Создание и изучение свойств рекомбинантных белков человека с потенциальным противоопухолевым эффектом
|
|
Скачать 246.23 Kb.
|
На правах рукописиСавватеева Людмила ВладимировнаСОЗДАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ЧЕЛОВЕКА С ПОТЕНЦИАЛЬНЫМ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ЭФФЕКТОМ Специальность 03.00.23. – биотехнологияАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2007 Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте медицинской экологии Департамента здравоохранения г. Москвы и на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова ^ член-корреспондент РАМН, доктор химических наук, профессор Северин Сергей Евгеньевич Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Кочетков Сергей Николаевич, доктор биологических наук,профессор Глухов Александр Иванович ^ Защита состоится «…….» декабря 2007 года в 15 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru. Автореферат разослан «…….» ноября 2007 года. …………………………… Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник Лютик А.И. ^ Актуальность проблемы. В настоящее время злокачественным новообразованиям принадлежит второе место среди заболеваний, приводящих к летальному исходу. Недостаточная эффективность и избирательность существующих методов лечения рака делают крайне актуальной проблему поиска новых, более действенных и высокоспецифичных методов диагностики и противоопухолевой терапии. Разработка и исследование комбинаций лекарственных средств, принадлежащих к различным классам и действующих на разные клеточные мишени, представляются перспективными в успешном лечении онкологических заболеваний. В предупреждении и элиминации развившихся опухолей большие надежды связывают с развитием иммунотерапии [Romero P. et al., 2002], которая подразумевает разработку стратегий для разрушения опухолей путем проявления противоопухолевого иммунитета. Так, успешно развивается цитокиновая терапия, специфическая иммунотерапия (вакцинация), адаптивная иммунотерапия (использование опухолеспецифических Т-клеток или моноклональных антител), используется ряд антигенных систем, широко исследуются методы стимуляции гуморального и/или клеточного иммунных ответов, тестируются различные адъюванты. Показано, что белки теплового шока (HSPs) играют важную роль в иммунном ответе, что дало основание использовать некоторые HSPs в качестве вакцин в иммунотерапии рака [Srivastava P.K., 1998]. Иммунологическое функционирование HSPs, которое получило наиболее пристальное внимание, основано на их способности перемещать антигены (в том числе опухолеспецифические) к антиген-презентирующим клеткам (АПК). Также обнаружено, что взаимодействие HSP-АПК независимо от переносимых антигенов приводит к увеличению количества костимуляторных молекул на антиген-презентирующих клетках и секреции воспалительных цитокинов, а взаимодействие HSPs с некоторыми рецепторами вызывает активацию дендритных клеток (ДК) и трансдукционных сигналов [Wallin R. et al., 2002]. Эти уникальные иммуностимулирующие свойства HSPs позволяют использовать их в качестве адъювантов для разработки иммунотерапевтических средств. Альтернативным подходом в решении указанной проблемы является поиск и изучение новых универсальных опухолевых маркеров, которые могли бы стать основой для создания чувствительных диагностических исследований и мишенью для разработки новых способов направленной противоопухолевой терапии. Предпочтением для выбора можно считать опухолеспецифические антигены, которые должны быть белками-рецепторами, избирательно или преимущественно представленными на опухолевых клетках. Известно, что эукариотические клетки путем эндоцитоза могут захватывать вместе с белковым вектором действующие агенты высокой эффективности и специфичности, в других условиях лишенные возможности проникать в клетку. Мишенью для направленного транспорта могут быть рецепторы онкофетальных белков (в частности, рецепторы альфа-фетопротеина [Moro R. et al., 1993]), а в качестве вектора могут выступать сами онкофетальные белки (например, альфа-фетопротеин или его фрагменты). Этот путь направленной доставки предполагает включение механизма рецептор-опосредованного эндоцитоза (receptor-mediated endocytosis, RME). Создание конъюгатов цитотоксических агентов и различных векторных молекул имеет большие перспективы. С помощью различных кросс-сшивающих агентов образуются ковалентные связи между молекулами белкового вектора и терапевтически активными агентами, например, цитотоксическими препаратами, применяемыми в химиотерапии. Использование механизма RME для доставки в опухолевую клетку конъюгированного цитотоксического препарата позволяет помимо задачи повышения эффективности цитотоксического действия решить проблему селективности и преодоления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Цели и задачи работы. Целью работы явилось создание и изучение потенциала в противоопухолевой терапии рекомбинантного белка теплового шока HSP70A1B человека и рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека (AFP3D). В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
Научная новизна и практическая значимость работы. Сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК E.coli, позволяющие эффективно осуществлять индуцированный биосинтез белка теплового шока человека HSP70A1B и третьего домена альфа-фетопротеина человека AFP3D в клетках соответствующих штаммов-продуцентов. Разработаны высокоэффективные методы выделения исследуемых рекомбинантных белков в препаративном количестве. Исследована биологическая активность рекомбинантного HSP70A1B, а также показана его способность к связыванию и активному эндоцитозу дендритными клетками. Продемонстрирована возможность использования рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека в качестве векторной молекулы для создания противоопухолевых препаратов направленного действия за счет сохранения в AFP3D функциональной активности полноразмерной молекулы природного альфа-фетопротеина человека. Синтезирован ковалентный конъюгат рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека с таксолом, и показана высокоспецифическая цитотоксическая активность конъюгата in vitro по отношению к клеткам злокачественной опухоли. Полученные штаммы-продуценты HSP70A1B и AFP3D человека и разработанные методы их выделения могут быть использованы в области промышленной биотехнологии, а соответствующие рекомбинантные белки – в научно-исследовательских работах с последующим потенциальным применением в области практической медицины. В целом, данная работа демонстрирует роль, которую рекомбинантные белки человека HSP70A1B и AFP3D могут сыграть в противоопухолевой терапии в качестве иммуномодулятора и вектора для направленной доставки лекарственных средств соответственно, а также подчеркивает необходимость дальнейшего совершенствования систем различного механизма действия с использованием рекомбинантных белков. Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: XXXIII Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (Greece, Rhodes, 2005); 19th Meeting of the European Association for Cancer Research (Budapest, Hungary, 2006); Российский Медицинский Форум «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006); International Scientific-Practical Interdisciplinary Workshop “New Technologies in Medicine and Experimental Biology” (Bangkok-Pattaya, Thailand, 2007). По материалам диссертации опубликовано 5 работ, оформлена 1 заявка на выдачу патента РФ на изобретение. С  труктура и объем работы. Диссертация изложена на 130 страницах; содержит 30 рисунков и 3 таблицы; состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающей 245 наименований.^
На основе известной последовательности мРНК HSP70 (GenBank NM_005346) человека с помощью компьютерной программы DNA-SUN была получена рестрикционная карта ДНК-последовательности HSP70 для определения отсутствующих и уникальных сайтов рестрикции. По результатам анализа этих данных были подобраны и синтезированы праймеры для амплификации ДНК HSP70, соответствующей подсемейству белков теплового шока HSP70A1. Тотальную РНК выделяли из лимфоцитов человека после теплового шока. Комплементарную ДНК (кДНК) гена HSPA1B человека синтезировали на мРНК с помощью обратной транскриптазы мышиного вируса лейкемии Молони (RT М-MuLV). Амплификацию кДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя две пары праймеров, в результате чего получили два перекрывающихся фрагмента ДНК HSP70A1B: N-концевой фрагмент (1068 п.о.) и C-концевой фрагмент (895 п.о.), примерно соответствующие АТP- и пептид-связывающим доменам белка [Tsai M. et al., 1994]. Фрагменты клонировали по SmaI-сайту в плазмиде pUC19 с последующим секвенированием. Полноразмерную последовательность транслируемой области гена HSPA1B получали лигированием фрагментов по сайту PstI, находящегося в области перекрывания этих фрагментов. Плазмиду pUC-HSP70А1B с нуклеотидной последовательностью, соответствующей гену HSPA1B, рестриктировали ферментами NdeI и HindIII. ДНК, соответствующую полноразмерной последовательности транслируемой области гена HSPA1B, встраивали в полилинкер коммерческого экспрессионного вектора pET-28a(+) по указанным сайтам рестрикции (рис. 1).  Данная генная конструкция позволяет при трансляции получить белок HSP70, который по аминокислотной последовательности соответствует HSP70A1В с несколькими дополнительными аминокислотами на N-конце: Met-Gly-Ser-Ser-(His)6-Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met-Gly-Ser (далее обозначаемый His-tag). Размер белка составляет 663 аминокислотных остатков или 72.33 кДa. Сайты узнавания и расщепления тромбином (выделены курсивом и подчеркиванием, соответственно) позволяют при необходимости удалить лишние аминокислоты. Введение C- и N- концевых сайтов рестрикции SalI и BamHI на уровне генной конструкции pET-hHSP70A1B (рис. 1) дает возможность создания гибридных (fusion) белков, имитирующих комплексы HSP70-антиген.
Для определения отсутствующих и уникальных сайтов рестрикции с помощью компьютерной программы DNA-SUN была получена рестрикционная карта ДНК-последовательности альфа-фетопротеина человека (AFP) на основе известной последовательности мРНК AFP человека (GenBank NM_001134). Тотальную РНК выделяли из клеток продуцирующей альфа-фетопротеин гепатоцеллюлярной карциномы человека линии HepG2. Комплементарную ДНК (кДНК) гена AFP человека синтезировали на мРНК с помощью обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц (RT AMV). Для получения рекомбинантного третьего домена AFP (AFP3D) соответствующий фрагмент гена клонировали в плазмидном векторе pET-28а(+) под контролем промотора бактериофага T7. Фрагмент ДНК, кодирующий AFP3D, получали методом ПЦР, используя в качестве матрицы кДНК альфа-фетопротеина человека. Для амплификации были использованы два олигонуклеотидных праймера: смысловой праймер 5’tttt CCA TGG GAT ACC AGG AGT TAT TG 3’, содержащий сайт узнавания рестриктазой NcoI (подчеркнут), и антисмысловой праймер 5’tttt CTC GAG AAC TCC CAA AGC AGC AC 3’, содержащий сайт XhoI (подчеркнут). Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК клонировали в вектор pET-28а(+) по рестрикционным сайтам NcoI-XhoI (рис. 2). Данная генная конструкция позволяет при трансляции получить белок AFP3D, который по аминокислотной последовательности соответствует третьему домену молекулы AFP с метионином на N-конце и Leu-Glu-(His)6 на С-конце.  1.2. Экспрессия рекомбинантных генов. Очистка белков. 1.2.1. Получение рекомбинантного HSP70A1B. П  лазмидную ДНК pET-hHSP70А1B трансфицировали в клетки E.coli BL21(DE3). Выбранный по результатам секвенирования штамм-продуцент BL21(DE3)/pET-hHSP70А1B выращивали на канамицин-содержащей среде, синтез белка индуцировали добавлением изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ). Уровень экспрессии целевого белка (~72 кДа) составлял от 40 до 50% от общего клеточного белка, что показал электрофорез в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (рис. 3). В отличие от описанных ранее систем экспрессии HSP70A1L [Jindal S. et al., 1995], где основная масса рекомбинантного белка нарабатывалась в Е.соli в виде нерастворимых телец включения, нами получен штамм, продуцирующий рекомбинантный HSP70A1B как в растворимой форме, так и в виде телец включения, причем примерно в равном соотношении (рис. 3).Клеточные осадки подвергали ультразвуковой дезинтеграции, осаждали центрифугированием и собирали супернатант (растворимая фракция белка), а из осадков получали тельца включения. Выделение белка HSP70A1B, проводимое из обеих фракций независимо, было основано на аффинной хроматографии с использованием иминодиацетат-сефарозы, активированной ионами никеля, что стало возможным благодаря введению в состав белка последовательности из шести остатков гистидина. Это значительно упрощает выделение рекомбинантного белка и предотвращает контаминацию DnaK – бактериальным аналогом эукариотического HSP70, что особенно важно при исследовании иммунологических свойств рекомбинантных HSPs человека. Белок HSP70A1B, находящийся в растворимой фракции, не требует рефолдинга, что дает возможность нарабатывать его без значительных затрат времени и в больших количествах - не менее 30 мг с литра бактериальной культуры. Выделенный белок из солюбилизированных гуанидинхлоридом телец включения восстанавливали β-меркаптоэтанолом и ренатурировали последовательным диализом против буферов E (0.1М Трис-HCl, 0.5М NaCl, 2мМ ЭДТА, рН 8.0) и F (0.05М Трис-HCl, 0.15М NaCl, рН 8.0) для удаления детергента. Выход белка составлял 10-12 мг с литра бактериальной культуры. Ч  истота выделенного белка в обоих случаях составляла не менее 90% (рис. 4).Соответствие очищенного белка семейству HSP70 подтверждено данными электрофореза в градиентном полиакриламидном геле (5-20%) и иммуноблота с использованием моноклональных антител к HSP70 человека (рис. 5). Рекомбинантный HSP70A1B подвергали ферментативному протеолизу тромбином для удаления His-tag (см. п. 1.1.1.) с получением белка HSP70A1В* молекулярной массы 70.45 кДа.  Подавляющая часть сведений, касающихся свойств белков теплового шока в качестве противоопухолевых вакцин, получена в экспериментах с использованием природных HSPs [Srivastava P.K. et al., 1997]. Такие методики включают в себя накопление и гомогенизацию ткани, экстракцию целевого белка, а также фракционирование препарата с помощью нескольких хроматографических стадий. Основными недостатками получения HSPs из природных источников являются необходимость накопления опухолевых тканей, трудоемкость процесса выделения, малый конечный выход и не всегда достаточная степень чистоты и гомогенности полученных препаратов. Функции индивидуальных белков различных семейств HSPs до сих пор мало изучены, а исследование и их практическое использование требует препаративного количества высокоочищенных белков (или отдельных доменов). В связи с этим, представляется перспективным использование созданного нами высокоэффективного штамма E.coli BL21(DE3)/pET-hHSP70A1B для получения по упрощенной технологии и с высоким выходом рекомбинантного HSP70A1B человека. 1.2.2. Получение рекомбинантного AFP3D. Для создания штамма-продуцента третьего домена альфа-фетопротеина человека рекомбинантной плазмидой pAFP28D3 были трансформированы компетентные клетки E.coli BL21(DE3), имеющие хромосомную копию гена Т7 РНК-полимеразы под контролем промотора lac UV5, индуцируемого изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом (ИПТГ). Синтез рекомбинантного белка тестировали методом электрофореза в присутствии SDS. Целевой белок (~27 кДа) накапливался в клетках в виде телец включения с высоким выходом (рис. 6).  Выделенные тельца включения растворяли в буфере, содержащем 6М гуанидинхлорид, и подвергали очистке методом аффинной хроматографии на иминодиацетат-сефарозе, активированной ионами никеля. Связавшийся белок элюировали буфером, содержащем 0.3М имидазол и рефолдировали последовательным диализом относительно буферов E (0.1М Трис-HCl, 0.5М NaCl, 2мМ ЭДТА, рН 8.0) и F (0.01М Трис-HCl, 0.15М NaCl, рН 8.0). Диализованный белок концентрировали на ячейке Amicon, фракционировали на колонке SuperdexTM 200, элюируя буфером F. Было выделено две фракции: фракция I соответствует димеру, фракция II – мономеру AFP3D (рис. 7). Как видно из хроматограммы, эффективность получения мономера II достигает 40% от суммарного белка.  Д  ля оценки гомогенности очищенных фракций белка проводили электрофорез в 13% полиакриламидном геле в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях; чистота мономера составляла не менее 98% (рис. 8).Следует отметить, что определяемая на электрофорезе полоса целевого мономера соответствует ~24 кДа, что не отвечает расчетной молекулярной массе - 27 кДа. Реальная масса AFP3D была определена масс-спектрометрически (MALDI-TOF). Оказалось, что около 70% белка имеет массу 27.058 кДа, а остальная часть - 27.200 кДа (рис. 9). Разница, составляющая около 150 Да, соответствует молекулярной массе N-концевого метионина, отщепляющегося в процессе клеточного биосинтеза. Конечный выход высокоочищенной мономерной формы AFP3D составил 5 мг с литра бактериальной культуры.   Выделение и очистка природного альфа-фетопротеина – весьма трудоемкий и дорогостоящий процесс, который требует использования моноклональных антител и значительное количество исходного материала. Получение рекомбинантного альфа-фетопротеина связано со значительными трудностями ввиду его высокой молекулярной массы и наличия углеводных компонентов и внутримолекулярных дисульфидных связей. В значительной мере избежать этих затруднений позволяет использование генно-инженерных конструкций, обеспечивающих продукцию не целого белка, а его биологически активных фрагментов. В данной работе нами разработан технологический метод получения рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека, способного заменить использование как природного, так и рекомбинантного полноразмерного альфа-фетопротеина в качестве вектора для направленной доставки цитотоксических препаратов. 2. Определение активности рекомбинантных белков. 2.1. Исследование функциональной активности HSP70A1B. Известно, что белки теплового шока в качестве шаперонов обеспечивают стабилизацию нативной конформации различных клеточных белков, их внутриклеточную транслокацию в различные компартменты клетки, используя активный ATP-зависимый конформационный процесс [Hartl F.U. et al., 1996]. Колориметрическим методом определили, что 1 мг рекомбинантного HSP70A1B человека (как выделенного из растворимой фракции, так и рефолдированного) гидролизует 2-4 нмоль ATP/мин при 30ºС, что указывает на биологическую активность целевого продукта. Также показано, что более 60% HSP70A1B (равно как и HSP70A1B*, не содержащий His-tag) связывается с ADP-агарозой, т.е. имеет нативную конформацию ATP-связывающего домена. Помимо шаперонных функций HSP70 может принимать участие в развитии противоопухолевого иммунитета, обусловленного взаимодействием антигенпредставляющих клеток (АПК) с HSP70 путем рецептор-опосредованного эндоцитоза через рецепторы CD91, CD40, LOX и некоторые другие [Arnold-Schild D. et al, 1999]. После интернализации связанные с HSP70 экзогенные белки и пептиды (в том числе опухолеспецифические) высвобождаются из эндосом в цитоплазму, подвергаются процессингу и образуют комплексы с молекулами МНС I, обеспечивая тем самым возможность индукции специфического клеточного иммунного ответа. Для исследования способности рекомбинантного HSP70A1B к связыванию и эндоцитозу в качестве АПК были выбраны незрелые дендритные клетки, а в качестве метода детекции - проточная цитофлуориметрия. Препараты рекомбинантных HSP70A1B и HSP70A1B*, предварительно меченные флуресцеинизотиоцианатом (FITC), инкубировали с дендритными клетками при двух температурных режимах: +4ºС в присутствии азида натрия и +37ºС. Известно, что при +4ºС мембранные рецепторы взаимодействуют со своими лигандами, однако интернализация образующихся комплексов наблюдается только при +37ºС. К  ак видно по уровню флуоресценции клеток (рис. 10), происходит не только связывание HSP70A1B и HSP70A1B* со специфическими рецепторами, представленными на используемых дендритных клетках, но и очень активный процесс интернализации (эндоцитоз) белковых препаратов. При этом, судя по сопоставимым средним значениям интенсивности флуоресценции (MFI), не были выявлены существенные различия между HSP70A1B и HSP70A1B*, что подтверждает предположение об отсутствии влияния His-tag не только на конформацию ATP-связывающего домена полученного нами рекомбинантного белка, но и на его способность к связыванию и эндоцитозу АПК.Таким образом, представленные результаты о способности полученного нами рекомбинантного HSP70A1B человека гидролизовать ATP, связываться с рецепторами и проникать в антигенпрезентирующие клетки путем эффективного эндоцитоза, являются качественной характеристикой белка для потенциального проявления противоопухолевого иммунитета. 2.2. Исследование функциональной активности AFP3D. 2.2.1. Связывание и захват FITC-меченного AFP3D опухолевыми клетками и лимфоцитами. Н  а данном этапе мы исследовали способность полученного нами рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина к связыванию со специфическим рецептором AFP на поверхности опухолевых клеток человека и последующему рецептор-опосредуемому эндоцитозу. Для исследования связывания клетки инкубировали с флуоресцентно-меченным AFP3D (AFP3D-FITC) при +4°С в течение часа, отмывали, фиксировали и измеряли флуоресценцию клеток на проточном цитофлуориметре. Было показано, что AFP3D-FITC связывается с опухолевыми клетками (карциномами яичника линии SKOV3 и молочной железы линии MCF-7) и практически не связывается с нестимулированными лимфоцитами периферической крови (рис. 11).Эксперименты по связыванию FITC-меченого AFP3D с клетками в присутствии природного альфа-фетопротеина человека подтвердили специфичность связывания AFP3D с рецептором AFP. Интенсивность флуоресценции клеток, обработанных AFP3D-FITC (до концентрации 1 мкM) была близка к флуоресценции клеток, обработанных AFP-FITC (рис. 12а). Для исследования специфичности связывания, клетки SKOV3 инкубировали с AFP3D-FITC в присутствии 30-кратного избытка AFP человека в течение часа при +4°C. Инкубация SKOV3 в этих условиях приводила к значительному снижению связывания AFP3D-FITC с опухолевыми клетками (рис. 12б). Из рисунка видно, что природный AFP в значительной степени ингибировал связывание AFP3D-FITC с клетками. Эти данные подтверждают, что AFP3D действительно связывается с рецептором AFP на опухолевых клетках и к  онкурирует с AFP за сайт связывания.И  сследование захвата AFP3D-FITC опухолевыми клетками и лимфоцитами периферичекой крови человека показало, что опухолевые линии MCF-7 и SKOV3 активно эндоцитируют AFP3D-FITC (рис. 13), причем особенно высоким захват был в клетках аденокарциномы яичника SKOV3. В лимфоцитах эндоцитоз AFP3D-FITC практически отсутствовал. Эти данные хорошо коррелируют с полученными ранее результами по связыванию и эндоцитозу природного полноразмерного альфа-фетопротеина человека опухолевыми клетками линий MCF-7, SKOV3 и лимфоцитами [Ницветов М.Б. и др., 2001].И  сследование препаратов клеток SKOV3 через 24 часа после инкубации с AFP3D-FITC с помощью флуоресцентной микроскопии подтвердило, что клетки активно захватывают AFP3D-FITC (рис. 14).Интересно, что в отличие от AFP-FITC, флуоресценция наблюдалась не только в цитоплазматических компартментах (эндосомах, мульти-везикулярных тельцах, комплексе Гольджи), окружающих ядро [Alava M.A. et al., 1999], но и в клеточных ядрах. По-видимому, это связано с тем, что в рекомбинатном третьем домене экспонируется на поверхность один (или более) из так называемых сигналов ядерной локализации, который маскируется в молекуле AFP вторым и первым доменами. Способность AFP3D селективно связываться, эффективно эндоцитировать в опухолевые клетки и конкурировать с молекулами природного альфа-фетопротеина за рецептор указывает на то, что структура рецептор-связывающего участка полученного нами рекомбинантного домена белка не претерпела существенных изменений. 2.2.2. Ингибирование эстрадиол-зависимой пролиферации клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 in vitro. О  дним из параметров биологической активности альфа-фетопротеина является его способность ингибировать эстрадиол-индуцированный рост гормон-зависимых опухолевых клеток как in vivo, так и in vitro [Bennett J.A. et al.,1997]. Мы исследовали влияние AFP3D на Е2-активированную пролиферацию клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7 in vitro. Для этого клетки MCF-7 инкубировали до достижения монослоя в среде DMEM без фенолового красного, содержащей 5% бычью сыворотку новорожденных (NBS, CE2<3 пг/мл). Для стимуляции пролиферации к клеткам добавляли E2 в концентрации 10-9 M. В этих условиях через 72 часа стимуляция пролиферации клеток, оцениваемая по включению [3H]-тимидина в ДНК, составляла в среднем 165% от контроля. При одновременном с E2 добавлении к клеткам AFP или AFP3D в диапазоне концентраций 10-11-10-6 M включение [3H]-тимидина значительно снижалось (117±5.85% для AFP и 120±4.8% для AFP3D) (рис. 15). Ингибирование проявлялось при низких концентрациях белков; при повышении концентрации до 10-8 M эффект исчезал.2.2.3. Исследование цитотоксической активности конъюгата AFP3D-Таксол. Исследование биологической активности полученного нами рекомбинантного третьего домена AFP подтвердило, что AFP3D обладает такими важными свойствами полноразмерного AFP, как способность связываться со специфическим рецептором AFP и ингибировать пролиферацию эстроген-зависимых клеток in vitro. Ранее было показано, что конъюгаты AFP человека c доксорубицином [Severin S.E. et al., 1996], и некоторыми другими противоопухолевыми лекарствами [Severin S.E. et al., 1997] эффективно подавляют рост опухолевых клеток как in vitro, так и in vivo. Однако широкое применение AFP в качестве универсального белка-транспортера лекарственных соединений в раковые клетки ограничено тем, что выделение в достаточных для производства лекарственных препаратов количествах AFP сопряжено с технологическими трудностями. С целью изучения возможности использования рекомбинантного биологически активного AFP3D в качестве вектора для направленного транспорта химиопрепаратов нами был синтезирован конъюгат AFP3D с таксолом - цитотоксическим агентом, широко применяющимся в медицинской практике при лечении больных раком молочной железы, яичников, немелкоклеточным раком легкого. Таксол (международное название – паклитаксел; химическая формула показана на рис. 16) – самый изученный представитель таксанов, фармакологическое действие которых заключается в стимуляции полимеризации клеточного белка тубулина и в образовании чрезмерного количества дефектных микротрубочек. Следствием нарушения функции микротрубочкового аппарата опухолевой клетки является блокирование процесса ее деления, а также повреждение цитоскелета, приводящее к нарушению подвижности, внутриклеточного транспорта и передачи трансмембранных сигналов. В связи с этим, представляется перспективным использование рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина в качестве вектора, конъюгированного с таксолом, для направленной доставки цитотоксического препарата непосредственно в клетки опухоли.  Конъюгат AFP3D с таксолом был получен с использованием ангидрида глутаровой кислоты для модификации таксола. Схема получения конъюгата приведена на рис. 16. Из литературных данных известно, что реакция таксола с ангидридами янтарной или глутаровой кислот при комнатной температуре в растворе пиридина дает С2'-монопроизводное таксола, т.к. именно гидроксильная группа при С2'-положении является наиболее реакционноспособной по сравнению с другими группами молекулы таксола [Deutsch H.M. et al., 1989]. Показано также, что модификация С2'-положения молекулы не влияет на цитотоксичность таксола [Lataste H. et al., 1984]. Таким образом, для осуществления синтеза не требуется предварительного введения защитных групп и специфических условий проведения реакции, что значительно упрощает и удешевляет технологию получения исследуемого конъюгата. Соотношение компонентов в конечном продукте оценивали на основе результатов фотометрического определения белка с использованием медного комплекса бицинхониновой кислоты [Wiechelman K.J. et al., 1988] и определения количества таксола с помощью ВЭЖХ. Молярное соотношение AFP3D:Таксол составило 1:1.5, т.е. конъюгат содержал 1-2 молекулы таксола, ковалентно связанных с одной молекулой рекомбинантного белка. Полученный конъюгат исследовали на наличие специфической цитотоксической активности (ЦТА) in vitro на культуре клеток карциномы молочной железы линии MCF-7. Конъюгат AFP3D-Таксол проявлял дозозависимую ЦТА в отношении указанной линии опухолевых клеток, при этом ЦТА исследуемого конъюгата была сравнима с активностью конъюгата AFP-Таксол (рис. 17). Конъюгаты AFP3D-Таксол и AFP-Таксол оказались не токсичнее свободного таксола (рис. 17), что, по-видимому, связано с тем, что эффективность реализации их цитотоксического действия in vitro в значительной мере определяется количеством рецепторов векторного белка на поверхности опухолевых клеток, различиями в сродстве вектора к его рецептору, а также скоростью рецептор-опосредованного эндоцитоза.  Следует учитывать, что in vivo противоопухолевые лекарственные соединения (в частности, таксол) легко проникают не только в опухолевые, но и во все типы нормальных клеток, что является причиной возникновения широкого спектра побочных эффектов. В противоположность этому, конъюгаты AFP-Таксол и AFP3D-Таксол будут проникать, главным образом, в опухолевые клетки, гиперэкспрессирующие рецептор альфа-фетопротеина, поэтому их цитотоксическое действие на нормальные клетки будет минимальным. Поэтому, несмотря на большие значения ЦТА конъюгатов по сравнению с ЦТА свободного таксола in vitro, преимущество конъюгатов при их терапевтическом применении in vivo представляется очевидным. Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что полученный нами рекомбинантный третий домен альфа-фетопротеина AFP3D обладает высоким векторным потенциалом (очень близким к потенциалу полноразмерной молекулы природного AFP) для доставки цитотоксических химиопрепаратов в клетки злокачественных опухолей. При этом нормальные клетки поражаются подобными препаратами в значительно меньшей степени, что дает возможность практического использования уникальных свойств AFP3D для создания новых эффективных препаратов для лечения злокачественных новообразований. ВЫВОДЫ
^
В руководстве работой и подготовке ее к защите принимал участие зав. кафедрой биотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова, академик РАМН, д.х.н., профессор Швец В.И. Активное участие в работе и руководстве диссертацией осуществляла к.б.н. Гороховец Н.В. Данная часть работы проводилась при участии в.н.с. Московского НИИ медицинской экологии, к.б.н. Г.А. Посыпановой. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям