Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Томск – 2011

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

^ Научные консультанты:
доктор медицинских наук, профессор	Рязанцева Наталья Владимировна
доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ	^ Новицкий Вячеслав Викторович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор,	^ Агафонов Владимир Иванович
доктор медицинских наук, профессор,	Салмина Алла Борисовна
доктор медицинских наук	^ Потапов Алексей Валерьевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук (г. Москва)

Защита состоится «_____» _________ 2012 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.096.01 Сибирского государственного медицинского университета (634050, г. Томск, Московский тракт, д. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан «___»___________ 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета И.В. Петрова

^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Цитокины представляют собой биологически активные пептиды, оказывающие плейотропные эффекты на различные типы клеток, главным образом, участвуя в поддержании тканевого гомеостаза путем формирования и регуляции защитных реакций организма [Ярилин А.А., 1997; Кадагидзе З.Г., 2003; Ben-Sasson S.Z. et al., 2009]. В условиях формирования иммунного ответа они осуществляют взаимосвязь между неспецифическим и специфическим иммунитетом. Одним из важнейших событий в специфическом иммунном ответе является дифференцировка и поддержание баланса между Т-хелперами I и II типов [Moreau J.F. et al., 2000; Симбирцев А.С., 2004; Paul W.E., Zhu J., 2010]. Известно, что активация Th1-лимфоцитов, сопряженная с продукцией таких ключевых цитокинов как IFNγ и IL-2, усиливает Т-клеточный иммунитет. В то время как Th2-лимфоциты, синтезируя IL-4 и IL-10, обеспечивают дифференцировку В-клеток, стимулируя тем самым гуморальное звено иммунного ответа [Петров Р.В., Хаитов Р.М., 2001; Fantini M.C. et al., 2007; Kushibiki S., 2011; Mueller L. et al., 2011].

Согласно современным представлениям, одним из ведущих аспектов патогенеза ряда заболеваний является обусловленная дисбалансом ключевых цитокинов поляризация иммунного ответа по Th1- или Th2-пути [Кетлинский С.А., 2002; Sanarico N. et al., 2006; Bosque A. et al., 2007, 2008]. Чрезмерная активация Th1-лимфоцитов, сопряженная с усилением клеточного иммунитета, приводит к нарушению элиминации аутореактивных клонов лимфоцитов и развитию аутоиммунных процессов [Кетлинский С.А., 2002; Fanzo J.C. et al., 2006]. Детерминация иммунного ответа по Th2-пути приводит к угнетению Т-клеточного звена и ускользанию патологически измененных клеток от уничтожения, обеспечивая тем самым формирование и поддержание таких патологических состояний как опухолевый рост и хронические инфекции [Букринская А.Г., Жданов В.М., 1991; Железникова Г.Ф., 2006; Dominguez-Villar M. et al., 2008; Jerome K.R., 2008].

Одной из основных причин нарушения существующего в норме баланса Th1- и Th2-лимфоцитов может являться нарушение реализации программы гибели иммунных клеток [Hedrick S.M. et al., 2010; Hernandez J.B. et al., 2010]. Цитокины считаются наиболее многочисленной группой биологически активных веществ, влияние которых на процесс пролиферации, дифференцировки и гибели клетки интенсивно изучается и считается доказанным. Выявлена большая группа цитокинов (IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IFN-α, факторы роста), при действии которых запускается эндогенная программа защиты клеток от апоптоза, опосредованная через протеины Bcl-2, Bcl-x_L и др. [Белушкина Н.Н., 2000; Потапнев М.П., 2002; Michalek R.D., Rathmell J.C., 2010]. Ряд других цитокинов (IFN-γ, TNF, IL-1, IL-10), напротив, обладает способностью индуцировать апоптоз [Фильченков А.А., Стойка Р.С., 1995; Bosque A. et al., 2007; Sharma V. et al., 2008]. Эффект некоторых цитокинов (например, IFN-γ, IL-10) может быть разнонаправленным и зависеть как от типа клеток, так и от их функционального состояния [Dardalhon V. et al., 2008; Wilke C.M. et al., 2011]. Однако механизмы выбора клетки между жизнью и смертью до сих пор не ясны.

Среди множества факторов, опосредующих эффекты цитокинов, выделяют редокс-состояние клетки-мишени, которое определяется, главным образом, интенсивностью внутриклеточной продукции АФК, а также участием некоторых митохондриальных факторов. АФК выполняют функцию вторичных посредников при реализации лиганд-рецепторных взаимодействий гормонов, цитокинов, факторов роста и их рецепторов [Скулачев В.П., 2001; Tansey M.G., Szymkowski D.E., 2009]. Кроме того, они изменяют экспрессию ряда генов, в том числе и факторов транскрипции, участвующих в регуляции клеточного цикла, дифференцировки и программированной гибели клетки, таких как NF-kB и р53 [Рыжов С.В., 2007; Rivas M.A., 2008; Boyd M.T., et al. 2011].

Митохондриям принадлежит одна из ведущих ролей в развитии и регуляции апоптоза клеток. Установлено, что изменения митохондрий, такие как уменьшение трансмембранной разности потенциалов, высвобождение некоторых митохондриальных белков, разрушение электрон-транспортной цепи и торможение синтеза АТФ, определяют некоторые аспекты клеточной гибели [Бра М. и соавт., 2005; Jeong S.Y., 2008]. Большую роль в регуляции митохондрий-зависимого апоптоза играют белки семейства Bcl-2, обеспечивающие контроль за выходом митохондриальных факторов. Данные белки находятся в постоянном динамическом равновесии, поэтому считается, что соотношение активных форм этих белков определяет «реостат» жизни или смерти клетки [Мураков С.В., 2006; Belizario J.E. et al., 2007; Skommer J. et al., 2010].

Таким образом, цитокины в качестве сигнальных веществ регулируют активацию апоптотического каскада. Цитокины не оказывают строго специфичного действия на клетку. Вся система данных регуляторных факторов организована по принципу неустойчивого равновесия, что обусловливает высокую чувствительность клеточных элементов к факторам межклеточной сигнализации и обеспечивает интегральный клеточный ответ. Поэтому выраженный дисбаланс регуляторных цитокинов является причиной развития многих патологических процессов, таких как опухоли, хронические инфекции и аутоиммунные расстройства. В связи с этим изучение молекулярных механизмов нарушения цитокиновой регуляции программы гибели иммунокомпетентных клеток позволит расширить представления о патогенезе заболеваний, сопряженных с дисбалансом Th1- и Th2-цитокинов, создав тем самым основу для разработки новых подходов для коррекции многих патологических состояний.

^ Цель исследования: установить роль цитокинов (TNFα, IL-2 и IL-4) в молекулярных механизмах нарушения регуляции апоптоза лимфоцитов крови.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

Установить закономерности нарушения реализации программированной гибели лимфоцитов крови в условиях воздействия in vitro рекомбинантных форм TNFα, IL-2 и IL-4 человека в зависимости от концентрации указанных цитокинов и условий клеточного культивирования (полная/бессывороточная среда, добавление в среду индуктора апоптоза – дексаметазона).
Оценить роль митохондриального пути в регуляции апоптоза лимфоцитов крови, индуцированного in vitro рекомбинантными TNFα, IL-2 и IL-4.
Выявить закономерности изменения баланса проапоптотических (Bax, Bad) и антиапоптотических (Bcl-2, Bcl-x_L) белков-регуляторов апоптоза в лимфоцитах крови при действии in vitro рекомбинантных форм TNFα, IL-2 и IL-4.
Оценить роль факторов транскрипции NF-kB, р53 и pRb и ингибитора циклинзависимых киназ p21^WAF^1/^CIP¹ в регуляции апоптоза лимфоцитов крови при действии рекомбинантных форм TNFα, IL-2 и IL-4 in vitro.
Установить молекулярные механизмы нарушения регуляции апоптоза лимфоцитов крови при остром клещевом энцефалите и длительной антигенемии вируса клещевого энцефалита, сопровождающихся дисбалансом Th1- и Th2-цитокинов.
Дать сравнительную оценку молекулярных механизмов цитокин-опосредованного нарушения регуляции апоптоза лимфоцитов крови в условиях in vitro и при клещевом энцефалите, сопровождающемся дисбалансом Th1- и Th2-цитокинов.

^ Научная новизна. Впервые установлены цитокин-опосредованные механизмы дизрегуляции апоптоза лимфоцитов крови. Показано, что влияние рекомбинантных TNFα, IL-2 и IL-4 человека in vitro на программированную гибель лимфоцитов определяется условиями культивирования клеток. Так, рекомбинантный TNFα оказывает проапоптотическое действие на лимфоциты крови в полной культуральной среде, в то время как рекомбинантные формы IL-2 и IL-4 индуцируют апоптоз лимфоцитарных клеток в бессывороточной инкубационной среде. Установлено, что для рекомбинантных IL-2 и IL-4 человека характерна двойственность эффектов в отношении апоптоза лимфоцитов крови: указанные цитокины на фоне действия индуктора апоптоза дексаметазона оказывают антиапоптотический эффект. Впервые показано, что про- и антиапоптотические эффекты указанных цитокинов в отношении лимфоцитов крови носят дозозависимый характер.

Получены новые знания о роли митохондрий, активных форм кислорода, транскрипционных факторов NF-kB, р53, pRb, ингибитора циклинзависимых киназ p21^WAF^1/^CIP¹, а также о характере изменения баланса протеинов семейства Bcl-2 при реализации апоптоза иммунокомпетентных клеток, индуцированного TNFα, IL-2 и IL-4.

Впервые на модели клещевого энцефалита показана роль нарушения регуляции программированной гибели лимфоцитарных клеток в иммунопатогенезе заболеваний, сопровождающихся дисбалансом Th1- и Th2-цитокинов. Получены новые данные об участии митохондрий и активных форм кислорода в реализации апоптоза лимфоцитов крови при инфекции, вызванной вирусом клещевого энцефалита, на фоне дисбаланса Th1- (IL-2, IL-12) и Th2-цитокинов (IL-4, IL-10). Впервые показано, что молекулярные механизмы нарушения реализации апоптоза лимфоцитов крови при клещевом энцефалите, характеризующегося дисбалансом Th1- и Th2-цитокинов, сопряжены с активацией транскрипционных факторов NF-kB и р53, а также с нарушением соотношения про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2.

Впервые установлено, что дизрегуляция апоптоза лимфоцитов крови как при действии рекомбинантных TNFα, IL-2 и IL-4 in vitro в проапоптотической дозе, так и при клещевом энцефалите, сопровождающемся нарушениями в системе Th1- и Th2-цитокинов, обусловлена запуском митохондриального и p53-опосредованного путей реализации танатогенной программы.

^ Теоретическая и практическая значимость. Полученные в ходе проведенного исследования фактические данные носят фундаментальный характер и раскрывают молекулярные механизмы регуляции апоптоза лимфоцитов крови в условиях дисбаланса цитокинов TNFα, IL-2 и IL-4. Установлено, что влияние цитокинов на реализацию программированной гибели лимфоцитов крови зависит от условий культивирования клеток и носит дозозависимый характер. Установлена роль транскрипционных факторов NF-kB, p53 и pRb, ингибитора циклинзависимых киназ p21^WAF^1/^CIP¹ и белков семейства Bcl-2 в цитокин-опосредованной регуляции программированной гибели лимфоцитов в условиях in vitro с применением рекомбинантных форм TNFα, IL-2 и IL-4. Показана роль данных участников внутриклеточного сигналинга в дизрегуляции апоптоза иммунокомпетентных клеток при остром клещевом энцефалите и длительной антигенемии вируса клещевого энцефалита, сопровождающихся дисбалансом Th1- и Th2-цитокинов. Результаты настоящего исследования в дальнейшем могут способствовать раскрытию механизмов побочных эффектов цитокиновой и анти-цитокиновой терапии, а также послужить основой для разработки новых технологий коррекции нарушений программы клеточной гибели при заболеваниях, характеризующихся изменениями продукции данных цитокинов.

^ Положения, выносимые на защиту:

Влияние рекомбинантных TNFα, IL-2 и IL-4 человека in vitro на программированную гибель лимфоцитов определяется условиями культивирования клеток и носит дозозависимый характер. Для рекомбинантных IL-2 и IL-4 человека характерна двойственность эффектов в отношении апоптоза лимфоцитов крови.
Механизмы регуляторного влияния рекомбинантных форм TNFα, IL-2 и IL-4 на апоптоз лимфоцитов крови сопряжены со снижением трансмембранного потенциала митохондрий, изменением внутриклеточной продукции активных форм кислорода, баланса про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2.
Апоптотическая гибель лимфоцитов крови при действии рекомбинантных TNFα, IL-2 и IL-4 реализуется с участием транскрипционных факторов NF-kB, р53 и pRb, а также ингибитора циклинзависимых киназ p21^WAF^1/^CIP¹.
Механизмы нарушения апоптоза лимфоцитов крови при клещевом энцефалите, сопровождающемся дисбалансом Th1- и Th2-цитокинов, и при действии in vitro рекомбинантных форм TNFα, IL-2 и IL-4 в апоптогенной концентрации сопряжены с инициацией митохондриального и p53-зависимого путей реализации программированной клеточной гибели.

^ Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на VIII Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007), Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2007), Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы клещевых нейроинфекций» (Кемерово, 2008), ХIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2008), VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), Х Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2009), IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009), Х Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009), 6-ом Международном Конгрессе патофизиологов «Gene-environment interaction in health and disease» (Монреаль, Канада, 2010).

Исследования выполнены в рамках проекта РФФИ «Разработка способов направленной коррекции дизрегуляции пролиферации и апоптоза нормальных и патологически измененных клеток с помощью регуляторных молекул» (09-04-99025-р_офи); гранта Совета при Президенте РФ «Молекулярные механизмы цитокин-опосредованной дизрегуляции апоптоза лимфоцитов при поляризации иммунного ответа по Th1- или Th2-пути» (государственный контракт № 02.120.11.3842-МД от 24.09.2009 г.); а также в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» по теме: «Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем с участием научных организаций Японии» (государственный контракт № 02.512.11.2285 от 10.03.2009 г.); ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме: «Разработка технологической платформы молекулярной диагностики и лечения социально значимых заболеваний и подготовка на ее основе научно-исследовательских кадров для молекулярной медицины» (государственный контракт № 02.740.11.0311 от 07.07.2009 г.), «Разработка и внедрение методов долгосрочного прогноза научно-технологического развития в области молекулярной медицины для аналитического обеспечения реализации государственной политики в сфере инновационного развития экономики» (государственный контракт № 16.740.11.0360 от 03.12.2010 г.), «Роль внутриклеточных газовых трансмиттеров в регуляции гомеостаза клетки» (государственный контракт № П1311 от 09.06.2010 г.), «Селективная модуляция внутриклеточной коммуникации как основа молекулярных технологий управления функциями клеток» (государственный контракт № 14.740.11.0932 от 29.04.2011 г.), «Разработка технологических основ управления дифференцировкой, межклеточной кооперацией и программированной гибелью Th-лимфоцитов с использованием рекомбинантных галектинов» (государственный контракт № 16.740.11.0636 от 02.06.2011 г.).

Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедр патофизиологии (разделы «Роль иммунной системы в патологии», «Патофизиология клетки»), фундаментальных основ клинической медицины (разделы «Современные проблемы медико-биологической науки», «Молекулярные основы патологии»), морфологии и общей патологии (разделы «Функциональная морфология элементов белой крови. Гуморальный и клеточный иммунитет», «Старение и смерть клетки. Стадии гибели клетки. Некроз и апоптоз») ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 37 работ, из них 16 – в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

^ Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 246 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы, включающего 423 источника, из которых 71 отечественный и 252 иностранных. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 42 рисунками.

^ Личный вклад автора. Анализ данных литературы по теме диссертации, планирование исследования, определение цели, задач, выбор методов исследования, проведение экспериментального и клинического блоков настоящей работы, статистический анализ результатов и написание диссертации выполнены лично автором.

^ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО И КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для достижения поставленной цели в диссертационной работе были выделены два блока исследования: экспериментальный и клинический. Экспериментальный блок включал в себя изучение про- и антиапоптотических эффектов TNFα, IL-2 и IL-4 путем воздействия их рекомбинантными формами in vitro на лимфоциты, полученные у здоровых доноров. В качестве клинической модели для исследования особенностей реализации апоптоза лимфоцитов в условиях различной продукции эндогенных TNFα, IL-2 и IL-4 были выбраны острая форма клещевого энцефалита и хроническая антигенемия вируса клещевого энцефалита.

В основу экспериментальной части работы положены результаты исследования лимфоцитов, полученных у 61 здорового донора (21 мужчина и 40 женщин, средний возраст − 24 года). В основу клинического блока положены данные комплексного обследования 134 человек (60 мужчин и 74 женщины, средний возраст − 32 года): 61 здорового донора и 73 пациентов с клещевым энцефалитом. Критериями исключения из исследования явились: возраст менее 18 или более 55 лет, наличие в анамнезе фактов злоупотребления алкоголем, наркотической зависимости, психических расстройств; обострение хронических соматических заболеваний, наличие инфекционных болезней другой этиологии. Обследование проводилось до назначения специфической противовирусной, иммунокоррегирующей, а также иной фармакотерапии.

Обследованные пациенты находились на диспансерном учете или стационарном лечении в терапевтическом отделении МЛПУ МСЧ «Строитель» (главный врач − И.Н. Бартфельд), инфекционном отделении госпитальных клиник ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (главный врач – Заслуженный врач РФ, канд. мед. наук В.М. Шевелёв) и инфекционном отделении МЛПУ «Городская больница №3» (главный врач − М.А. Лукашов). Клинические группы были сформированы при непосредственном участии профессора кафедры неврологии и нейрохирургии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, д-ра мед. наук Н.Г. Жуковой.

У всех обследованных лиц было получено добровольное информированное согласие на проведение необходимых для исследования манипуляций (протокол заседания этического комитета СибГМУ от 22.01.2007 г., регистрационный № 558).

Материалом для исследования служила венозная кровь, взятая утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл и стабилизированная гепарином (25 Ед/мл).

Исследование проводилось на базе Научно-образовательного центра молекулярной медицины ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (научный руководитель – д-р мед. наук, профессор Н.В. Рязанцева) и лаборатории клинической иммунологии ФГУЗ КБ № 81 ЗАТО Северск (зав. лабораторией – д-р мед. наук Т.Т. Радзивил).

На первом этапе в условиях культивирования лимфоцитов in vitro с рекомбинантными TNFα, IL-2 и IL-4 была идентифицирована заинтересованность в реализации цитокинопосредованной апоптотической гибели митохондрий, активных форм кислорода, транскрипционных факторов, белков семейства Bcl-2.

На втором этапе была проведена оценка молекулярных механизмов дизрегуляции апоптоза на модели клещевого энцефалита, сопровождавшегося изменением продукции вышеуказанных цитокинов. Дизайн исследования представлен на рисунке 1.

Лимфоциты выделяли в стерильных условиях из цельной венозной крови методом градиентного центрифугирования [Натвиг Дж. и соавт., 1980]. Венозную гепаринизированную кровь (25 ЕД/мл) выдерживали при 37°С в течение 40-60 мин для отделения плазмы и эритроцитов. Полученную плазму наслаивали на градиент плотности Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) (ρ=1,077 г/см³) в соотношении 2:1 и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 20 мин.

Рис. 1. Дизайн исследования

Образовавшееся на границе раздела фаз кольцо из смеси мононуклеарных клеток собирали в стерильную центрифужную пробирку, дважды отмывали средой RPMI-1640 («Вектор-Бест», Новосибирск), последовательно ресуспендируя и центрифугируя каждый раз по 10 мин при 1500 об/мин. При проведении экспериментального блока в инкубационную среду добавляли рекомбинантный TNFα в концентрациях 0,015-1,0 нг/мл, либо рекомбинантный IL-2, либо IL-4 в диапазоне доз от 0,015 до 1,0 нг/мл. Кроме того, для оценки антиапоптотического действия цитокинов проводилось культивирование лимфоцитов с rIL-2 либо rIL-4 при одновременном добавлении 10^-4 моль/мл дексаметазона («KRCA», Словения) в качестве индуктора апоптоза.

Оценку количества лимфоцитов, вступивших в апоптоз, проводили с использованием FITC-меченного аннексина V и пропидиума йодида (PI) («Beckman Coulter», Франция) на проточном цитофлюориметре Epics XL («Beckman Coulter», Франция) (Pepper A. et al., 1998). Количество клеток со сниженным мембранным митохондриальным потенциалом (∆ψ) регистрировали с помощью набора реагентов «MitoScreen» («BD Pharmigen», США). Продукцию АФК в клетках оценивали методом проточной цитофлюориметрии с использованием красителя с заблокированной флюоресценцией – дихлорфлюоресцеина диацетата («Sigma Aldrich», США).

Продукцию TNFα, IL-2, IL-4, IL-10 и IL-12 определяли путем оценки их концентрации в супернатантах культур лимфоцитов методом твердофазного иммуноферментного анализа по инструкции, предлагаемой производителем тест-систем («Протеиновый контур», Россия).

Регистрацию количества лимфоцитов, несущих рецепторы к фактору некроза опухоли-α I типа (TNF-RI) либо рецепторы к интерлекину-2 (IL-2Rα, CD25), либо рецепторы к интерлекину-4 (IL-4Rα, CD124), либо рецепторы к интерлекину-10 (IL-10R), либо рецепторы к интерлекину-12 (IL-12Rβ1), проводили на проточном цитофлюориметре Epics XL («Beckman Coulter», Франция) с помощью стандартных моноклональных антител (МКАТ) к рецепторам, меченных фикоэритрином (PE) («R&D», США).

Определение содержания белков-регуляторов апоптоза (Bcl-2, Bcl-x_L, Bax, Bad) и транскрипционных факторов (NF-kB, р53, рRb), а также ингибитора циклинзависимых киназ p21^WAF1/Cip1 в лимфоцитах крови проводили методом вестерн-блоттинга.

Образцы для анализа получали путем лизирования клеток. Белки разделяли по молекулярной массе методом электрофореза в SDS-полиакриламидном геле – 5%-ом концентрирующем (0,13 мМ Tris-HCl, pH=6,8) и 10%-ом разделяющем (375 мМ Tris-HCl, pH=8,8) под действием электрического поля (10 В/см пути). Далее белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad», США) в течение 80-90 мин при силе тока 50-60 мА на дорожку. Нитроцеллюлозную мембрану инкубировали с первичными антителами к NF-kB RelA (р65), фосфорилированному рRb, нефосфорилированному р53, p21^WAF^1/^Cip¹, Bax, Bad, Bcl-2 и Bcl-x_L («Sigma-Aldrich», США) в разведении 1:300, визуализировали зоны с помощью прицепитирующего субстрата пероксидазы на основе тетраметилбензидина (НПО «БиоТест Системы», Москва). Полученные блоты сканировали, изображение обрабатывали с помощью программного обеспечения («Carl Zeiss», Германия). В качестве стандарта и внутреннего контроля использовали глицеро-3-фосфат-дегидрогеназу (G3PDH) («Chemicon», США). Результаты выражали в усл. ед., рассчитывая содержание исследуемых протеинов как отношение сигнала определяемого белка к сигналу белка глицеро-3-фосфат-дегидрогеназы в исследуемых образцах.

Результаты исследования были оценены с использованием методов статистического анализа. Характер распределения данных проводили по статистическим критериям Колмогорова-Смирнова. Для каждой выборки вычисляли характеристики: медиану (Me), 25% и 75% квартили (Q1 и Q3). Поскольку отмечалось отсутствие согласия данных с нормальным распределением, для оценки достоверности различий независимых выборок использовали ранговый критерий Манна-Уитни (U-тест), для множественного сравнения нескольких групп использовали критерий Крускала-Уоллиса. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05 (5%). Для выявления функциональных взаимосвязей между группами изученных параметров вычисляли коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05 [Лакин Г.Ф., 1980; Гланц С., 1998; Голева О.П., 2001].

^ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Молекулярные механизмы регуляции апоптоза лимфоцитов крови рекомбинантными TNFα, IL-2 и IL-4

В настоящее время накоплены достаточно противоречивые факты о влиянии цитокинов на программированную гибель клеток. Так, установлено, что апоптоз реализуется при цитокиновом дефиците, когда клетка испытывает недостаток тех или иных факторов роста, которые в обычных условиях активируют соответствующие рецепторы. Эффект ростовых факторов обусловлен их действием на специфические рецепторы, что приводит к синтезу подавляющих апоптоз агентов и ингибированию стимуляторов апоптоза. Кроме того, показано, что ряд цитокинов может оказывать как про-, так и антиапоптотические эффекты на клетку. Конечный результат действия цитокина может определяться его дозой, типом клетки-мишени, их функциональным состоянием, а также условиями микроокружения. Несмотря на активное исследование роли отдельных цитокинов в реализации апоптоза, остаются неизвестными многие механизмы этого явления [Gewies A., 2003; Krammer et al. P.H., 2007; Sirisinha S., Asian Pac, 2011]. Важность решения данной проблемы сопряжена со вскрытием молекулярных основ реализации биологической функции цитокинов и неоднозначностью клеточных реакций в ответ на их присутствие либо отсутствие, а также с недостаточным на сегодняшний день пониманием путей вовлечения цитокиновых молекул и связанных с ними интрацеллюлярных событий в возникновение и развитие различных патологических процессов и состояний [Ярилин А.А., 1997; Strom T.B., Koulmanda M., 2008; Agostini M. et al., 2011].

Все вышесказанное и определило наш интерес к изучению молекулярных механизмов регуляции апоптоза лимфоцитов крови в условиях дисбаланса Th1- и Th2-цитокинов. Для достижения поставленной цели исследования проводились в два этапа. На первом этапе (экспериментальном) осуществлялось изучение in vitro про- и антиапоптотических эффектов рекомбинантных TNFα, IL-2 и IL-4 в отношении лимфоцитов крови, полученных у здоровых доноров. Второй этап (клинический) на модели клещевого энцефалита позволил вскрыть молекулярные механизмы регуляции апоптоза лимфоцитов при дисбалансе эндогенных Th1- (IL-2, IL-12) и Th2-цитокинов (IL-4, IL-10).

Первоначально нами был проведен эмпирический подбор концентраций рекомбинантных цитокинов (rTNFα, rIL-2 и rIL-4), которые далее были использованы в эксперименте in vitro для выявления молекулярных механизмов реализации цитокин-опосредованного апоптоза лимфоцитов крови.

Культивирование лимфоцитов крови в полной питательной среде с добавлением рекомбинантного TNFα в диапазоне доз 0,015-0,150 нг/мл, а также в чистой среде RPMI-1640 с добавлением rIL-2 и rIL-4 в концентрациях от 0,015 до 1,0 нг/мл позволило установить дозозависимый характер влияния цитокинов на реализацию программированной гибели указанных клеток (рис. 2-4).

Добавление в инкубационную среду rTNFα в конечной концентрации 0,015 нг/мл и 0,025 нг/мл не приводило к каким-либо значимым изменениям относительного количества клеток, вовлеченных в процессы апоптоза и некроза (рис. 2). Возможно, что данные дозы rTNFα недостаточны для возникновения необходимого количества эффективных столкновений лиганда и рецептора, лимитированных концентрацией участников реакции в единице объема и способствующих их взаимодействию [Бауков Ю.И., Тюкавкина Н.А., 2008]. Дальнейшее увеличение содержания rTNFα в инкубационной среде до 0,050 нг/мл приводило к статистически значимому увеличению числа лимфоцитов в апоптозе. Культивирование лимфоцитов в среде, содержащей рекомбинантную форму TNFα в концентрации от 0,100 до 0,150 нг/мл, сопровождалось вовлечением в апоптоз еще большего количества указанных клеток (рис. 2).

Доза rTNFα, нг/мл

Рис. 2. Влияние различных доз рекомбинантного TNFα на реализацию апоптоза лимфоцитов

Изучение эффектов других иммунорегуляторных цитокинов (IL-2 и IL-4) позволило выявить аналогичные изменения. Проведенное in vitro исследование влияния на лимфоцитарные клетки rIL-2 и rIL-4 показало, что rIL-2 начинал проявлять своё проапоптотическое действие, когда его уровень в среде культивирования составлял 0,100 нг/мл, rIL-4 индуцировал апоптоз в культуре лимфоцитов, начиная с концентрации 0,150 нг/мл. При последующем увеличении дозы медиаторов отмечалось повышение числа лимфоцитов в апоптозе (рис. 3 и 4).

Таким образом, в настоящем исследовании было показано, что для реализации апоптозиндуцирующего действия цитокинов на лимфоциты крови в условиях in vitro необходим определенный порог концентрации цитокинов. D.J. Stauber et al. [2000] высказывали гипотезу о наличии определенного количества активированных цитокиновых рецепторов на поверхности лимфоцитов, необходимых для индукции пролиферации клеток. Наличие подобного «барьера» действия IL-2 и IL-4 также может быть объяснено строением специфических рецепторов и работой внутриклеточных сигнальных путей [Boytim M.L. et al., 2000; Villarino A.V., 2007; Kaminski A. et al., 2010; Black S.M. et al., 2011].

Доза rIL-2, нг/мл

Рис. 3. Влияние различных доз рекомбинантного IL-2 на реализацию апоптоза лимфоцитов

Доза rIL-4, нг/мл

Рис. 4. Влияние различных доз рекомбинантного IL-4 на реализацию апоптоза лимфоцитов

Исследование антиапоптотического эффекта IL-2 и IL-4 проводилось на модели глюкокортикоид-индуцированного апоптоза. Добавление в среду инкубации синтетического глюкокортикоида (ГК) дексаметазона в концентрации 10-4 моль/мл приводило к обогащению апоптотической фракции лимфоцитов. При одновременном воздействии дексаметазона в указанной дозе и rIL-2 либо rIL-4 в диапазоне концентраций от 0,025 до 0,150 нг/мл на лимфоциты было показано протективное действие указанных цитокинов в отношении ГК-индуцированного апоптоза (рис. 5 и 6).

Антиапоптотический эффект исследуемых цитокинов известен еще с начала 90-х годов XX века и хорошо описан в литературе [Nieto M.A., Lopez-Rivas A., 1992; Kam J.C. et al., 1993; Estaquier J., Ameisen J.C., 1997]. Однако в нашей работе был впервые показан дозозависимый характер этого явления, механизм которого может быть связан с увеличением количества активированных IL-2R и IL-4R при повышении дозы цитокинов и инициации антиапоптотических сигнальных путей в клетке.

Рис. 5. Количество апоптотически измененных лимфоцитов в условиях культивирования в среде, содержащей дексаметазон и rIL-2 в различных концентрациях (Q₂ – популяция погибших клеток; Q₃ – популяция живых клеток; Q₄ – популяция клеток в процессе апоптоза)

Примечание: 1 – интактные клетки; 2 – лимфоциты, культивированные в среде с добавлением дексаметазона; 3 – лимфоциты, культивированные в среде с дексаметазоном и rIL-2 в концентрации 0,025 нг/мл; 4 – лимфоциты, культивированные в среде с дексаметазоном и rIL-2 в концентрации 0,050 нг/мл; 5 – лимфоциты, культивированные в среде с дексаметазоном и rIL-2 в концентрации 0,100 нг/мл

Феномен зависимости реализации программированной клеточной гибели от дозы цитокинов в целом малоизучен; вскрытие его молекулярных основ является предметом отдельного исследования. Анализ результатов проведенного нами исследования лишь указывает на факт дозозависимого эффекта rTNFα, rIL-2 и rIL-4 в отношении программированной клеточной гибели и позволяет заключить, что использование конечной концентрации rTNFα 0,050 нг/мл, rIL-2 0,100 нг/мл, rIL-4 0,150 нг/мл целесообразно для изучения молекулярных механизмов проапоптотического эффекта цитокинов.

Рассматривая механизмы реализации апоптоза клетки, особое внимание следует уделить митохондриям, которые, образуя сложную систему взаимовлияний, являются как мишенями, так и продуцентами активных форм кислорода [Бра М., 2005; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006; Circu M.L. et al., 2010; Apostolova N. et al., 2011]. Так, показано, что под действием различных цитокинов, в том числе и TNFα, IL-2 и IL-4, в клетках эукариот активируются ферменты, стимулирующие образование активных форм кислорода [Matsuzawa A. et al., 2005]. Сигнал поступает на митохондрии, что ведет к повышению неспецифической проницаемости мембран органеллы. Повреждающее последствие индукции неспецифической проницаемости – избыточная генерация АФК [Зоров Д.Б. и соавт., 2005; Daiber A., 2010].

Рис. 6. Количество лимфоцитов в апоптозе в условиях культивирования в среде, содержащей дексаметазон и rIL-4 в различных концентрациях (Q₂ – популяция погибших клеток; Q₃ – популяция живых клеток; Q₄ – популяция клеток в процессе апоптоза)

Примечание: 1 – интактные клетки; 2 – лимфоциты, культивированные в среде с добавлением дексаметазона; 3 – лимфоциты, культивированные в среде с дексаметазоном и rIL-4 в концентрации 0,050 нг/мл; 4 – лимфоциты, культивированные в среде с дексаметазоном и rIL-4 в концентрации 0,100 нг/мл; 5 – лимфоциты, культивированные в среде с дексаметазоном и rIL-4 в концентрации 0,150 нг/мл

В связи с тем, что реализация цитокин-опосредованного апоптоза может быть сопряжена с перфорацией митохондриальной мембраны, нами была выполнена оценка количества лимфоцитарных клеток с деполяризованной мембраной митохондрий с помощью индикатора целостности митохондриальной мембраны – JC-1. Проведенное исследование позволило выявить увеличение доли лимфоцитов с нарушением целостности митохондриальной мембраны после инкубации с рекомбинантной формой TNFα, IL-2 и IL-4 в апоптогенной концентрации (рис. 7).

Снижение трансмембранного потенциала митохондрий (ΔΨ) обычно рассматривают как одно из ведущих и первых проявлений апоптоза. Кроме того, такой специфичный для апоптоза процесс, как фрагментация ДНК, по всей видимости, происходит именно в клетках со сниженной величиной мембранного потенциала митохондрий [Бойчук С.В., Мустафин И.Г., 2001].

1 2 1 3 4

Рис. 7. Количество лимфоцитов со сниженным трансмембранным митохондриальным потенциалом в условиях культивирования с проапоптотической концентрацией рекомбинантных TNFα, IL-2 и IL-4 in vitro (Р1 – популяция клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий; Р2 – популяция клеток с нормальным трансмембранным потенциалом митохондрий)

Примечание (здесь и на рис. 8): 1 – интактные лимфоциты; 2 – лимфоциты, инкубированные с rTNFα в дозе 0,050 нг/мл; 3 – лимфоциты, инкубированные с 0,100 нг/мл rIL-2; 4 – лимфоциты, инкубированные с 0,150 нг/мл rIL-4; здесь и на рис. 8-10, 14-16: на гистограмме для каждой группы представлены медиана, 25% и 75% квартили

Митохондрии способны модулировать танатогенную программу, изменяя продукцию окислительных эквивалентов в виде АФК [Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007; Daiber A., 2010; Apostolova N. et al., 2011]. Некоторое количество супероксид-аниона и перекиси водорода постоянно генерируется в электронно-транспортной цепи митохондрий путем «утечки» электронов на кислород при их переносе от первого дыхательного комплекса (NADH-убихинон оксидоредуктаза) к третьему (убихинол-цитохром С оксидоредуктаза) [Бра М. и соавт., 2005]. Нарушение структуры митохондриальной мембраны совместно с выходом цитохрома С в цитоплазму (при этом происходит угнетение переноса электронов с третьего на четвертый дыхательный комплекс) снижает электрохимический градиент протонов, создаваемый на внутренней мембране митохондрий цепью переноса электронов [Марри Р. и соавт., 1993]. Подобные события вызывают в клетках, с одной стороны, «энергетический голод» путем уменьшения скорости образования ATP, а, с другой, – усиливают переход электронов на кислород, повышая тем самым количество внутриклеточных АФК [Бра М. и соавт., 2005; Circu M.L., Aw T.Y., 2010].

Возможность реализации данных механизмов повышенной продукции АФК при цитокин-опосредованном апоптозе подтверждается выявленным нами с помощью цитофлуориметрического исследования фактом накопления АФК в лимфоцитах крови, инкубированных с rTNFα, rIL-2 и rIL-4 в апоптогенной концентрации (рис. 8).

усл. ед.

Рис. 8. Уровень активных форм кислорода в лимфоцитах в условиях культивирования с проапоптотической концентрацией рекомбинантных TNFα, IL-2 и IL-4 in vitro

Важно подчеркнуть, что полученные нами данные сопоставимы с результатами других исследователей, свидетельствующих о том, что взаимодействие IL-4 со своим рецептором, имеющим общую с IL-2 γ-цепь, приводит к PI3K-зависимой активации NAD(P)H оксидаз NOX1 и NOX5 через рецепторассоциированные тирозинкиназы и тирозинфосфатазы, результатом чего является генерация АФК [Matsuzawa A. et al., 2005; Kinter A.L. et al., 2008; Kaminski A. et al., 2009].

При сравнительном анализе показателей, характеризующих трансмембранный потенциал митохондрий и наработку активных форм кислорода при действии на лимфоцитарные клетки рекомбинантных TNFα, IL-2 или IL-4, статистически значимых отличий между изучаемыми параметрами обнаружено не было.

Таким образом, анализ результатов цитофлуориметрического исследования лимфоцитов, культивированных с апоптозиндуцирующей дозой рекомбинантных TNFα, IL-2 и IL-4, позволил обнаружить признаки нарушения целостности мембраны митохондрий. Обращало на себя внимание также выраженное изменение редокс-состояния клетки, вызванное накоплением в ней активных форм кислорода.

Для изучения механизмов митохондриального пути реализации апоптоза, индуцированного цитокинами TNFα, IL-2 и IL-4, было проведено исследование содержания про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2, регулирующих проницаемость мембраны митохондрий и осуществляющих контроль за выходом митохондриальных факторов.

Исследование, выполненное методом вестерн-блоттинга, показало, что при действии проапототической дозы rTNFα наблюдалось значительное снижение содержания в лимфоцитах белков Bcl-2 и Bcl-x_L, а также проапоптотического протеина Bax по сравнению с величиной данных показателей в интактных клетках. Аналогичные изменения были зарегистрированы и при действии апоптогенных концентраций rIL-2 и rIL-4 (рис. 9).

К настоящему времени в регуляции апоптоза наиболее хорошо изучена роль белка Bcl-2, который представляет собой продукт протоонкогена bcl-2. Существует несколько механизмов, с помощью которых происходит модуляция состояния Bcl-2. Первый связан со способностью белка формировать гомо- и гетеродимеры с Bax, Bad, Bak и Bcl-x_L. Второй механизм основывается на изменении степени фосфорилирования белка Вcl-2. Третий механизм возможного ингибирования Вс1-2 обусловлен его взаимодействием с белком Ваg-1, который способен соединяться с Вс1-2 и цитоплазматическим доменом рецептора для гепатоцеллюлярного и тромбоцитарного факторов роста.

Другой антиапоптотический белок Bcl-x_L также оказывает антиапоптогенное действие, регулируя проницаемость внешней мембраны митохондрий через взаимодействие с VDAC [Shoshan-Barmatz V. et al., 2010].

Однако антиапоптотическая функция протеина Bcl-x_L в условиях TNFα-, IL-2- и IL-4-опосредованного апоптоза является недостаточной по ряду причин, связанных, вероятно, прежде всего, с функционированием проапоптотического белка Bad [Chiang C.-W. et al., 2003], увеличение количества которого было обнаружено нами в лимфоцитах при действии на них апоптогенной дозы рекомбинантных форм указанных цитокинов (рис. 9). Подобные изменения могут быть опосредованы действием серин/треониновых фосфатаз, обусловливающих высвобождение белка Bad из связи со своим ингибитором 14-3-3 [Gardino A.K., et al. 2011].

Кроме того, нарушение функции белка Bcl-x_L может быть связано с образованием комплекса с проапоптотическим белком Bax, что подтверждает обнаруженная нами положительная корреляционная зависимость между содержанием данных белков в лимфоцитах, инкубированных с rTNFα, rIL-2 или rIL-4 (R=0,86, p=0,011; R=0,89, p=0,033; R=1,00, p=0,017, соответственно).

2 3 2 4 5 2 3 2 4 5 2 3 2 4 5 2 3 2 4 5

Bcl-2 Bcl-x_L Bax Bad

Рис. 9. Содержание белков семейства Bcl-2 в лимфоцитах при их культивировании с проапоптотической дозой рекомбинантных TNFα, IL-2 и IL-4 in vitro

Примечание (здесь и на рис. 10): 1 – маркер молекулярного веса; 2 – интактные лимфоциты; 3 – лимфоциты, инкубированные с rTNFα в дозе 0,050 нг/мл; 4 – лимфоциты, инкубированные с 0,100 нг/мл rIL-2; 5 – лимфоциты, инкубированные с 0,150 нг/мл rIL-4; G3PDH – глицеро-3-фосфат-дегидрогеназа

Таким образом, результаты настоящего исследования позволяют предположить, что сдвиг равновесия между уровнем про- и антиапоптотических Bcl-2-белков в сторону проапоптотических лежит в основе индукции митохондриального пути программированной гибели и апоптозиндуцирующего действия цитокинов. Данный факт кажется парадоксальным, учитывая то, что, по многочисленным литературным сведениям, IL-2 и IL-4 стимулируют экспрессию антиапоптотических и подавляют экспрессию проапоптотических белков семейства Bcl-2 [Akbar A.N. et al., 1996; Feischer A. et al., 2002; S. Fujimura S. et al., 2004; Dessauge F. et al., 2006; Bosque А. et al., 2007; Abdulamir A.S. et al., 2009; Kazi A. et al., 2011]. Такое кардинальное различие в результатах только подтверждает факт двойственности эффектов цитокинов и зависимость их от физиологического состояния клеток.

Изменения содержания белков семейства Bcl-2 в лимфоцитах при действии цитокинов может быть обусловлено изменением экспрессии генов данных белков. Необходимо добавить, что конкретные механизмы регуляции Bcl-2-системы на транскрипционном уровне пока мало изучены. Изменение экспрессии может быть как первичным (под влиянием белков сигнальных путей от цитокиновых рецепторов), так и вторичным. Механизм вторичного изменения экспрессии генов анализируемых белков может быть реализован при участии факторов NF-kB и p53 [Fridman J. S., Lowe S.W., 2003; Plesnila N. et al., 2008; Gurzov E.N. et al., 2010].

Транскрипционный фактор p53 имеет чрезвычайно высокое значение для нормального клеточного функционирования. Важнейшим средством регуляции апоптоза протеином p53 является его контроль количества в клетке белков семейства Bcl-2 [Fridman J.S., Lowe S.W., 2003; Yoshida K. et al., 2010]. В качестве опухолевого супрессора p53 определяет в организме поддержание клеточного и тканевого гомеостаза. При генотоксическом стрессе p53 останавливает клеточный цикл на время репарации ДНК, включает программы апоптоза и сенесенса. Нарушения p53-опосредованных процессов приводят к иммортализации клеток и накоплению в них различных повреждений [Моргункова А.А., 2005; Molchadsky A. et al., 2010].

Фактор транскрипции NF-kB занимает ключевую позицию в регуляции процессов пролиферации и программированной клеточной гибели [Kucharczak J. et al., 2003; Wu Z.H. et al., 2008]. Активация NF-kB опосредована классом МАР-киназ JNK. Редокс-зависимые JNK, участвующие в реализации TNFα-индуцированного апоптоза, воздействуют на киназу, фосфорилирующую ингибитор NF-kB, что приводит к высвобождению активной формы транскрипционного фактора [Perkins N.D., 2007; Kizilay G. et al., 2008; Rivas M.A. et al., 2008]. После транслокации в ядро NF-kB связывается со специфическими kB-сайтами ДНК и активирует транскрипцию различных генов-мишеней [Saccani S. et al., 2003; Sabatel H. et al., 2011].

Опираясь на вышеописанные теоретические данные о возможной заинтересованности факторов транскрипции p53 и NF-kB в реализации цитокин-опосредованного апоптоза, мы провели оценку их содержания в лимфоцитах крови, культивированных в среде с rTNFα, rIL-2 и rIL-4 в апоптогенной дозе.

Было установлено, что при инкубировании лимфоцитов в среде, содержащей апоптозиндуцирующую концентрацию rTNFα, rIL-2 и rIL-4, в указанных клетках, по сравнению с интактными, увеличивается количество свободного фактора транскрипции NF-kB (рис. 10), определяемое содержанием в клетках белка, специфически связавшегося с антителами к p65 RelA-субъединице NF-kB, что говорит о цитокин-зависимой активации NF-kB. Помимо этого, воздействие на лимфоциты крови рекомбинантных TNFα, IL-2 и IL-4 приводило к снижению уровня нефосфорилированного белка p53 (рис. 10).

Интересны, с точки зрения регуляции апоптоза, взаимоотношения p53 с транскрипционным фактором NF-kB [Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007; Plesnila N. et al., 2007]. Существуют две гипотезы относительно эффектов одновременного присутствия в клетке активированных NF-kB и p53. Первая подразумевает параллельные события, описанные нами ранее и связанные с деятельностью ферментов МАР-киназного каскада [Webster G.A., Perkins N.D., 1999; Rivas M.A. et al., 2008]. Альтернативная же гипотеза предполагает последовательную активацию факторов транскрипции. В данном случае один из активированных транскрипционных факторов выполняет роль инициатора, а другой – эффектора в реализации апоптозмодулирующего стимула. В исследовании, проведенном K.M. Ryan et al. [2000], было показано, что p53 может активировать NF-kB через МЕК-1-киназу, при этом NF-kB выступает в качестве витального компонента p53-индуцированного апоптоза.

Ранее рядом авторов была продемонстрирована способность NF-kB, активированного белком p53, сенсибилизировать клетки к апоптозу путем повышения экспрессии генов Fas, FasL и TNFα [Campbell, K.J., Perkins N.D., 2006; Perkins N.D., 2007; Gurzov E.N. et al., 2010]. Некоторые экспериментальные работы показали возможность NF-kB-опосредованной активации p53, ведущей к транскрипции генов проапоптотических белков Вах и Bcl-x_S [Kucharczak J. et al., 2003; Danilova N. et al., 2008].

Однако в случае цитокин-инициированного апоптоза, несмотря на возможность разрушения связи между NF-kB и его ингибитором IkB-α и обнаруженного нами повышения содержания свободного NF-kB, выполнение им своих функций в качестве транскрипционного фактора может быть весьма затруднено вследствие взаимной внутриядерной конкуренции с p53 [Webster G.A., Perkins N.D., 1999; Kuribayashi K., El-Deiry W.S., 2008].

Белок p53 в качестве транскрипционного фактора имеет возможность запускать апоптоз путем «выключения» гена, кодирующего белковый продукт Bcl-2 [Моргункова А.А., 2005]. Данный факт подтвердился обнаруженной нами корреляционной зависимостью между содержаниями нефосфорилированного p53 и Bcl-2 (R=0,93, p=0,027; R=0,75, p=0,005; R=0,67, p=0,030) в лимфоцитах, инкубированных с апоптогенной дозой TNFα, IL-2 или IL-4 (рис. 9, 10). Помимо этого, p53 позитивно регулирует образование белкового продукта гена bad [Jiang P. et al., 2006; Molchadsky A. et al., 2010], о чем косвенно свидетельствует обнаруженная активация p53 и корреляционная зависимость между количеством нефосфорилированного p53 и Bad в лимфоцитах, инкубированных с рекомбинантными формами TNFα, IL-2 или IL-4 (R= - 0,93, p=0,017; R= - 0,93, p=0,016; R= - 0,74, p=0,046).

2 3 2 4 5 2 3 2 4 5 2 3 2 4 5 2 3 2 4 5

NF-kB p53 pRb p21^WAF1/Cip1

Рис. 10. Содержание транскрипционных факторов NF-kB, p53, pRb и ингибитора циклинзависимых киназ p21^WAF^1/^Cip¹ в лимфоцитах крови, культивированных с проапоптотической концентрацией рекомбинантных TNFα и IL-2 и IL-4 in vitro

Существует несколько путей утилизации нефосфорилированного p53, связанных, прежде всего, с его фосфорилированием, убиквитинилированием, ацетилированием и метилированием [Liu B. et al., 2008]. Поэтому для оценки перехода p53 в его транскрипционно активное фосфорилированное состояние необходимо было исследовать изменение количества какого-либо белка, ген которого находится под контролем p53. Предъявляемым требованиям удовлетворяет белок p21^WAF1/Cip1, относящийся к Cip1/Kip1-семейству белков-регуляторов клеточного цикла [Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л., 2003; Weiss R.H., 2003; Garner E. et al., 2007; Hill R. et al., 2008].

Протеин p21^WAF1/Cip1 обладает способностью связываться с комплексом циклин D–циклинзависимая киназа и является ингибитором последней, что ведет к аресту клеточного цикла. Транскрипция гена p21^WAF1/Cip1 специфически находится под контролем p53 [Weiss R.H., 2003; Sperka T. et al., 2011]. Поэтому нами было предпринято исследование количества белка p21^WAF1/Cip1 в клетках, инкубированных с апоптогенной дозой rTNFα, rIL-2 и rIL-4.

Выявленное увеличение содержания данного протеина в лимфоцитах при действии рекомбинантных цитокинов, по сравнению с интактными клетками (рис. 10), по всей видимости, свидетельствуют о том, что зарегистрированное снижение количества нефосфорилированного p53 в ответ на апоптогенное действие rTNFα, rIL-2 и rIL-4 является следствием его фосфорилирования. Кроме того, изменение количества белка p21^WAF1/Cip1 при цитокин-индуцированном апоптозе имеет и самостоятельное значение, указывающее на вовлеченность данного протеина в реализацию клеточной гибели [Chau B.N. et al., 2004; Arpa L. et al., 2010].

Белок p21^WAF^1/^Cip¹ избирательно подавляет активность циклин D1/CDk4- и циклин E/CDk2-комплексов, приводя к задержке перехода клетки из фазы G₁ в фазу S, что блокирует нормальное прохождение клетки по циклу. Основным субстратом комплексов циклин D-Cdk4 и циклин D-Cdk6 является опухолевый супрессор pRb, который регулирует вступление клетки в клеточный цикл. Связывание белков семейства E2F c pRb ингибирует их транскрипционную активность. При митогенных сигналах, вызываемых ростовыми факторами, pRb в середине G₁-фазы фосфорилируется комплексом циклин D-Сdk4 (или циклин D-Cdk6), что вызывает высвобождение транскрипционных факторов E2F-DP из комплекса с pRb и их активацию [Garner E., Raj K., 2008; Hallenborg P. et al., 2009; Bremner R, Zacksenhaus E., 2010].

При инкубации лимфоцитов с апоптозиндуцирующей дозой rTNFα, rIL-2 и rIL-4, было зафиксировано появление в клетках pRb, в то время как в культуре интактных клеток этот белок отсутствовал (рис. 10).

Подводя итог проведенного экспериментального исследования, следует отметить двойственность эффектов Th1- (IL-2) и Th2-цитокинов (IL-4) в отношении апоптоза лимфоцитов крови. Направленность действия указанных цитокинов определяется, по-видимому, функциональным состоянием клеток, а также условиями культивирования клеток (в нашем эксперименте использование бессывороточной инкубационной среды, классического индуктора апоптоза иммунокомпетентных клеток – дексаметазона). Кроме того, влияние цитокинов (TNFα, IL-2 и IL-4) на реализацию программированной гибели лимфоцитов крови носит дозозависимый характер.

TNFα, IL-2 и IL-4 опосредуют свое действие через специфические рецепторные пути, однако на определенном этапе передачи апоптогенного сигнала запускаются универсальные механизмы, связанные с участием митохондрий, АФК, транскрипционных факторов NF-kB, p53 и pRb, ингибитора циклинзависимых киназ p21^WAF1/Cip1, а также представителей семейства белков Bcl-2 – Bcl-2, Bcl-x_L, Bax и Bad, реализующиеся в конечном итоге в виде стандартного эффекторного каскада (рис. 11).

1 2

плохо

не очень плохо

средне

хорошо

отлично

Ваша оценка этого документа будет первой.

Ваша оценка:

Автореферат

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Похожие: