Идентификация и характеристика биологических свойств белков суперсемейства иммуноглобулинов животных 03. 01. 06 биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 06.
|
|
Скачать 0.68 Mb.
|
|
На правах рукописи ЕЗДАКОВА ИРИНА ЮРЬЕВНА Идентификация и характеристика биологических свойств белков суперсемейства иммуноглобулинов животных 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2010 Работа выполнена в лаборатории иммунологии Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко» Россельхозакадемии (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии) ^ доктор биологических наук, профессор Верховский Олег Анатольевич. Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Поляков Виктор Филиппович доктор медицинских наук, профессор Булычева Татьяна Ивановна; доктор биологических наук Власова Наталья Никифоровна. ^ : ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» Защита диссертации состоится «_____» __________20 г. в ________ часов на заседании диссертационного совета Д 006.033.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии по адресу: 109428, Москва, Рязанский проспект,24,к.1,ВИЭВ, тел. (495) 970-03-69. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии Автореферат разослан «_____» ______________ 20 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор ветеринарных наук, профессор А.Х. Найманов ^ Актуальность темы. В основе научного прогресса лежит эволюция методических приемов, используемых для решения современных задач иммунологии. Внедрение новой методологии, совершенствование методов исследования – главный фактор повышения уровня знаний в области молекулярной биологии иммунного ответа, где ключевую роль играют антитела, рецепторы иммунокомпетнтных клеток, межклеточные взаимодействия. Механизмы врожденного и адаптивного иммунитета основаны на межклеточной кооперации трех основных популяций лейкоцитов: макрофагов, Т- и В-лимфоцитов, которые на разных этапах онто- и иммуногенеза включаются в иммунные реакции, причем доля их участия зависит от вида инфекции (Цинкернагель Р., 2008). Иммунокомпетентные клетки несут на своей поверхности специфические рецепторы, с помощью которых их можно идентифицировать. Принципы классификации рецепторов - антигенных маркеров лейкоцитов человека, выявляемых моноклональными антителами (МкА), были сформулированы на 1-м Международном совещании в Париже в 1982 г. Эти маркеры обозначили как cluster of differentiation – символом CD и соответствующими номерами. К настоящему времени создана единая номенклатура системы CD, состоящая из более 300 дифференцировочных молекул клеток человека и животных. 30% CD-антигенов относится к суперсемейству иммуноглобулинов (IgSF), при участии которых происходит распознавание антигенов. Они содержат общие структурные элементы, характеризуются определенной пространственной доменной организацией и статистически значимой гомологией аминокислотных последовательностей (Ройт А. и др., 2000, Рабсон А. и др., 2006, Бурместер Г.-Р. И др., 2007 и др.). IgSF, как одни из важнейших молекул иммунной системы, обеспечивают защиту от микро- организмов, поврежденных и генетически измененных клеток (Ярилин А.А., 1999, Давтян Т.К. и др., 2005, Сидорова Е.Б., 2006 и др.). Наиболее иммунологически значимыми белками IgSF являются: - иммуноглобулины (Ig), существующие в двух формах: растворимые белки (секретируемые антитела) и мембраносвязанные (sIg), являющиеся поверхностными рецепторами В-лимфоцитов; - иммуноглобулиноподобные молекулы (ILT), представляющие собой мембранные рецепторы иммунокомпетентных клеток. Среди мембраносвязанных белков IgSF большой интерес представляют рецепторы, находящиеся на поверхности Т-клеток (CD2, CD4, CD8 и др.), макрофагов (Fc- рецепторы) и В-лимфоцитов (BCR – антигенный рецептор В-клетки). Функциональная и количественная характеристика данных белков является чувствительным маркером оценки состояния иммунной системы (Кирюхин А.В. и др., 2003, Добротина Н.А. и др., 2005, Артюхов В.Г и др., 2006 и др.). Вместе с тем, следует отметить, что закономерности формирования иммунного ответа на молекулярном уровне у животных, в частности, механизмы перекрестного связывания антигена с рецепторами В-клеток, роль адгезивных молекул Т-лимфоцитов и макрофагов в трансдукции сигнала при иммунизации, изучены недостаточно. Разработка методов исследования IgSF, характеристика их биологических свойств, а именно функциональных и рецепторных, в процессах онто- и иммуногенеза является перспективным направлением для определения иммунологической эффективности биологических препаратов, создания новых безопасных вакцин – основу специфической профилактики болезней животных. В настоящее время для оценки состояния иммунной системы разработан комплекс лабораторных методов, позволяющий выявлять изменения на молекулярно-клеточном уровне. Прежде всего, это иммуноцитохимический анализ мембранных и цитоплазматических структур иммуноцитов (Haines D.M. и West K.H., 2005, Саидов М.З. и др., 2006, Высочин И.В. и др., 2006 и др.). Эти и другие способы определения и характеристики IgSF послужили методологической основой наших исследований. ^ – разработка современной методологии идентификации белков суперсемейства иммуноглобулинов и характеристика их биологических свойств в процессе фило-., онто- и иммуногенеза. Для достижения указанной цели в работе были поставлены следующие задачи: 1. Разработать способы получения иммуноглобулинов изотипов G, М, А (IgG, IgM, IgA) рогатого скота. 2. Получить моноспецифические антисыворотки для количественной оценки иммуноглобулинов изотипов G, А в биологических жидкостях организма рогатого скота и провести сравнительный анализ с моноклональными антителами к Ig. 3. Усовершенствовать методы изучения и оценки растворимых и мембранных форм белков суперсемейства иммуноглобулинов 4. Разработать методы исследования В-клеток крупного рогатого скота с использованием моноклональных антител к IgM. 5. Изучить протективные свойства белков суперсемейства иммуноглобулинов у мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза. 6. Дать характеристику секретируемым и мембранным (sIg) формам Ig крупного рогатого скота и овец в различные периоды онтогенеза. 7. Провести оценку количественных изменений клеток, несущих рецепторные белки IgSF у различных видов животных. Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР ВИЭВ задание 01.01.05 М МП «Разработать и освоить производство моноспецифических антисывороток и моноклональных антител для количественного определения уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных», этап Н.02.2 «Провести комплексные исследования по оценке функционального состояния гуморальных и клеточных факторов иммунной системы у мышей в процессе иммуногенеза»; задание 01.01.09 М МП «Разработать и освоить производство набора компонентов для оценки иммунного статуса организма животных»; задание 02.02.11 РНТП «Изучить механизмы формирования иммунного ответа у животных в процессе онто- и иммуногенеза, разработать и усовершенствовать методы иммунологического мониторинга». ^ Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена концепция комплексного подхода к оценке состояния иммунной системы в процессе онто- и иммуногенеза на основе функционально-рецепторной характеристики белков суперсемейства иммуноглобулинов. Установлено, что рецепторный профиль иммунокомпетентных клеток определяет их функциональную активность в реакциях различного генеза. На основании результатов проведенных исследований: - получен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus, используемый для получения моноклональных антител к IgМ рогатого скота (Авторское свидетельство № 1560549 от 3.01.90 г. в соавторстве); - разработан способ выделения иммуноглобулина А из молозива крупного рогатого скота (патент на изобретение № 2277421 от 5 апреля 2005 г. в соавторстве); - разработан способ получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости крупного рогатого скота (патент на изобретение № 2288008 от 27 ноября 2006 г. в соавторстве); - разработан метод иммунопероксидазного окрашивания клеток для количественной оценки В-лимфоцитов крупного рогатого скота на основе моноклональных антител к иммуноглобулину М (патент на изобретение № 2293330 от 10 февраля 2007 г.). Впервые определены формы локализации поверхностных иммуноглобулинов В-клеток у крупного рогатого скота и проведен корреляционный анализ содержания растворимого и мембраносвязанного IgM в периферической крови животных данного вида. Впервые изучена динамика содержания sIgМ-клеток у коров в период плодоношения. Впервые для определения состояния иммунной системы животных выбран критерий взаимосвязи растворимых и мембранных форм иммуноглобулинов. ^ . Систематизированы экспериментальные данные о функционально-рецепторной характеристике IgSF, содержащие выводы по методическому подходу к изучению иммунной системы животных, а также даны конкретные рекомендации, которые позволяют интенсифицировать исследования в области ветеринарной иммунологии. Разработаны в соавторстве и утверждены в установленном порядке: - «Набор компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии», утвержденным Министерством Сельского хозяйства и продовольствия РФ, ТУ № 9388-0039-00008064-96, 1996 г.; - временное наставление по применению набора компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии № 13-7-2/617, утвержденное Департаментом Ветеринарии МСХиП РФ от 27.05.96 г.; - методические рекомендации «Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных», рассмотренные и утвержденные Сибирским отделением РАСХН, Новосибирск, 2003 г.; - технологический регламент по изготовлению, контролю и применению набора реагентов для количественного определения иммуноглобулина G в биологических жидкостях рогатого скота, 2010 г.; - технологический регламент по изготовлению, контролю и применению набора реагентов для количественного определения иммуноглобулина А в биологических жидкостях рогатого скота, 2010 г. Рассмотрены и утверждены в установленном порядке Отделением ветеринарной медицины РАСХН: - методические рекомендации по количественному определению и оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток животных (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 20 мая 2005 г., протокол № 1) (авторы: Ю.Н.Федоров и И.Ю.Ездакова); - методические рекомендации по определению sIg В-клеток (иммунопероксидазное окрашивание) (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г., протокол № 2) (автор: И.Ю.Ездакова); - методические рекомендации «Определение поверхностных структур иммунокомпетентных клеток методом иммунофлуоресценции» (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г., протокол № 2) (автор: И.Ю.Ездакова); - методические наставления по использованию моноклональных антител для оценки уровня иммуноглобулинов классов М и А в биологических жидкостях крупного рогатого скота и овец (секция «Инфекционные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.04.2010 г. протокол№2) (авторы: И.Ю.Ездакова и Т.А.Чеботарева) Получены: серебряная медаль на 8-ой Российской агропромышленной выставке «Золотая осень» «За Способ получения секреторного иммуноглобулина А крупного рогатого скота» (2006 г.); золотая медаль на 10-й «За способ определения антител в иммуноцитохимическом анализе» (2008 г.); медали «Лауреат ВВЦ» в 1998 г. и в 2008 г. за разработку препаратов для оценки состояния иммунной системы животных; «Звезда И.И.Мечникова» за инновационное развитие и продвижение научного наследия И.И.Мечникова в 2010 г. ^ Основные результаты работы доложены: - на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИиТИБП «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2000); Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2001); Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМиБ им. К.И.Скрябина (Москва, 2004); научной конференции «30 лет развития современных направлений клеточной биотехнологии» (Москва, 2005); секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2005, 2008); Международной научной конференции «Современные проблемы клеточной биотехнологии и сохранение генетических ресурсов» (Москва, 2006); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р.Коваленко (Москва, 2006); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях», посвященной 60-летию Краснодарского научно-исследовательского ветеринарного института (2006); 20- 21- и 22-ой Международных ежегодных конференциях Европейского сообщества по изучению китообразных (ECS) (Гдыня, 2006; Сан-Себастьян, 2007; Эгмонд, 2008); Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2008); Ученом Совете, Методической комиссии ВИЭВ (1995-2008); VII съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 45 научных работ, в том числе 15 работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ, монография «Рецепторы иммунного узнавания у животных», 1 авторское свидетельство и 3 патента на изобретение. ^ Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи д.б.н., профессору Л.П.Дьяконову, д.б.н., профессору О.А.Верховскому, к.б.н. Т.А Чеботаревой и сотрудникам лаборатории иммунологии ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии. ^ . Диссертационная работа изложена на 313 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Материалы диссертации иллюстрированы 31 таблицей и 53 рисунками. Список литературы включает 377 источников, из них 204 зарубежных авторов. ^ - разработка и совершенствование методов количественной оценки иммуноглобулинов, Т- лимфоцитов, В- лимфоцитов и макрофагов; - оценка содержания секретируемой и мембраносвязанной форм Ig крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза; - функциональные и рецепторные свойства IgSF иммунокомпетентных клеток млекопитающих, птиц и рыб в норме и при различных антигенных воздействиях. ^ Исследования выполнены в лаборатории иммунологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко в период 1985-2010 гг. Общая схема исследований представлена на рис. 1. В качестве объектов исследования использованы различные виды животных - мыши линии BALB/c, гибриды F1 (BALB/c х DBA/2) и беспородные мыши, кролики, крупный рогатый скот, овцы, куры, норки, серебряные караси, карпы. Материалом для исследований служили первичные (тимус, костный мозг) и вторичные (селезенка, лимфатические узлы, пейеровы бляшки) лимфоидные органы, кровь, а также перитонеальные макрофаги лабораторных мышей. Исследования иммунного статуса проводили у рыб, доставленных из рыбхозов «Гжелка» и «Биссеровский» Московской области. Отбор проб крови крупного и мелкого рогатого скота для иммунологических исследований проводили в ЗАО «Кузнецовский» Наро-Фоминского района Московской области и на опытной базе ВИЭВ о.Лисий. Образцы крови норок и кур получены в ходе совместных исследований с сотрудниками МГАВМиБ им. К.И.Скрябина и лаб. по изучению болезней птиц ВИЭВ. Методы исследований Разработка и оптимизация методов количественной оценки иммуноглобулинов и клеток с Ig-подобными рецепторами   ^ Методы количественного определения Ig Клеточные факторы Методы оценки ILT – и sIg- рецепторных клеток     ^ Характеристика растворимой и мембраносвязанной форм IgM рогатого скота в различные периоды онтогенеза ^ Рис.1. Общая схема исследований Для определения уровня иммуноглобулинов, исследований по количественной характеристике и функциональной активности иммунокомпетентных клеток использовано более 5000 проб сыворотки и цельной крови мышей, крупного рогатого скота, птиц и рыб. При изучении поверхностных структур иммунокомпетентных клеток применяли производственную вакцину против рожи свиней из штамма ВР-2 (Щелковская биофабрика), ассоциированную вакцину против трансмиссивного гастроэнтерита («ТМК») и ротавирусной инфекции («К») свиней (опытная серия, ВИЭВ) и производственную вакцину против парвовирусного энтерита собак (АО «Ветзвероцентр»). IgG и IgA из биологических жидкостей крупного рогатого скота и мышей выделяли методами гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Наличие и степень чистоты полученных препаратов определяли методом иммуноэлектрофореза с использованием антисыворотки к белкам крови крупного рогатого скота и мышей и методом электрофореза в полиакриламидном геле в буферной системе Laemmli U.K. (1970). Иммуноблоттинг проводили в буферной системе H.Towbin et al (1979). Иммунизацию кроликов породы «Советская шиншилла» с массой 2,5-3,0 кг, проводили по методу, разработанному М.А.Мисниковой и А.Ю.Самострельским в нашей модификации. Моноклональные антитела к IgM (Сологуб В.К. и др., 1988) и IgA (Феоктистова Т.А. и др., 2003) рогатого скота получали по разработанной схеме на основе методики P.S. Paul et al. (1985). Реакцию двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони (РДП) использовали для определения чистоты, рабочего разведения антисывороток и изотипирования антител (Фримель Х.,1979). Уровень иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных определяли методом простой радиальной иммунодиффузии – РИД (Manchini G. et al, 1965). Количественную динамику розеткообразующих клеток определяли в реакции розеткообразования (Е-РО) (Кондрахин И.П. и др., 1985), теофиллиновом тесте (Караулов А.В.,2002), антигенном розеткообразовании (А-РО) (Лебедев К.А. и др.,1981). Фагоцитарную активность исследовали с помощью клеток дрожжей, тест-культуры Staphylococcus aureus (АТСС 29213), частиц зимозана и латекса по стандартным методикам. Исследование механизмов межклеточных взаимодействий и адгезивной активности иммунокомпетентных клеток проводили в реакции контактного взаимодействия макрофагов и тимоцитов (РКВ) (Горбачева Л.Д. и др., 1981). Тест-системы с использованием моноклональных антител основаны на «сэндвич»-варианте твердофазного иммуноферментного анализа. В качестве конъюгатов использовали МкА 6В8 к IgA рогатого скота, меченные пероксидазой хрена (Sigma). Изотипы Ig мышей определяли с помощью биотин-антииммуноглобулинового и авидин-пероксидазного конъюгатов, согласно инструкции фирмы производителя (Sigma ImmunoChemicals). Результаты оценивали с помощью фотометра «Multiskan MCC/340» по коэффициенту оптического поглощения (ОП 492). Для определения поверхностных иммуноглобулинов использовали цитотоксический тест – ЦТТ (Хаитов Р.М., 1995), иммунопероксидазное окрашивание клеток – ИПО (Дергачева Т.И. и др., 2000), реакцию иммунофлуоресценции – РИФ (Новикова М.С.,1990). Для идентификации поверхностных антигенов лимфоцитов мышей использовали МкА к CD2, МкА к CD19, конъюгированные с флуорохромом (DakoCytomation) и МкА к IgM рогатого скота (лаб. иммунологии ВИЭВ). Статистическая обработка результатов исследований проводилась общепринятыми методами с использованием программы Excel для Windows. Значение критерия достоверности оценивали по таблице вероятностей Стьюдента-Фишера в зависимости от объема анализируемого материала. Вероятность различий считалась существенной при р < 0,05. ^ Одними из самых распространенных белков иммунной системы являются гликопротеины IgSF, участвующие в гуморальном и клеточном иммунном ответе. При этом гуморальные механизмы иммунной системы обеспечивают растворимые формы иммуноглобулинов, а клеточные – мембраносвязанные ILT- рецепторы иммунокомпетентных клеток. Задачей первого этапа нашей работы была разработка и оптимизация методов количественной оценки IgG, IgM, IgA и лейкоцитов с ILT–рецепторами. ^ Учитывая, что основным иммуноглобулином сыворотки крови и молозива крупного рогатого скота является IgG, для его получения использовали эти биологические жидкости. В результате гель-фильтрации γ-глобулинов сыворотки крови и молозива на Sephacryl S-300 и Sepharose 6B были получены препараты IgG с примесями. В связи с этим, для выделения иммуноглобулинов G использована ионообменная хроматография, основанная на различиях в соотношении и распределении заряженных групп на поверхности белка. Для десорбции иммуноглобулинов использовали повышение ионной силы элюирующего раствора с применением градиента концентрации NaCl от 0,1 М до 0,4 М. Осажденные γ-глобулины из сыворотки крови и молозива наносили на колонки с DEАЕ Sepharose 6B. В качестве элюирующего раствора использовали 0,02 М Tris-HCl, рН 7,2 с 0,1М, 0,15М,0,25М и 0,4М NaCl. Методом иммуноэлектрофореза установлено, что IgG элюировался в первом белковом пике при 0,1 M NaCl, IgA во втором при 0,15 M NaCl, а IgM в третьем при 0,25 M NaCl. Элюаты концентрировали в ПЭГ 40000. Степень чистоты полученных препаратов иммуноглобулинов проверяли методом электрофореза в ПААГ-ДСН.  Рис.2. Иммуноэлектрофореграмма IgG , выделенного из сыворотки крови крупного рогатого скотаОбразцы подвергали термоденатурации в присутствии 2-меркаптоэтанола, в объеме 2 мкл наносили на пластины с полиакриламидным гелем. Предварительно в образцах определяли концентрацию белка по методу Лоури. Из 2 мл γ-глобулинов крупного рогатого скота, нанесенных на колонку с DEАЕ Sepharose 6B, получали 1,0 мл IgG с содержанием белка 10-15 мг/мл. ^ Иммуноглобулины А в биологических жидкостях находятся в нескольких полимерных формах. В сыворотке крови IgA встречается как в виде мономера с молекулярной массой 160 kDa, так и в полимерной форме, в основном, как димер. Присутствие различных полимерных форм IgA и незначительная его концентрация затрудняют его выделение из сыворотки крови крупного рогатого скота. Поэтому, для получения IgA использованы носовые секреты и молозиво, концентрация IgA, в которых является максимальной. Для выделения S-IgA сыворотку молозива животных обрабатывали 0,1 М раствором сернокислого цинка и этилендиаминтетрауксусной кислотой, а затем проводили разделение глобулинов на колонке с Sephacryl S-400 (в качестве элюанта использовали 0,1 М Трис-HCl буфер рН 8,0 с 1,0 М NaCl). Для выделения S-IgA из носовых секретов крупного рогатого скота, данную биологическую жидкость в количестве 5,0-6,0 мл центрифугировали при 1000 об/мин в течение 15 мин. и диализовали против 0,02 М Тris-HCl буфера рН 8,0 два часа. Затем диализат фракционировали на колонке с Sephacryl S-300-HR. Иммунохимическую чистоту S-IgA подтверждали иммуноэлектрофоретическим анализом белковых фракций.  ^ Анализ проведенных исследований показал, что лучшим источником для выделения S-IgA являются носовые секреты, поскольку концентрация данного изотипа в них достаточно велика (2,81 мг/мл) по сравнению с IgM (0,04 мг/мл) и IgG (1,56 мг/мл) (Butler, 1986). ^ В результате проведенной работы по гибридизации клеток лимфоцитов иммунных мышей BALB/c с клетками миеломы Sp 2/0 получены гибридомы-продуценты МкА к иммуноглобулинам классов M и A крупного рогатого скота. В процессе экспериментов получено и протестировано более 10000 первичных гибридных клеточных клонов. Получен набор асцитических препаратов, с помощью иммуноблоттинга и различных серологических тестов определена иммунохимическая характеристика МкА. Проведены исследования и показана возможность использования полученных МкА для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных методами «сэндвич»-ИФА и РИД. В результате проведенных исследований установлено, что моноклональные антитела С 2, С4, G9,С11, В3 взаимодействуют только с IgM, не реагируя IgG и IgА, а МкА 4G11, 1F3, 7E7, 6B8 только с IgА. По результатам иммуноблоттинга, МкА клонов С2, С4 и G9 реагируют только с нативной молекулой IgM, что свидетельствует о конформационном характере антигенных детерминант на молекуле IgM, распознаваемыми полученными антителами. Моноклональные антитела клонов С11 и В3 взаимодействуют не только с нативной молекулой, но и с µ- цепью IgM, что свидетельствует о линейном характере эпитопов, которые распознают МкА (табл.1). Таблица 1. ^ IgM и IgА крупного рогатого скота и овец.
В результате проведенных исследований были отобраны клоны С2 и G9, продуцирующие МкА, которые взаимодействуют с нативной молекулой IgM и сохраняют титр в реакции диффузионной преципитации (1:32) после лиофилизации. Использование моноклональных антител в РИД предполагает наличие преципитирующих свойств Ig. МкА к IgM клонов С2 и G9 обладали такими свойствами, а вот МкА к IgA только при сочетании нескольких МкА различных клонов. Анализ иммунохимических свойств МкА показал, что наиболее эффективными для использования в РИД являются моноклональные антитела, распознающие антигенную детерминанту конформационного типа. Для определения минимальных концентраций IgA в биологических жидкостях крупного рогатого скота (молоко, моча) оптимизированы условия постановки "сэндвич"-ИФА с использованием МкА. Испытаны сочетания МкА, где одни из них использовали в качестве иммобилизирующих антител, а другие, конъюгированные с пероксидазой, для определения связанного антигена. В результате проведенных экспериментов подобран вариант, позволяющий идентифицировать и количественно определять уровень как мономерного сывороточного IgA, так и sIgA в различных секретах (слезы, слюна, молозиво, молоко, носовые секреты). На основе полученных МкА к IgM и IgA рогатого скота приготовлены реагенты для количественного определения уровня иммуноглобулинов классов М и А в РИД и ИФА. ^ К важнейшим рецепторам В-клеток относят поверхностные иммуноглобулины, специфичные к одному определенному антигену. Известно, что на поверхности В-лимфоцита экспрессируется мембранный IgM (sIgM), являющийся неотъемлемой частью рецепторного комплекса В-клетки для антигена. Изучение форм локализации sIg на поверхности В-клеток крупного рогатого скота, плотности распределения мембранных иммуноглобулинов лимфоцитов крови у молодых и взрослых животных является перспективным направлением исследований механизмов клеточной активации и анергии в процессах онто- и иммуногенеза. С использованием поли- и моноклональных антител к иммуноглобулинам, возможно изучение локализации sIg клетки и определение количества В-лимфоцитов. Несмотря на очевидный интерес к данной теме (Murakami K. et al ,2004, Usui T., 2006 и др.), в доступной отечественной литературе очень мало данных по исследованию поверхностных иммуноглобулинов лимфоцитов у крупного рогатого скота. Поверхность является своеобразным «паспортом» клетки, по которому можно идентифицировать тип и функции лимфоцита. Основные мембранные молекулы, участвующие в распознавании антигенов, принадлежат к IgSF. Мембранные Ig и антитела образуют своеобразную систему иммунного контроля за клеточной мембраной лимфоцитов, являясь сигнальными молекулами, с помощью которых осуществляются основные адаптивные иммунные реакции организма. Следует отметить, что многие механизмы экспрессии s-Ig лимфоцитов, влияния внешних и внутренних факторов на формирование рецепторного профиля клетки мало изучены и до сих пор неизвестны. В связи с этим следующим этапом работы был поиск адекватного метода для изучения Ig-рецепторов клетки. Известно, что иммуноглобулины в организме могут быть в мембранной (sIg), цитоплазматической (cIg) и секретируемой (Ig) формах, которые являются также и показателем уровня дифференцировки В-лимфоцитов. Для определения соотношения первых двух форм иммуноглобулинов В-клеток лимфоидных органов у интактных мышей использовали иммунопероксидазный метод. Относительное содержание Ig-клеток в костном мозге распределялось следующим образом: 22,3% - IgМ, 27,5% - IgG и 20,5% - IgА в цитоплазматической форме, что подтверждает важную роль этого органа в синтезе антител. Зафиксировано 10,3% лимфоцитов с sIgM. В тимусе обнаружено 18,2% тимоцитов с sIgM, 1,0% мононуклеарных клеток с sIgG, 2,1% лимфоцитов c сIgА. В селезенке зарегистрировано 7,5% лимфоцитов с sIgМ, 7,1% - sIgG и 6,3% - сIgА. Как вторичный лимфоидный орган селезенка является главным источником циркулирующих В-лимфоцитов. По-видимому, лимфоциты, на мембране которых выявлены IgG, являются В-клетками памяти. В лимфатических узлах наблюдалось 25,2% клеток с sIgМ и 40,5% - с IgG. Мембранный IgG распределялся в клетках лимфатических узлов следующим образом 5,0% - равномерное распределение окраски по периметру клетки, 20,3% - неравномерное распределение окраски, 5,2% - образование скопления окраски на одном из полюсов клетки и 10,0% - неравномерное распределение окраски с поглощением скоплений окраски внутрь клетки. Разнообразие форм Ig-рецепторов свидетельствует об интенсивных процессах секреции антител в лимфатических узлах. Установлено, что большинство антител лимфатических узлов относятся к IgG-изотипу. В лимфоидной ткани кишечника зафиксировано 8,3% клеток с sIgМ; 2,6% с sIgG и 3,8% с цитоплазматической формой IgА. На основе этой реакции был разработан иммуноцитохимический метод определения поверхностных иммуноглобулинов В-клеток крупного рогатого скота с использованием МкА к IgМ и поликлональные антитела к IgG, IgА крупного рогатого скота, полученные нами на первых этапах работы. На рис.4 показано, что при обработке клеток 1%-ной лимонной кислотой (ЛК), количество иммуноглобулинов на поверхности клетки значительно уменьшается (рис.4-б). Большая плотность экзогенных иммуноглобулинов (рис.4-а) на поверхности клетки, по-видимому, обусловлена способностью молекул Ig к образованию поперечных сшивок. FcγRII-рецептор В-лимфоцитов связывает только IgG и с довольно низким сродством (<107М-1). В кислой среде нековалентные взаимодействия между Fc-рецептором клетки и Fc-фрагментом антитела ослабевают, и экзогенные IgG диссоциируют с поверхности лимфоцита.   а б ^ Мембранные IgМ ориентированы Fab-областью по направлению к внешней среде, тогда как Fc-фрагмент находится в контакте с клеточной поверхностью. S-IgM содержит на С-концах тяжелых цепей домены, образованные гидрофобными аминокислотами, которые удерживают молекулу Ig на наружной поверхности мембраны. Таким образом, в иммунопероксидазной реакции с использованием моноклональных антител, полученных к молекуле IgM, определяли sIgM-клетки, а при обработке поликлональными антисыворотками – лимфоциты, несущие на своей поверхности иммуноглобулины различных изотипов. Используемые в данном исследовании антисыворотки к IgG и S-IgA крупного рогатого скота, представляют собой набор антител ко всем антигенным детерминантам Ig, в том числе, и к эпитопам легких цепей, которые у всех изотипов иммуноглобулинов являются идентичными. Поэтому при добавлении к лимфоцитам данных антител, происходит их взаимодействие со всеми изотипами Ig, находящимися на поверхности клетки. С другой стороны, моноклональные антитела к IgM крупного рогатого скота, полученные к одной антигенной детерминанте на молекуле IgM, соответственно, взаимодействуют только с ней. На фотографиях (рис.5) отчетливо видно, как располагаются sIg по периметру лимфоцита.   а б Рис.5. Иммунопероксидазное окрашивание клеток с поликлональными (а) и моноклональными (б) антителами к IgM рогатого скота Поликлональные антитела, образовавшие иммунные комплексы с поверхностными иммуноглобулинами различных изотипов, в том числе и с s-IgМ, распределяются диффузно по всей мембране клетки (рис.5-а). Моноклональные антитела взаимодействуют только с одним эпитопом IgM и, поэтому специфическое окрашивание не так интенсивно, как при использовании поликлональных антисывороток (рис.5-б). В результате проведенных исследований установлено, что количество sIgM-клеток в периферической крови телят в возрасте одного месяца составляет 16,6%, у коров в возрасте 5-7 лет – 22,8%. Уровень клеток с мембраноассоциированными молекулами IgG и IgA в крови коров находится в пределах 10,7%.-12,9% Представленные данные свидетельствуют о том, что все изотипы иммуноглобулинов (IgM, IgG, IgA) экспрессируются на поверхности клеток периферической крови крупного рогатого скота. Таким образом, в результате проведенных исследований был оптимизирован иммунопероксидазный метод для его дальнейшего использования при определении поверхностных структур лимфоцитов крупного рогатого скота. ^ после вакцинации В процессе иммунного ответа осуществляется множество межклеточных взаимодействий, среди которых наиболее важным является распознавание чужеродного антигена Т-клетками, основанное на специфичности связывания пептидов молекулами МНС, расположенными на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК). Для характеристики функционально-рецепторных свойств мембраносвязанных IgSF в процессе поствакцинального иммунного ответа определяли рецепторную активность Т-клеток и антигенпрезентирующих клеток (перитонеальные макрофаги). Т-лимфоциты дифференцировали на высокоаффинные –многорецепторные (МРОК) - и неполные – малорецепторные (мРОК). В качестве модельных антигенов использовали живые вакцины бактериальной (производственная вакцина против рожи свиней из штамма ВР-2) и вирусной (ассоциированная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита («ТМК») и ротавирусной инфекции («К») свиней - опытная серия, ВИЭВ) этиологии. Повышение адгезивной активности перитонеальных макрофагов зарегистрировано на 2-е, 10-е и 14-е сутки иммунного ответа на бактериальную вакцину и только на 3-и сутки после введения вирус-вакцины (табл.2), что обусловлено различными путями презентации эндогенных и экзогенных антигенов макрофагами. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
отлично
1
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям