Александрова елена Николаевна иммунологическая характеристика антифосфолипидного синдрома
|
|
Скачать 0.88 Mb.
|
|
Н  а правах рукописиАЛЕКСАНДРОВА Елена Николаевна ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИФОСФОЛИПИДНОГО СИНДРОМА 14.00.39 – Ревматология 14.00.46 – Клиническая лабораторная диагностика Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва – 2008 Р абота выполнена в Государственном учреждении Институте ревматологии Российской академии медицинских наук^ доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН НАСОНОВ Евгений Львович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор ^ доктор медицинских наук, профессор КОРШУНОВ Николай Иванович доктор медицинских наук, профессор ЛУГОВСКАЯ Светлана Алексеевна ^ Государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации» Защита состоится 10 октября 2008 г. в 13.00 на заседании диссертационного совета Д. 001.018.01 при Государственном учреждении Институте ревматологии Российской академии медицинских наук (115522, Москва, Каширское шоссе, 34 А) С диссертацией можно ознакомиться в медицинской библиотеке Государственного учреждения Института ревматологии Российской академии медицинских наук (115522, Москва, Каширское шоссе, 34 А) Автореферат разослан _____________ 2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук ДЫДЫКИНА И.С. ^ Актуальность темы Антифосфолипидный синдром (АФС) – клинико-лабораторный симптомокомплекс, характеризующийся рецидивирующими венозными и артериальными тромбозами, акушерской патологией, тромбоцитопенией и гиперпродукцией антифосфолипидных антител (аФЛ) (Hughes G.R.V., 1983; Насонов Е.Л. и соавт., 1987; Алекберова З.С. и соавт., 1988). аФЛ – гетерогенная группа аутоантител, распознающих антигенные детерминанты анионных и нейтральных фосфолипидов (ФЛ) и комплексные эпитопы, образующиеся в процессе взаимодействия ФЛ и фосфолипидсвязывающих белков плазмы крови (Roubey R.A., 1996). Обязательные методы лабораторной диагностики АФС включают обнаружение волчаночного антикоагулянта (ВА) с помощью фосфолипидзависимых коагуляционных тестов и определение β2-гликопротеин – 1 (β2-ГП 1) зависимых антител к кардиолипину (аКЛ) класса IgG и IgM стандартным иммуноферментным методом (Harris E.N., 1990; Galli M. И соавт., 1990; Matsuura E. И соавт., 1990; McNeil H.P. и соавт., 1990; Brandt J.T. и соавт., 1995; Pierangeli S.S. и соавт., 1998; Wilson W. A. и соавт., 1999; Баркаган З.С. и соавт., 2000). Вместе с тем определение ВА и аКЛ не позволяет выявить весь спектр аФЛ, ассоциирующихся с различными клиническими проявлениями АФС. При наличии у пациентов характерных клинических признаков АФС и низкоположительных или отрицательных результатов тестирования ВА и аКЛ рекомендуется использовать дополнительные лабораторные методы для диагностики АФС, в первую очередь, иммуноферментный анализ (ИФА) антител к β2-ГП I (аβ2-ГП I) классов IgG и IgM (Cabral A.R. и соавт., 1996; Miyakis S. и соавт., 2006). Клиническое значение аКЛ и аβ2-ГП I класса IgА, а также антител к другим ФЛ и кофакторным белкам (фосфатидилсерину, фосфатидилинозитолу, фосфатидилэтанола-мину, фосфатидилхолину, смеси ФЛ, протромбину – ПТ, комплексу фосфатидилсерин/ПТ, белкам C, S, Z и аннексину V) остается неясным. По мнению большинства исследователей эти субтипы аФЛ не являются лабораторными критериями достоверного АФС, однако могут оказаться полезными для диагностики «вероятного» или «пре – АФС» (Harris E.N., Pierangeli S.S., 2000; Asherson R.A., 2006; Miyakis S. и соавт., 2006). К одной из наиболее сложных проблем лабораторной диагностики АФС относится недостаточно высокая специфичность аКЛ. Показано, что, аβ2-ГП I обладают большей специфичностью, но меньшей чувствительностью в отношении диагностики АФС по сравнению с аКЛ (Reddel S.W., Krilis S.A., 1999). Однако в целом результаты изучения диагностической точности иммуноферментного метода определения аФЛ носят противоречивый характер и зависят от выбранного уровня позитивности, подбора групп больных АФС и методических особенностей анализа аФЛ. аФЛ являются не только серологическим маркером и критерием диагноза АФС, но и патогенетическим медиатором тромбозов и акушерской патологии при АФС (Pierangeli S.S., Harris E.N., 1996; Rand J.H. и соавт., 2002; Насонов Е.Л., 2004; De Groot P.G., Derksen R.H.W.M., 2005; Giannokopoulos B. и соавт., 2007). Механизмы патогенетического действия аФЛ связаны с подавлением функциональной активности белков каскада свертывания крови (Shibata S. и соавт., 1994; De Groot P.G. и соавт., 1996), угнетением фибринолиза (Schousboe I., Rasmussen M.S., 1995), повреждением эндотелиальных клеток (Del Papa N. и соавт., 1997), активацией тромбоцитов (Wiener M.H. и соавт., 2001; Lutters B.C. и соавт., 2003) и моноцитов (Zhou H. и соавт., 2004). Важным фактором поражения сосудистой стенки при АФС служит активация/дисфункция эндотелиальных клеток, индуцированная провоспалительными цитокинами (фактором некроза опухоли α – ФНОα, интерлейкином - 1 – ИЛ-1, интерфероном γ - ИФНγ), а также β2-ГП 1 зависимыми аФЛ, антиэндотелиальными клеточными антителами и антителами к ДНК, обладающими способностью перекрестно реагировать с эндотелием (Salogin K.V. и соавт., 1992; Cinez D.B. и соавт., 1998). Это проявляется гиперэкспрессией клеточных молекул адгезии (КМА), синтезом провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6), простагландинов, оксида азота, что ассоциируется с развитием тромботической васкулопатии, характерной для АФС. Основными серологическими маркерами дисфункции эндотелия являются растворимые (р) КМА и антиген фактора Виллебранда (ФВАг). Повышение концентрации рКМА (рVCAM-1, pICAM-1, pP-селектина, рЕ-селектина) и ФВАг в сыворотке крови наблюдается при многих воспалительных, аутоиммунных, инфекционных, опухолевых заболеваниях, атеросклеротическом поражении сосудов, системных васкулитах (Насонов Е.Л., Баранов А.А., Шилкина Н.П., 1999). Данные о связи гиперпродукции рКМА и ФВАг с развитием тромботических осложнений при АФС немногочисленны и противоречивы (Nassonov E. и соавт., 1994; Баранов А.А., 1998; Kaplanski G. и соавт., 2000). Другой механизм активации эндотелия при АФС и СКВ опосредуется С-реактивным белком (СРБ), который усиливает экспрессию КМА на мембране эндотелиальных клеток (Verma S., Yeh E.T., 2003; Jialal I. и соавт., 2004; Khreiss T. и соавт., 2004; Venugopal S.K. и соавт., 2005). В последние годы СРБ, определяемый в сыворотке высокочувствительными (вч) иммунохимическими методами (вч-СРБ), рассматривается в качестве лабораторного маркера субклинического воспаления сосудистой стенки и возможного патогенетического медиатора тромбоза и атеротромбоза при АФС и СКВ (Насонов Е.Л., 2004). Поэтому изучение связи между сывороточной концентрацией вч-СРБ и клинико-лабораторными проявлениями АФС представляет несомненный интерес. Внимание исследователей привлекает значение клеточных иммунных реакций в патогенезе АФС (Papo T. и соавт., 1994; Blank M. и соавт., 1995; Visvanathan S., McNeil H.P., 1999; Yoshida K. и соавт., 2002). Показано, что развитие АФС ассоциируется с поляризацией клеточного иммунного ответа по Th1 типу, характеризующегося β2-ГП 1 зависимым синтезом ИФНγ и ИЛ-2 CD4+ Т-лимфоцитами (Karakantza M. и соавт., 2004). Однако комплексное исследование цитокинов (ФНОα, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-18 и др.), участвующих в регуляции воспаления и антигенспецифического иммунного ответа, при АФС не проводилось. Также в рамках АФС мало изучено клинико - патогенетическое значение интегрального маркера активации клеточного иммунитета – неоптерина и Т-клеточного фактора пролиферации и дифференцировки В-клеток – рCD40 лиганда, играющих важную роль в развитии аутоиммунных заболеваний и кардиоваскулярных осложнений (Насонов Е.Л., 2004). Изучение лабораторных биомаркеров АФС представляется актуальным как с теоретических позиций в плане расшифровки иммунологических механизмов развития тромботической васкулопатии, так и с практической точки зрения для определения оптимальных подходов к диагностике, оценке активности, тяжести течения, прогноза и результатов лечения заболевания. ^ Изучить особенности иммунологических нарушений при АФС в сопоставлении с клиническими проявлениями заболевания, оценить роль лабораторных иммунологических маркеров в диагностике и оценке прогноза АФС. ^ 1. Разработать стандартный метод ИФА для количественного определения IgG/IgM аКЛ в сыворотке крови. 2. Изучить связь между уровнем аФЛ в сыворотке крови и основными клиническими признаками АФС. 3. Оценить диагностическую точность и прогностическое значение ИФА аКЛ, аβ2 - ГП I и аПТ при АФС. 4. Исследовать сывороточный уровень лабораторных маркеров активации/дисфункции эндотелия - рКМА (рVCAM-1, pICAM-1, pP- селектина, рЕ-селектина) и ФВАг при АФС и оценить их связь с клинико-лабораторными проявлениями ПАФС и СКВ с АФС. 5. Определить сывороточную концентрацию вч-СРБ и его связь с развитием повреждения сосудистой стенки при ПАФС и СКВ с АФС. 6. Изучить клинико-патогенетическое значение серологических маркеров активации клеточного иммунитета при АФС, включая цитокины и их растворимые рецепторы (ФНОα и рФНОРI, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-18), рCD40лиганд и неоптерин. ^ Впервые проведено комплексное изучение иммунологических факторов повреждения сосудистой стенки при ПАФС и ВАФС, включая исследование аутоантител (аФЛ), показателей активации клеточного иммунитета (цитокины, рCD40-лиганд, неоптерин), маркеров дисфункции эндотелия (рКМА и ФВАг) и белков острой фазы воспаления (вч-СРБ), в зависимости от основных клинических проявлений заболевания. Показано, что для диагностики и оценки прогноза АФС наиболее точными и эффективными тестами являются методы ИФА IgG аКЛ и IgG аβ2 – ГП I, причем у IgG аКЛ выше диагностическая чувствительность, а у IgG аβ2 – ГП I – диагностическая специфичность. При изучении маркеров активации эндотелия отмечена связь между гиперпродукцией рЕ-селектина у больных ПАФС и развитием венозных тромбозов и акушерской патологии. Выявлено увеличение концентрации ФВАг в сыворотках больных ПАФС и ВАФС, сопровождавшееся наличием венозных тромбозов в анамнезе и поражением клапанов сердца. Впервые установлено повышение базального уровня вч-СРБ у больных ПАФС, сопоставимое с таковым у больных ВАФС и СКВ. Показано, что при АФС увеличение концентрации вч-СРБ ассоциируется с высоким риском кардиоваскулярных осложнений и наличием артериальных тромбозов. При анализе показателей активации клеточного иммунитета продемонстрировано увеличение сывороточной концентрации Th1 цитокинов (ФНОα, ИЛ-18) и рФНО-РI при ПАФС и ВАФС; Th2 цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-10) при ВАФС. Выявлено, что повышение концентрации ИЛ-10 сопровождается уменьшением числа случаев тромбозов в анамнезе и снижением индекса повреждения, в то время как гиперпродукция ИЛ-18, ассоциируется с атеротромботическими нарушениями. При АФС установлена положительная корреляция значений рCD40 лиганда с увеличением числа случаев тромботических осложнений и наличием венозных тромбозов в анамнезе. Впервые обнаружено повышение уровня неоптерина при ПАФС и ВАФС, наиболее выраженное у больных с поражением клапанов сердца. Доказана тесная взаимосвязь между образованием антифосфолипидных аутоантител, активацией эндотелиальных клеток, нарушениями Т – клеточной иммунорегуляции и хроническим субклиническим воспалением сосудистой стенки в развитии тромботической васкулопатии при АФС. ^ На основе полученных данных определен комплекс наиболее информативных и адекватных методов ИФА аФЛ для диагностики АФС и прогнозирования риска развития тромботических осложнений и акушерской патологии при данном заболевании. Обнаружение в сыворотках больных аКЛ и/или аβ2 - ГП I классов IgG и IgM в концентрации, превышающей M+5SD у доноров (IgG аКЛ ≥25,0 GPL, IgM аКЛ ≥24,7 MPL, IgG аβ2 - ГП I ≥15,3 ЕД/мл и IgM аβ2 - ГП I ≥17,0 ЕД/мл), рекомендуется использовать в качестве лабораторных критериев диагностики АФС. Для диагностики тромбозов наиболее полезными лабораторными тестами являются ИФА IgG аКЛ и ИФА IgG аβ2 – ГП I, акушерской патологии – ИФА IgG аКЛ. Наиболее полезными прогностическими маркерами тромбозов служат положительные результаты ИФА IgG аβ2 – ГП I, ПНБ – ИФА IgG аКЛ. Повышенные уровни рЕ-селектина, ФВАг, вч-СРБ и рCD40 лиганда в сыворотках больных АФС являются дополнительными лабораторными маркерами тромботических осложнений данного заболевания. Измерение сывороточной концентрации рКМА (рVCAM-1, рЕ-селектина, рР-селектина), ФВАг, цитокинов и их растворимых рецепторов (ИЛ-6, ФНОα, рФНО-РI, ИЛ-10, ИЛ-18), неоптерина позволяет уточнить активность патологического процесса при ВАФС. ^ 1. Иммунологическими маркерами для диагностики АФС являются IgG/IgM аКЛ и IgG/IgM аβ2 – ГП I, для прогнозирования риска тромботических осложнений и акушерской патологии при АФС – IgG/IgM аКЛ и IgG аβ2 – ГП I. 2. Увеличение сывороточной концентрации рКМА и ФВАг отражает активацию/повреждение эндотелиальных клеток при АФС. 3. Повышенные уровни цитокинов, рCD40 лиганда и неоптерина в сыворотках больных АФС свидетельствуют о выраженной активации клеточного иммунитета при данном заболевании. 4. Увеличение продукции вч-СРБ является важным фактором тромбообразования при АФС. ^ Методы определения аФЛ, рКМА, ФВАг, цитокинов, неоптерина, рCD40 лиганда и вч-СРБ внедрены в работу клинических подразделений ГУ Института ревматологии РАМН, в практику ГУ Научного центра неврологии РАМН, НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГУ РКНПК Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи, ММА им. И.М. Сеченова и других лечебных учреждений г. Москвы. Материалы работы использовались в написании главы «Методы определения антител к фосфолипидам» в монографии «Патология сосудов при антифосфолипидном синдроме. Клиника, диагностика, лечение» (Е.Л. Насонов, А.А. Баранов, Н.П. Шилкина, З.С. Алекберова. – М. – Ярославль, 1995), главы «Лабораторная диагностика системных васулитов» в монографии «Васкулиты и васкулопатии» (Е.Л. Насонов, А.А. Баранов, Н.П. Шилкина. – Ярославль: Верхняя Волга, 1999), главы «Клиническое значение антифосфолипидных антител» в монографии «Антифосфолипидный синдром» (Е.Л. Насонов. – М., Литтерра, 2004), методического пособия «Современные стандарты лабораторной диагностики ревматических заболеваний» (М.: Биохиммак, 2006), главы «Лабораторная диагностика» в национальном руководстве по ревматологии (М.: Гэотар-Медиа, 2008). Публикации По материалам диссертации опубликовано 50 печатных работ: 37 статей, 13 тезисов, 11 из которых в иностранной печати. ^ Основные положения диссертации доложены на Четвертой конференции по ревматологии Северо-Западного федерального округа (Великий Новгород, 2004), научно-практической конференции «Проблема тромбозов в ревматологии» (Москва, 2004), Национальных днях лабораторной медицины России (Москва, 2004, 2005, 2006), IV Съезде ревматологов России (Казань, 2005), ежегодном Европейском конгрессе ревматологов EULAR (Вена, 2005; Амстердам, 2006), 10-ой Всероссийской конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006), научно-практической конференции «Роль воспаления в развитии ревматических заболеваний» (Москва, 2006), VIII конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007), научно-практическом семинаре «Проблемы диагностики аллергии и аутоиммунных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2007), 10-ом юбилейном научно-образовательном форуме «Кардиология - 2008» (Москва, 2008), IV Всероссийской конференции «Инновационные технологии в ревматологии» (Нижний Новгород, 2008). Первичная экспертиза диссертации проведена на заседании Ученого Совета ГУ Института ревматологии РАМН 10 апреля 2008 года. ^ Диссертация изложена на 262 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 31 отечественных и 369 зарубежных источников. Диссертация проиллюстрирована 127 таблицами и 34 рисунками. ^ Материалы и методы исследования Общая клиническая характеристика больных Обследовано 408 больных, в том числе 82 – с ПАФС (27 мужчин и 55 женщин; средний возраст 36,8±11,3 лет), 99 – с ВАФС, ассоциированным с СКВ (29 мужчин и 70 женщин; средний возраст 37,9±11,7 лет) и 227 – с СКВ без АФС (67 мужчин и 160 женщин; средний возраст 33,2±11,1 лет), наблюдавшихся в ГУ Институте ревматологии РАМН в период с 1993 по 2007 год. Группы больных не различались между собой по возрасту, однако средняя продолжительность заболевания у больных ВАФС (15,5±10,0 лет) была выше, чем у больных ПАФС (10,9±10,5 лет, p<0,001) и СКВ (9,3±8,7 лет, p<0,001). Во всех группах больных преобладали женщины. Диагноз СКВ основывался на критериях Американской Коллегии Ревматологов (Tan E.M. и соавт., 1982; Hochberg M.C., 1997). Для оценки течения и активности СКВ использовались: классификация В.А. Насоновой (1972), индекс ECLAM (Vitali C. и соавт., 1992), индекс SLEDAI (Bombardier C. и соавт., 1992), индекс повреждения SLICC/ACR (Gladman D.D. и соавт., 1996). Диагноз АФС основывался на международных диагностических критериях W.А. Wilson и соавт. (1999). ПАФС верифицировался у больных АФС при отсутствии признаков других заболеваний. Клинические и лабораторные проявления АФС в группах больных ПАФС и ВАФС представлены в табл. 1. Как следует из таблицы, преобладающими признаками АФС в обеих группах были тромбозы, а также повышенные уровни ВА и IgG аКЛ. Таблица 1 Клинические и лабораторные проявления АФС (n=181)
П р и м е ч а н и е. * - в числителе число женщин с привычным невынашиванием беременности, в знаменателе – число женщин, имевших беременность. Оценка характера течения и активности СКВ приведена в табл. 2. Большинство больных СКВ с/без АФС имели хроническое течение (57%), а также I и II степень активности заболевания (72%). Таблица 2 Характеристика течения и активности СКВ
Частота клинических и лабораторных проявлений СКВ у больных с/без АФС (с учетом анамнеза) представлена в табл. 3. Таблица 3 Клинические и лабораторные проявления СКВ
Контрольная группа состояла из 286 здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными. ^ Всем больным проводилось полное клиническое, лабораторное и инструментальное обследование с использованием стандартных методов, применяемых в ГУ Институт ревматологии РАМН. Рентгенография органов грудной клетки выполнялась в рентгенологическом отделении ГУ Института ревматологии РАМН (заведующая отделением – к.м.н. И.А.Удельнова). Электрокардиографическое, эхокардиографическое и ультразвуковое исследование внутренних органов проводились в лаборатории функциональной диагностики ГУ Института ревматологии РАМН (руководитель – д.м.н., профессор Э.С. Мач). Состояние сосудов конечностей (артерий и вен) и церебрального кровообращения оценивалось методом ультразвукового дуплексного сканирования периферических и церебральных сосудов на УЗ-аппарате «Voluson 730 Expert» (Австрия) линейным датчиком частотой излучения 7,5 MHz. Тромбозы церебральных сосудов были подтверждены проведением компъютерной и магнитно-резонансной томографии головного мозга. Исследование гематологических, биохимических показателей крови и анализов мочи проводилось унифицированным методом в биохимической лаборатории ГУ Института ревматологии РАМН (заведующая лабораторией – к.б.н. Л.Н. Кашникова). Общее иммунологическое обследование больных, включавшее определение антинуклеарного фактора методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием срезов печени крыс и НЕр-2 клеток человека; IgM-ревматоидного фактора в реакции латекс-агглютинации; иммуноглобулинов классов G,M,A методом радиальной иммунодиффузии; циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) турбидиметрическим методом с помощью преципитации 3,5% полиэтиленгликолем (молекулярная масса 6000 кДа); общей гемолитической активности комплемента CH50 по 50% гемолизу (метод Кэбот и Мейер), выполнялось в лаборатории клинической иммунологии ГУ Института ревматологии РАМН (руководитель – д.м.н., профессор А.И. Сперанский). ВА определяли по удлинению времени свертывания крови в фосфолипидзависимых коагуляционных тестах при использовании свежей цитратной плазмы, бедной тромбоцитами (Brandt J.T. и соавт., 1995; Баркаган З.С. и соавт., 2000). Скрининговыми тестами являлись активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), каолиновое время свертывания (КВС), АЧТВ с добавлением яда гадюки Рассела. Подтверждающими методами были коррекция нарушений коагуляции при добавлении ФЛ и сохранение удлинения времени свертывания при смешивании исследуемой и донорской плазмы. Тестирование ВА осуществлялось ручным методом в дубликатах с помощью наборов реагентов «Ренам» (Россия) в биохимической лаборатории ГУ Института ревматологии РАМН (заведующая лабораторией – к.б.н. Л.Н. Кашникова), а также на автоматическом коагулометре CA 560 («Sysmax», Япония) при использовании наборов реагентов LA1 (Screening Reagent) и LA2 (Confirmation Reagent) фирмы «Dade Behring» (Германия). Количественное определение IgG/IgM аКЛ в сыворотке крови в единицах GPL/MPL проводилось стандартным методом ИФА (Gharavi A.E. и соавт. 1987) в модификации с использованием калибратора собственного изготовления в пяти разведениях (1:50 – 1:800), тестированного относительно международных стандартов. Средний уровень (M±SD) IgG/IgM аКЛ в сыворотках здоровых доноров составил 4,5±4,1 GPL (n=178) и 7,2±3,5 MPL (n=87) соответственно. Для увеличения достоверности результатов определения аКЛ в качестве верхней границы нормы была принята концентрация аКЛ, превышающая средние значения данного показателя у доноров на 5 SD (M+5SD), т.е. 25,0 GPL и 24,7 MPL. Сыворотки с более высокой концентрацией IgG/IgM аКЛ рассматривали как позитивные. Выделены высоко (≥65,0 GPL и ≥45,0 MPL), умеренно (35,0-65,0 GPL и 35,0-45,0 MPL), низко (25,0-35,0 GPL и 24,7-35,0 MPL) позитивные и негативные (≤25,0 GPL и ≤24,7 MPL) уровни аКЛ. Концентрацию IgG/IgM аβ2 – ГП I в сыворотке крови определяли методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов Anti-beta-2-Glycoprotein I IgG/IgM («ORGENTEC Diagnostika», Германия). Верхняя граница нормы для IgG аβ2 – ГП I и IgM аβ2 – ГП I (М+5SD), полученная при исследовании 74 сывороток здоровых доноров, составляла 15,3 ЕД/мл и 17,0 ЕД/мл соответственно. Установлены высоко (≥60,0 ЕД/мл), умеренно (30,0-60,0 ЕД/мл), низко (15,3-30,0 ЕД/мл и 17,0-30,0 ЕД/мл) позитивные и негативные (≤15,3 ЕД/мл и ≤17,0 ЕД/мл) уровни IgG аβ2 – ГП I и IgM аβ2 – ГП I соответствено. Определение аПТ классов IgG и IgM в сыворотке крови проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов Anti-Protrombin IgG/IgM («ORGENTEC Diagnostika», Германия). Верхняя граница нормы (М+5SD) при исследовании 33 сывороток здоровых доноров составляла 10,1 ЕД/мл для IgG аПТ и 9,8 ЕД/мл для IgM аПТ, что совпадает с рекомендациями фирмы-изготовителя (10,0 ЕД/мл). Определение анДНК в сыворотке крови проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов KallestadTM Anti-dsDNA Microplate EIA («BIO-RAD Laboratories», США). Согласно рекомендациям фирмы-изготовителя за верхнюю границу нормы была принята концентрация анДНК, равная 30,0 МЕ/мл. Концентрацию рVCAM-1, рICAM-1, рP-селектина и рЕ-селектина в сыворотке крови измеряли методом ИФА с помощью коммерческих наборов реагентов Parameter human sVCAM-1, sICAM-1, sP-Selectin, sE-Selectin Immunoassay («R&D Systems», США). У здоровых доноров верхняя граница нормы (М+1SD) для рVCAM-1 составляла 881 нг/мл (n=37), рICAM-1 – 338 нг/мл (n=17), рP-селектина – 174 нг/мл (n=38), рЕ-селектина – 49,9 нг/мл (n=8). Количественное определение ФВАг в сыворотке крови проводилось твердофазным иммуноферментным методом (Баранов А.А. и соавт., 1997). Верхняя граница нормы для ФВАг (М+3SD), полученная при исследовании 69 сывороток здоровых доноров, составляла 2,48 МЕ/мл. Сывороточную концентрацию вчСРБ измеряли высокочувствительным иммунонефелометрическим методом с латексным усилением на анализаторе BN-100 («Dade Behring», Германия) при использовании реагентов CardioPhase hs CRP («Dade Behring», Германия). Чувствительность метода составляла 0,175 мг/л. Определение сывороточной концентрации ИЛ-6 и ФНО-α проводили методом ИФА с помощью коммерческих наборов реагентов Human IL-6 и TNF-α UltraSensitive ELISA («BioSource International, Inc.», США); рФНОРI, ИЛ-10, ИЛ-18 и рCD40 лиганда – используя коммерческие тест-системы Human sTNF-R (60 kDa), IL-10, IL-18, sCD40L ELISA («Bender MedSystems», Австрия). У здоровых доноров верхняя граница нормы (М+2SD) для ИЛ-6 составляла 1,58 пг/мл (n=27), ФНО-α – 2,35 пг/мл (n=20), рФНОРI – 3,04 нг/мл (n=54), ИЛ-18 – 51,7 пг/мл (n=20); концентрация ИЛ-10 не превышала 0,01 пг/мл (n=20). Верхняя граница нормы (М+1SD) для рCD40 лиганда соответствовала 7,37 нг/мл (n=36). Концентрацию неоптерина в сыворотке крови измеряли методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов Neopterin ELISA («IBL», Германия). Верхняя граница нормы (М+2SD) при тестировании 30 сывороток здоровых доноров составляла 11,7 нмоль/л. Оценка диагностической точности ИФА аФЛ осуществлялась путем расчета операционных характеристик теста: диагностической чувствительности (ДЧ), диагностической специфичности (ДС), предсказательной ценности положительного и отрицательного результатов (ПЦПР и ПЦОР), отношения правдоподобия положительного и отрицательного результатов (ОППР и ОПОР) (Реброва О.Ю., 2003). Наиболее полезными для диагностики АФС являлись лабораторные тесты с ОППР>5 и ОПОР<0,2; полезными – с ОППР>2 и ≤5, ОПОР>0,2 и ≤0,5; не имеющими пользы - с ОППР≤2 и ОПОР>0,5. Для анализа диагностической эффективности лабораторных тестов использовалась также характеристическая кривая (ROC-кривая), отражающая зависимость частоты истинно положительных результатов (чувствительность) от частоты ложноположительных результатов (1-специфичность). Клиническая информативность лабораторного теста определялась тем, насколько высоко лежит его ROC-кривая. Для оценки ROC–кривых вычислялась площадь под кривой (AUC), варьирующая от 0,5 (отсутствие диагностической эффективности теста) до 1,0 (максимальная эффективность теста). Отношение шансов (ОШ) и 95% доверительный интервал для него (ОШ, ДИ 95%) оценивались по методу Woolf (Реброва О.Ю., 2003). Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета программ «Stаtistica 6,0» («StatSoft», США), включая общепринятые методы параметрического и непараметрического анализа. При сравнении параметров с нормальным распределением применялся парный t-тест для независимых выборок, результаты представлены в виде среднего значения (М) и среднего квадратичного отклонения (SD). Для параметров, распределение которых отличалось от нормального, при сравнении двух групп использовали критерий Манна-Уитни, а при сравнении трех и более групп – критерий Краскела-Уоллеса, результаты представлены в виде медианы (Ме) с интерквартильным размахом (ИР, 25-й – 75-й процентили). Корреляционный анализ проводился по методу Спирмена. Различия считались достоверными при p<0,05. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям