фермент включается в микросферолит СаСО3 , а затем уже на составном микросферолите СаСО3-фермент формируется полиэлектролитная оболочка. Принципиальным моментом в предлагаемой нами технологии получения ПНМК, содержащей фермент, является формирование оболочки лишь из селективно подобранной пары полиэлектролитов. Это связано с тем, что определенные полиэлектролиты при взаимодействии с ферментом способны его инактивировать. Поэтому технология получения ПНМК, содержащих ферменты, должна включать в себя контроль за ингибиторным действием полиэлектролитов, используемых для конструирования оболочки капсулы. Авторами разработана технология получения содержащих ферменты полиэлектролитных нано- и микрокапсул – основных элементов ферментного микродиагностикума. Она состоит из: 1- стадии получения в качестве «кора» микросферолита СаСО3 с включенным в него ферментом; 2- стадии поочередного наслаивания селективно подобранных противоположно заряженных полиэлектролитов на частицы «кора» и формирования мультислойной оболочки; 3- стадии разрушения и удаления карбонатного компонента «кора»; 4 - стадии контроля за функциональным состоянием инкапсулированного фермента. Благодаря полупроницаемости полиэлектролитной оболочки содержащая фермент микрокапсула, помещенная в многокомпонентную среду, становится анализатором в ней низкомолекулярных веществ-субстратов, ингибиторов или активаторов фермента. В работе Шабарчиной Л.И. с соавт. функциональные свойства разрабатываемого микродиагностикума проиллюстрированы на примере работы уреазной микрокапсулы – анализатора на мочевину [59]. Еще одна работа [60] посвящена инкапсулированию белков в полиэлектролитные микрокапсулы и разработке ферментных микродиагностикумов для определения низкомолекулярных веществ в нативных биологических жидкостях. Эта задача решена на примере двух ферментов - лактатдегидрогеназы и уреазы. Для получения полиэлектролитных микрокапсул были использованы два полианиона: полистиролсульфоyат и декстрансульфат и два поликатиона - полиаллиламин и полидиаллилдиметиламмоний. При формировании полиэлектролитных микрокапсул в качестве «ядра» использованы микросферолиты карбоната кальция с включенным в них ферментом. Показано, что основной проблемой при создании полиэлектролитного микродиагностикума является подбор противоположно заряженной пары полиэлектролитов, оптимальной для активного функционирования фермента. Для лактатдегидрогеназы наилучшими полиэлектролитными парами оказались полиаллиламин/декстрансульфат и полиаллиламин/полистиролсульфонат, а для уреазы – полистиролсульфонат/полиаллиламин и полистнролсульфонат/полиди-аллилдиметиламмоний. Принимая во внимание эти данные, учеными сконструированы содержащие фермент микрокапсулы с разным полиэлектролитным составом и числом слоев и изучены их свойства. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям