Особенности структурно-функциональных свойств эритроцитов у больных хронической обструктивной болезнью легких 14. 01. 04 внутренние болезни 14. 01. 25 пульмонология

Защита диссертации состоится «04» мая 2011 года в «11» часов на заседании диссертационного совета Д 208.085.05 при ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (443079, г. Самара, пр. К. Маркса, 165 «Б»)


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (443001 г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171)


Автореферат разослан «__» ________ 2011 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор …..…………………………………………………………………….Захарова Н.О.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
^

Актуальность темы

Хроническая обструктивная болезнь лёгких (ХОБЛ) относится к числу наиболее распространённых заболеваний, в патогенезе которой действует совокупность таких факторов как воспаление, эндотелиальная дисфункция, окислительный стресс, а также состояние гипоксии тканей лёгких и других органов [Амиров Н. Х.,2007; Илькович М.М. и соавт., 2008]. Совершенствование методов диагностики и терапии хронической обструктивной болезни лёгких (ХОБЛ) является одной из наиболее сложных задач современной пульмонологии. Об этом свидетельствует неуклонный рост больных ХОБЛ во всем мире [Глобальная стратегия диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких,2006; Синопальников А. И. и соавт.,2007; Celli B.R. et al.,2004]. В настоящее время учёными всего мира диагноз ХОБЛ перестал рассматриваться как изолированное поражение лёгочной ткани. ХОБЛ- это заболевание, в котором кроме органов дыхания задействованы различные органы и системы организма, включая эритроциты (Эр) и эритропоэз. Эритроциты, являясь доминирующей частицей крови, определяют её вязкость, микрогемодинамику, потенциал транспорта кислорода, а, следовательно, и эффективность микроциркуляции [Катюхин Л. Н., 1995; Соловьева Т. Н. и соавт., 2006]. Учитывая, что состояние гипоксии органов и тканей является важным механизмом в патогенезе ХОБЛ, необходимо учитывать состояние структурно-функциональных свойств эритроцитов, определяющих их кислородтранспортную функцию. Кроме того, известно, что нарушение реологических свойств эритроцитов является определяющим звеном в патогенезе микроциркуляторных расстройств у больных с бронхолёгочной патологией [Палеев Н. Р. И соавт., 2006]. В картине общего анализа крови больных ХОБЛ встречается как эритроцитоз, так и анемия [Simalowski T. еt al., 2006]. В исследовании состояния эритроцитарного звена микроциркуляции при анемиях, осложняющих, как правило, тяжёлое течение ХОБЛ, достигнуты определённые успехи [John M. еt al., 2005], тогда как при эритроцитозе полностью неясны механизмы его образования. Эритроциты являются единственной структурой, способной транспортировать к тканям органов кислород, углекислый газ и оксид азота [Иванов Г. П., 2001], поэтому они имеют мощную систему антиоксидантной защиты (АОЗ). Детальное исследование дисбаланса оксидантных и антиоксидантных факторов в эритроцитах даёт противоречивые результаты, а у больных ХОБЛ с эритроцитозом вообще мало изучено. Известно, что структурно-функциональное состояние и метаболизм Эр, имея особенности по сравнению с таковыми факторами клеток органов и сосудистой системы [Клёнова Н. А.,2003], могут служить модельной системой для изучения патогенетических изменений в клетках тканей при различных заболеваниях [Клёнова Н. А. и соавт., 2009], в том числе и при ХОБЛ.

Исследование данной проблемы крайне важно не только в теоретическом отношении для изучения патогенеза, но и для решения практических задач, направленных на совершенствование диагностики осложнений и лечения больных ХОБЛ.

^ Цель исследования

Разработка новых аспектов патогенеза и оптимизация диагностики степени тяжести ХОБЛ на основании показателей патологических изменений метаболизма эритроцитов и структурно-функционального состояния их мембран.

^ Задачи исследования

1. Выявить степень изменения основных ферментативных, неферментативных антиоксидантов и оксидантов в эритроцитах у больных ХОБЛ II и III стадии течения; исследовать уровень окислительного повреждения гемоглобина и лактоацидоза у больных ХОБЛ.

2.Разработать индексы окислительного стресса в эритроцитах у больных ХОБЛ и на их основании установить защитную роль различных антиоксидантных систем эритроцитов.

3.Установить степень нарушения структурного состояния мембран эритроцитов больных ХОБЛ; определить корреляционные связи между показателями окислительного стресса и маркерами нарушения мембран эритроцитов у больных ХОБЛ.

4.Определить особенности структурно-функционального состояния эритроцитов у больных ХОБЛ в сочетании с вторичным эритроцитозом.

5.Разработать единый показатель, отражающий как состояние окислительного стресса, так и степень нарушения мембран эритроцитов и определить уровень его корреляционной связи со спирометрическими параметрами у больных ХОБЛ.

6. На основе интегральных показателей морфофункционального состояния эритроцитов создать алгоритм для диагностики степени тяжести ХОБЛ и определения программы лечения.

^ Научная новизна

Впервые с помощью комплекса физико-химических методов установлен различный характер и выраженность окислительного стресса мембран эритроцитов и окислительного повреждения гемоглобина в зависимости от тяжести течения ХОБЛ.

Определены особенности параметров и уровень окислительного стресса и характеристики нарушения мембран эритроцитов у больных ХОБЛ с эритроцитозом.

На основе интегральных показателей морфофункционального состояния эритроцитов разработан алгоритм для диагностики степени тяжести ХОБЛ.

^ Практическая значимость

Результаты исследования дополняют современные представления о патогенезе вторичного эритроцитоза при ХОБЛ, что позволяет повысить качество медицинской помощи таким пациентам.

Обоснована важность исследования показателей мембраносвязанного гемоглобина, активности супероксиддисмутазы и коэффициента максимальной агрегации эритроцитов для прогноза дальнейшего течения ХОБЛ.

Разработанный алгоритм, включающий в свой состав наиболее достоверные показатели структурно-функционального состояния эритроцитов, будет способствовать улучшению скрининговой диагностики тяжести течения ХОБЛ.

^ Положения, выносимые на защиту

1. 
   Изменения свободно-радикального метаболизма в эритроцитах при ХОБЛ характеризуются формированием окислительного стресса, развивающегося в эритроцитах вследствие дисбаланса оксидантных и антиоксидантных систем, интенсивность которого сопряжена с тяжестью течения заболевания.
   
2. 
   Окислительный стресс при ХОБЛ является патогенетической основой повреждения гемоглобина, нарушений структурно-функционального состояния мембран и реологических свойств эритроцитов.
   
3. 
   Эритроциты при вторичном эритроцитозе отличаются от таковых при нормоцитозе более интенсивными реакциями свободно-радикального окисления, повышенной активностью их антиоксидантных систем и более выраженными нарушениями структурно-функционального состояния мембран и реологических свойств целых эритроцитов.
   
4. 
   Оценка изменений структурно-функционального состояния эритроцитов и выраженности окислительного стресса определяется в скрининговом режиме через индекс структурно-функционального состояния эритроцитов и разработанный математический алгоритм.
   

^ Апробация диссертации

Материалы диссертации представлены на II национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2007), на научно-практической конференции «Инновации- путь к успеху» (Самара, 2009,2010), на межрегиональной конференции молодых учёных и специалистов «Аспирантские чтения» (Самара 2009,2010), XX национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2010), на X международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва,2010). Апробация диссертации проведена на совместном научном заседании кафедр госпитальной терапии с курсом трансфузиологии и фтизиатрии и пульмонологии ГОУ ВПО «СамГМУ» Минздравсоцразвития России.

По результатам проведенного исследования опубликовано 11 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

^ Внедрение результатов исследования в практику

Результаты диссертационного исследования внедрены в практику работы врачей терапевтического отделения клиники госпитальной терапии Клиник ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России, отделения пульмонологии ГУЗ «СОКБ им. М.И. Калинина».

Материалы диссертации используются в учебном процессе и включены в лекционный курс на кафедре госпитальной терапии с курсом трансфузиологии ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России.

^ Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 173 страницах машинописного текста, из которых 145- основной текст, 28 - указатель литературы. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы по описанию материалов и методов, двух глав, посвящённых собственным исследованиям, главы по обсуждению полученных результатов, выводов, практических рекомендаций. Список литературы содержит 246 наименований, из которых 115- отечественных и 131-иностранных авторов. Работа иллюстрирована 38 таблицами, 13 рисунками.
^

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Клиническая характеристика больных и методы исследования


В основу работы были положены результаты исследования 118 пациентов с хронической обструктивной болезнью лёгких, находящихся в периоде обострения в возрасте от 39 до 63 лет (средний возраст 55,25±3,85 лет). Среди них было 108 (91,53%) мужчин и 10 (8,47%) женщин. Все больные находились на обследовании и лечении в пульмонологическом отделении Самарской областной клинической больницы имени Калинина. В исследуемые группы не включали лиц с туберкулёзом, онкозаболеваниями, сахарным диабетом, а также с III и IV функциональным классом стабильной стенокардии напряжения, инфарктом миокарда, перенесённым до 6 месяцев назад, патологией щитовидной железы. Все больные поступали в клинику с признаками инфекционного обострения ХОБЛ: усилением одышки, сопровождаемой появлением дистанционных хрипов, чувством сдавления в груди. Также наблюдалось усиление кашля, происходящее на фоне изменения выделения количества мокроты, изменяющей цвет и вязкость.

Поскольку тяжесть состояния в период обострения в основном обусловлена выраженностью бронхиальной обструкции, то наряду с клиническими данными классификация тяжести течения заболевания основывалась на шкале GOLD (2006). Она основана на спирометрических показателях, которые в наших исследованиях производились на спироанализаторе КМР-АР-01 Диамант. Определяли объём форсированного выдоха за 1-ю секунду, а также индекс Тиффно. Дополнительно измеряли напряжение кислорода в крови с помощью анализатора газов крови АВ-800 FLEX. Оценивали индекс курильщика, который измерялся в единицах пачек/лет. Для оценки состояния сердечной мышцы больным регистрировали электрокардиограмму в 12 стандартных отведениях.

В рамках лабораторного обследования больным проводили общеклинические и специальные исследования. В комплекс общеклинических исследований входили общий анализ крови и мочи, а также общепринятые биохимические тесты.

Все пациенты с ХОБЛ согласно тяжести течения в периоде обострения и наличия эритроцитоза были разделены на 3 группы. В 1-ю группу включён 41 пациент со среднетяжёлым течением ХОБЛ с нормальными показателями гемоглобина и эритроцитов. 2-я группа состояла из 31 пациента также 2-й стадии течения заболевания, но с выраженным эритроцитозом. 3-ю группу составили 44 пациента тяжёлой стадии ХОБЛ без вторичного эритроцитоза. По возрасту обследуемые не различались. Индекс курильщика превышал 40 пачек/лет и был максимальным у пациентов 3-й группы.

Количество гемоглобина (Hb) и Эр было достоверно максимальным у пациентов 2-й группы. Показатель ОФВ₁, индекс Тиффно у пациентов 1 и 2 группы были ниже нормы и между собой не различались, а их наименьший уровень был отмечен в 3-й группе. Показатель Р_аО₂ был также снижен относительно нормы во всех группах. Причем у пациентов с эритроцитозом по сравнению с 1-й группой он был умеренно, но достоверно уменьшен (на 9%, р<0,05). А наименьшие значение Р_аО₂ были у больных 3 группы. В группу контроля вошли 36 практически здоровых людей, не различавшихся с другими группами по возрасту.

Методы специальных физико-химических исследований включали оценку метаболизма свободных радикалов, включающую показатели оксидантной и антиоксидантной активности Эр, а также параметры, характеризующие их структурно-функциональное состояние. Оксидантную активность определяли по содержанию малонового диальдегида (МДА), отражающего уровень свободно-радикального окисления (СРО) Эр в двух режимах: спонтанного и индуцированного окисления. Об антиоксидантной активности судили по показаниям антиоксидантных систем: активности ферментов супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, системы глутатиона, включающей восстановленный грутатион и глутатионпероксидазу, а также вспомогательные ферменты: глутатионредуктазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу и кофермент никотинамидаденилдинуклеотид фосфат восстановленный (NADPH₂).

В мембранах Эр определяли содержание липофильного АО витамина Е (α-токоферол). Окислительное повреждение Hb оценивали по содержанию метформы Hb и активности фермента его восстанавливающего-метгемоглобинредуктазы. Уровень лактоацидоза оценивали по содержанию молочной кислоты в Эр.

Структурно-функциональное состояние мембран Эр определяли по содержанию в ней холестерина и фосфолипидов и их соотношению, уровню белковых SH-групп. Микровязкость липидного бислоя, прибелковых липидов и степень кластеризации белков устанавливали методом флуоресцентного зондирования с помощью зонда пирена. О состоянии мембраносвязанных ферментов судили по величине активности ацетилхолинэстеразы и метгемоглобинредуктазы и фосфолипазы А₂. Барьерная функция определялась по показанию потенциала электродиффузионного пробоя (ЭДП) эритроцитов. Для оценки реологических свойств целых эритроцитов измеряли уровень их фильтруемости (индекс фильтруемости, ИФ) и индуцированной максимальной агрегации (коэффициент, КМАЭ). Абсорбционная функция мембраны оценивалась по накоплению в ней веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ).

Методологической основой данного исследования явились принципы научно-обоснованной медицинской практики (Котельников Г.П., А.С. Шпигель, 2000). Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.1. Для оценки достоверности различий между группами использовался t-критерий Стьюдента. При проведении корреляционного анализа применяли корреляцию Спирмена. Критическое значение уровня значимости р принималось равным 0,05.

^ Результаты исследований и их обсуждение

В эритроцитах больных ХОБЛ выявлены разнонаправленные изменения метаболизма свободных радикалов, которые определялись как тяжестью течения ХОБЛ, так и наличием эритроцитоза.

Исследование ферментов-синергистов 1-й линии антиоксидантной защиты (АОЗ) супероксиддисмутаза - каталаза показало, что у пациентов 1-й и 2-й группы регистрировалось нарастание СОД относительно значений контрольной группы соответственно на 15 (р<0,05) и 30,2% (р<0,05). При этом у пациентов с эритроцитозом значения были на 13,3% (р<0,05) выше, чем у обследуемых 1-й группы без эритроцитоза. В 3-й группе активность фермента была минимальной и приближалась к значениям контрольной группы. Активность каталазы у пациентов 1 группы возрастала относительно значений КГ соответственно на 12,7% ( р<0,05), тогда как во 2-й группе она недостоверно увеличилась только на 2% ( р>0,05). В 3-й группе активность каталазы эритроцитов была снижена на 11,7% ( р<0,05), а к значениям 1 и 2 группы соответственно на 21,6% ( р<0,05) и на 14% ( р<0,05).

Основной системой АОЗ Эр является система глутатион (GSH)-глутатионпероксидаза (ГПО). Показатели данной системы представлены в Таблице 1. Нами установлено, что концентрация GSH в эритроцитах пациентов 1-й группы была незначительно уменьшена на 1% (р>0,05) по сравнению с КГ. У пациентов 2-й группы с эритроцитозом увеличение уровня GSH достигало максимальных значений: на 13,5% выше (р<0,05), чем у пациентов КГ. В то же время у пациентов 3-й группы, содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах по сравнению с КГ имело наименьшее значение- на 14,3% (р<0,05). При этом его уровень был достоверно ниже значений у пациентов 1 и 2 группы на 11,8% (р<0,05) и на 24,5% (р<0,01) соответственно. У пациентов 1-й группы эффективность действия ГПО была незначительно снижена по отношению к КГ на 3,4% (р>0,05). Во 2-й группе, наоборот, активность ГПО была достоверно увеличена на 16,8% ( р<0,05). У пациентов 3-й группы эффективность действия фермента снизилась относительно лиц КГ на 17,8% (р<0,05), а по отношению к пациентам 1 и 2 групп соответственно на 15% ( р<0,05) и на 30% (р<0,05). Активность вспомогательных энзимов данной АОС глутатионредуктазы (ГР) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) относительно КГ максимально возрастала у пациентов 2-й группы: на 26,5%, р<0,05 и на 23,3%, р<0,05 соответственно.

Таблица 1

Показатели антиоксидантной системы восстановленный глутатион-глутатионпероксидаза эритроцитов у больных ХОБЛ

Группы	Контрольная группа n=36	Больные ХОБЛ
Показатели		1 группа n=43	2 группа n=31	3 группа n=44
GSH, МкМ/г Нb/л	20,12±0,88	19,61±0,81 р1>0,05	22,93±0,95* р2<0,05	17,31±0,55* р3<0,05
ГПО, МкМ/г Нb/л/ мин	208±9,3	201±11,5 р1>0,05	243±10,2* р2<0,01	171±8,5* р3<0,05
Активность ГР, МкМ/г Нb/мин	21,13±0,93	23,82±1,05* р1<0,05	26,74±1,23* р2<0,05	16,11±0,85* р3<0,01
Активность Г-6-ФДГ, МкМ/г Нb/мин	15,02±0,65	16,14±0,54 р1>0,05	18,52±0,61* р2<0,05	12,51±0,51* р3<0,05

Примечание: здесь и далее ^*- обозначение наличия достоверности различий по сравнению с контрольной группой.

р₁, р₂, р₃ -показатели значимости достоверности различий соответственно между 1 и 2, 2 и 3, 3 и 1 группами.

Функционирование тиоловой ( GSH-ГПО) АОС тесно сопряжено с метаболизмом липофильного неферментативного антиоксиданта витамина Е. Его содержание в мембранах Эр 1-й и 2-й группы умеренно, но достоверно снижалось соответственно на 11,5% ( р<0,05) и 11,4% ( р<0,05). У пациентов 3-й группы тяжелое течение ХОБЛ сопровождалось значительным (на 23,3%, р<0,01 ) падением концентрации витамина Е.

Интенсивность реакций свободно-радикального окисления (показатель содержания малонового диальдегида, МДА) в эритроцитах, протекающих в спонтанном режиме в группах ХОБЛ прогрессирующе повышалась относительно КГ соответственно на 21,7% (р<0,05), 46% (р<0,05) и 76,5% (р<0,01). Что касается индуцированного in vitro СРО, то его активность в модельной системе желточные липопротеиды- ионы Fe⁺⁺ прогрессивно возрастала в группах соответственно на 29,7%(р<0,05), 62,6%(р<0,05) и на 100,7%(р<0,01) [Таблица 2].

Таблица 2

Содержание малонового диальдегида в эритроцитах, полученное в спонтанном и индуцированном режимах у больных ХОБЛ

Группы	Контрольная группа n=36	Больные ХОБЛ
Показатели		1 группа n=43	2 группа n=31	3 группа n=44
Малоновый диальдегид, мкМ/г Hb в спонтанном режиме	1,15±0,08	1,40±0,10* р1<0,05	1,68±0,12* р2<0,05	2,03±0,15* р3<0,01
МДА индуцированный, мкМ/г Hb	4,01±0,34	5,22±0,41* р1<0,05	6,52±0,47* р2<0,05	8,05±0,68* р3<0,01

Сравнение полученных результатов показало, что показатель МДА индуцированный (МДА_инд) является более чувствительным маркером окислительного стресса в эритроцитах, чем уровень МДА, полученный в спонтанном режиме.

При парном корреляционном анализе изменений окисляемости эритроцитов с основными показателями АО систем (Рис.1) у пациентов 1-й и 2-й групп были установлены сильные прямые связи (кроме витамина Е) коррелируемых величин, что подтверждает факт феномена индукции антиоксидантных (АО) ферментов умеренно повышенной продукцией


Рис. 1 Коэффициенты парной корреляции содержания МДА с

компонентами антиоксидантных систем эритроцитов больных ХОБЛ

Примечание: здесь и далее + -обозначение достоверности парной корреляции.


активных кислородных метаболитов. И, наоборот, у пациентов 3-й группы все корреляционные взаимосвязи были отрицательными, что свидетельствует о подавлении активности АО-ферментов при выраженном окислительном стрессе. Тогда как связи МДА- витамин Е во всех группах были отрицательными, что показывает его повышенный расход в реакциях свободно-радикального метаболизма особенно у обследуемых с тяжёлой стадией ХОБЛ.

Учитывая, что в составе АО защиты Эр действуют 2 ферментативных системы и витамин Е, нами разработаны индексы окислительного стресса (ИОС), отражающие «вклад» каждой из данных систем в единый процесс АОЗ. Формулы расчета данных индексов представлены ниже.

1. ИОС₁=[ МДА_инд/СОД×каталаза ]×1000000 (У.Е.)

ИОС₁ рассчитывался по формуле 1. Значение данного показателя в 1-й группе к данным КГ было умеренно и недостоверно увеличено на 4% (р>0,05), что свидетельствовало о наличии в эритроцитах пациентов 1-й группы значительной активности АОС СОД- каталаза, которая практически была способна в значительной степени стабилизировать развившийся в эритроцитах уровень окислительного стресса. Тогда как у обследуемых 2-й и, особенно, 3-й групп значения ИОС₁ прогрессирующе возрастали: соответственно на 26,7% (р<0,05) и на 122% (р<0,01). В свою очередь ИОС₁ в 3-й группе был больше его значений в 1-й и 2-й группах соответственно на 108 (р<0,01) и на 75% (р<0,01) (Рис.2).

Рис. 2 Значения индексов окислительного стресса эритроцитов в

группах ХОБЛ

Эти данные свидетельствуют, что у пациентов 2-й и, особенно, 3-й группы имел место дисбаланс между уровнями оксидантной и антиоксидантной активности, в результате которого в эритроцитах развивался некомпенсированный окислительный стресс.

2. ИОС₂=[ МДА_инд^ /GSH×ГПО ]×1000 ( У. Е.)

Уровень ИОС₂ для лиц КГ составил 0,95±0,08 У. Е. У пациентов 1-й,

2-й и 3-й групп величина данного показателя сравнительно со значением КГ возрастала соответственно на 36,8%(р<0,05), на 24% ( р>0,05), и на 158% (р<0,01). Причем ИОС₂ в 3-й группе превышал таковой у пациентов 1-й и 2-й групп на 86% (р<0,05) и на 107,6% (р<0,05). Таким образом, у пациентов 1-й и 3-й групп наблюдался окислительный стресс в эритроцитах в результате нарастания оксидантной активности и снижения эффективности действия антиокислительной системы восстановленный глутатион- глутатионпероксидаза. Во 2-й группе значение ИОС₂ к КГ было недостоверным (р>0,05), что может свидетельствовать о существенных компенсаторных резервах данной системы у пациентов 2-й группы (Рис. 2).

3. ИОС₃=[ МДА_инд /Содержание вит.Е]×10 ( У. Е.)

Значения данного индекса также прогрессирующе возрастали соответственно группам на 42,8%(р<0,05), 68,7% (р<0,05) и на 150% (р<0,01) (Рис. 2).

Нами также изучено состояние уровня лактоацидоза в эритроцитах больных ХОБЛ, который активирует реакции СРО и ингибирует реакции метаболизма. Содержание молочной кислоты (МК) в 1-й и 2-й группах было умеренно повышено соответственно на 13,4%(р<0,05) и 12% (р<0,05). Тогда как в 3-й группе уровень лактоацидоза был значительно увеличен (на 34,2%, р<0,01). Таким патологически значимым лактоацидоз формируется только у больных 3-й группы с тяжёлым течением ХОБЛ.

Известно, что активация СРО повреждает внутреннее содержимое в клетке, каковым в эритроцитах является гемоглобин. При этом в норме в Эр содержится 1-2% метгемоглобина (MetHb). Концентрация метформы гемоглобина в Эр больных ХОБЛ относительно значений КГ возрастала соответственно группам на 17,1%(р<0,05), 30,4%(р<0,05) и 80,7% (р<0,01). Полученные данные свидетельствуют о существенном ускорении процессов аутоокисления гемоглобина эритроцитов, особенно у пациентов 3-й группы.

Восстановление метформы гемоглобина осуществляется в эритроцитах с помощью NADH-метгемоглобинредуктазы (MetHb-редуктаза), энзима, локализованного как в мембранах, так и в цитозоле клетки. В 1-й группе активность фермента не отличалась от значений КГ, тогда как в эритроцитах пациентов 2-й группы она была компенсаторно увеличена относительно КГ на 12,9% (р<0,05) и, наоборот, у пациентов 3-й группы активность энзима снижалась на 25,2% (р<0,05).

Парные корреляционные связи MetHb с активностью СРО и МК были сильными и высокодостоверными, что указывало на свободно-радикальный механизм аутоокисления Hb в метгемоглобин у всех групп обследуемых, чему способствует состояние лактоацидоза (у пациентов 3-й группы).

Характеристика липидного бислоя мембраны включала определение в ней холестерина (ХС), фосфолипидов (ФЛ), а также микровязкости матричных (J₃₃₄) и прибелковых липидов (J₂₈₆).

Соотношение ХС/ФЛ является важным показателем состояния мембраны. У пациентов 1 и 2 группы повышение показателя ХС/ФЛ осуществлялось за счет достоверного увеличения в составе мембран молекул холестерина соответственно на 15% (р<0,05) и на 22% (р<0,05), тогда как содержание ФЛ имело отчетливую тенденцию к снижению. Тогда как у пациентов 3 группы повышение параметра ХС/ФЛ осуществлялось вследствие как повышения уровня ХС (на 39,5%, р<0,01), так и снижения содержания мембранных фосфолипидов (на 18%, р<0,05). Уровень микровязкости липидного бислоя и, особенно, прибелковых липидов в группах прогрессирующе возрастали от 1-й группы к 3-й (Рис. 3). Рис.3 Показатели содержания ХС, отношения ХС/ФЛ и микровязкости липидов мембран эритроцитов


Парный корреляционный анализ показал, что микровязкость как матричных, так и прибелковых липидов мембран эритроцитов находится в прямой зависимости от содержания в липидах мембраны молекул холестерина и активности реакций СРО. Максимум силы связи наблюдался у пациентов 3 группы.

Следует отметить, что у пациентов 2-й группы микровязкость липидов мембраны Эр, как и уровни ХС и активности СРО были достоверно выше, чем аналогичные параметры у пациентов 1-й группы также со II стадией течения ХОБЛ.

Состояние белковой фракции мембран эритроцитов изучали по уровню кластеризации (фрагментации) белковых структур и содержанию в них активных SH-групп. Самый высокий уровень кластеризации белков на 29,8%, р<0,001 выше значений КГ) при низком содержании SH-групп (на 37,0%,р<0,01 ниже КГ) наблюдались у пациентов 3-й группы. А у пациентов 1-й и 2-й групп степень кластеризации белков составляла соответственно только 9% (р<0,05) и 16% (р<0,05), а концентрация SH-групп была уменьшена на 11% (р<0,05), и 22% (р<0,05), а в 3-й группе- на 37% (р<0,01).

Активация фосфолипазного гидролиза в мембранах эритроцитов играет важную роль в повреждении и даже гибели клетки. У пациентов 1-й и 2-й группы в период обострения ХОБЛ эффективность действия фермента была увеличена относительно значений КГ соответственно на 15,3% (р<0,05) и на 25% (р<0,05). Однако, наибольший уровень активности фосфолипазы А₂ Эр наблюдался у пациентов 3 группы: на 47,4% относительно КГ.

Вещества низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ) образуются из белков путём активного протеолиза и являются потенциально токсическими соединениями. Динамика содержания ВНСММ в эритроцитарной мембране находится в прямой связи с показателями кластеризации белков, мембраносвязанным гемоглобином и с фосфолипазной активностью мембраны, и в обратной зависимости с содержанием в эритроцитах SH-групп белков и метгемоглобинредуктазой, что показывает взаимосвязь протекающих в мембране эритроцитов процессов.

Рост скорости метгемоглобинообразования в эритроцитах наряду с недостаточностью их редуктазных систем может сопровождаться увеличенной фиксацией MetHb в структурные компоненты мембраны, образуя мембраносвязанный гемоглобин (МсвHb), что изменяет структурно-функциональное состояние эритроцитов. Содержание МсвHb эритроцитов у больных ХОБЛ прогрессирующе возрастало по отношению к значениям КГ соответственно группам на 17% (р<0,05), 36,6% (р<0,05) и на 90% (р<0,01) [Таблица 3].

Таблица 3

Показатели МсвHb, потенциала ЭДП, ИФ, КМАЭ и ИСФ_эр

у больных ХОБЛ

Группы	Контрольная группа n =36	Больные ХОБЛ
Показатели		1 группа n =43	2 группа n =31	3 группа n =44
Содержание MсвHb, %	5,54±0,32	6,48±0,38* р1<0,05	7,57±0,43* р2<0,05	10,52±0,58* р3<0,01
Потенциал ЭДП, мВ	63,86±2,15	57,79±1,53* р1<0,05	54,08±1,47* р2<0,05	48,13±1,85* р3<0,01
Индекс фильтруемости, У. Е.	0,966±0,038	0,858±0,036* р1<0,05	0,780±0,025* р2<0,05	0,667±0,026* р3<0,01
Коэффициент максимальной агрегации, %	32,25±1,45	46,52±2,74* р1<0,05	57,95±3,81* р2<0,05	74,65±4,59* р3<0,01
ИСФэр У. Е.	11,41±1,25	7,68±0,85* р1<0,05	5,67±0,53* р2<0,05	3,06±0,35* р3<0,01

При корреляционном анализе в парах МсвHb-МДА, МсвHb- MetHb эритроцитов наблюдалась достоверная положительная корреляция, свидетельствующая, что увеличение MetHb и прогрессирующая активация СРО способствует встраиванию MetHb в мембрану.

Барьерная функция мембраны обеспечивает полную пассивную непроницаемость для большинства химических соединений и измеряется через потенциал электродиффузионного пробоя (ЭДП). У пациентов 1-й группы потенциал ЭДП по сравнению с КГ снижался на 10,5% (р<0,05), у пациентов 2-й и 3-й групп на 15,3% (р<0,05) и 24,7% (р<0,05) соответственно.

При корреляционном анализе во всех группах установлен высокий уровень обратной связи потенциала ЭДП с активностью СРО (МДА), что подтверждает влияние окисленных метаболитов липидов, включая окисленный ХС, на нарушение барьерных свойств мембран клеток.

Реологические свойства эритроцитов, включающие способность к деформируемости и агрегируемости, определяли через индекс фильтруемости (ИФ) и коэффициент индуцированной максимальной агрегации (КМАЭ). Значение ИФ в 1-й и 2-й группах было достоверно снижено соответственно на 10% (р<0,05) и 20% (р<0,05), а минимальные значения наблюдались у пациентов 3-й группы.

Показатели КМАЭ в 1-й и 2-й группах относительно КГ возрастали на 44,2% (р<0,05) и на 79,7% (р<0,05), причем между группами была достоверная разница, а максимальный уровень КМАЭ наблюдался у пациентов 3-й группы.

Для улучшения количественной оценки структурно-функционального состояния мембран эритроцитов нами предложен интегральный индекс ИСФ_эр, который рассчитывается по формуле:

ИСФ_эр =ЭДП×ИФ/МсвHb (У. Е.).

Значения ИСФ_эр достоверно прогрессирующе снижались относительно КГ соответственно группам на 32,7% (р<0,05), 50,3% (р<0,01) и на 73,2% (р<0,01).

При корреляционном анализе [Таблица 4] отмечается сильный достоверный положительный уровень корреляции ИСФ_эр с входящими в него показателями, что доказывает высокий значимый уровень информативности данного индекса. Также сильные, но отрицательные связи установлены в паре ИСФ_эр- МДА, что свидетельствует о свободно-радикальных механизмах нарушений структурно-функционального состояния эритроцитов при ХОБЛ. В парах ИСФ_эр-J₃₃₄ и ИСФ_эр- I_кл отмечены сильные положительные связи, что свидетельствует о тесной патогенетической связи функционального состояния мембраны со степенью физического состояния липидного матрикса и белковой стромы, что приводит к ухудшению реологических свойств эритроцитов. И, наконец, наличие достоверной положительной корреляции в паре ИСФ_эр-ОФВ₁ позволяет косвенно судить не только о тяжести ХОБЛ, но и о степени бронхиальной обструкции.

На базе показателей ИФ, КМАЭ и ЭДП был разработан математический алгоритм для диагностики тяжести течения ХОБЛ. Таблица 4

Коэффициенты корреляции индекса структурно-функционального состояния эритроцитов со структурными параметрами мембран и метаболитами СРО эритроцитов

Группы	Больные ХОБЛ
Показатели	1 группа n=43	2 группа n=31	3 группа n=44
ИСФэр-МДА	-0,546+	-0,680+	-0,745+
ИСФэр -вит Е	0,425+	0,553+	0,673+
ИСФэр -SH-группы	0,389+	0,511+	0,605+
ИСФэр -ЭДП	0,626+	0,701+	0,698+
ИСФэр -ИФ	0,608+	0,738+	0,713+
ИСФэр - ИОС1	-0,592+	-0,738+	-0,807+
ИСФэр -ИОС2	-0,123	-0,195	-0,705+
ИСФэр –ИОС3	-0,580+	-0,635+	-0,715+
ИСФэр -МсвHb	-0,803+	-0,830+	-0,798+
ИСФэр - I334	0,609+	0,780+	0,851+
ИСФэр - Iкл	0,585+	0,618+	0,825+
ИСФ-ОФВ1	0,392+	0,451+	0,635+

ВЫВОДЫ

1. 
   При различных стадиях ХОБЛ в периоде обострения независимо от количественного содержания эритроцитов в них развивается окислительный стресс с дисбалансом между интенсивностью оксидантных реакций и мощностью антиоксидантных систем эритроцитов, сопряженный с тяжестью клинического течения заболевания и степенью бронхиальной обструкции.
   
2. 
   С помощью разработанных индексов окислительного стресса установлено, что при среднетяжёлом течении ХОБЛ с нормоцитозом наиболее активна антиоксидантная система супероксиддисмутаза-каталаза; с выраженным эритроцитозом─супероксиддисмутаза и антиоксидантная система восстановленного глутатиона; при тяжёлом течении все 3 антиоксидантных системы находятся в состоянии декомпенсации.
   
3. 
   Окислительный стресс вызывает зависимое от тяжести заболевания нарушение реологических свойств целых эритроцитов и формирование перекисно-модифицированной мембраны эритроцитов, что подтверждено выявленным накоплением окисленного холестерина, мембраносвязанного гемоглобина, веществ средней и низкой молекулярной массы, продуктов активированного фосфолипазного гидролиза, фрагментацией белковых структур со снижением активности мембраносвязанных ферментов и барьерной функции мембраны.
   
4. 
   Определён интегральный показатель структурно-функционального состояния эритроцитов, включающий такие параметры как индекс фильтруемости, потенциал электродиффузионного пробоя, содержание мембраносвязанного гемоглобина, который позволяет оценить интенсивность окислительного стресса в эритроцитах и степень нарушения структурно-функционального состояния мембраны и находится в прямой корреляционной зависимости от степени бронхиальной обструкции при ХОБЛ.
   
5. 
   Нарушения состояния эритроцитов при обострении ХОБЛ с вторичным эритроцитозом по сравнению с нормоцитозом характеризуются более интенсивными реакциями свободно-радикального окисления с повышенной активностью антиоксидантных систем и более выраженными изменениями структурно-функциональных свойств эритроцитов.
   
6. 
   Для диагностики степени тяжести течения ХОБЛ предложен математический алгоритм, включающий интегральные показатели структурно-функционального состояния целых эритроцитов: индекс фильтруемости, коэффициент максимальной агрегации и потенциал электродиффузионного пробоя.
   

^ ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. 
   Для специализированных пульмонологических отделений и центров для прогноза дальнейшего течения хронической обструктивной болезни лёгких мы рекомендуем включать в план обследования такие показатели как мембраносвязанный гемоглобин, активность супероксиддисмутазы и коэффициент максимальной агрегации эритроцитов.
   
2. 
   Для повышения качества дифференциальной диагностики стадий ХОБЛ целесообразно использовать разработанный математический алгоритм, включающий показатели индекса фильтруемости, коэффициента максимальной агрегации и потенциала электродиффузионного пробоя.
   
3. 
   Для оценки патогенности вторичного эритроцитоза при ХОБЛ и необходимости проведения мероприятий по его устранению рекомендуется использовать показатели мембраносвязанного гемоглобина и индекса структурно-функционального состояния эритроцитов.
   
4. 
   Для определения степени эндогенной интоксикации предложено использовать определение в эритроцитах веществ низкой и средней молекулярной массы.
   
5. 
   Проведение антиоксидантной терапии с назначением N-ацетилцистеина в адекватных высоких дозах должно начинаться с ранних стадий ХОБЛ и особенно в период обострения заболевания.
   

^ Список работ, опубликованных по теме исследования

1. 
   Давыдкин И. Л. Вторичные эритроцитозы в практике врача первичного звена / И. Л. Давыдкин, Т. Ю. Степанова, Н. А. Мишина //Профилактика и прогнозирование развития заболеваний сердечно-сосудистой системы у детей с отягощённым семейным анамнезом: Сборник научных работ межрегиональной научно-практической конференции.-Самара.-2007.-С. 115-118
   
2. 
   Нарушение структурно-функциональных свойств эритроцитов у больных ХОБЛ на фоне эритроцитоза [Текст] / И.Л. Давыдкин, Т.Ю. Степанова, В.И. Купаев, Е.С. Рогова, Н.А. Мишина // II Национальный конгресс терапевтов. Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации: сб. тр. конгресса. - М., 2007. - С. 59.
   
3. 
   Особенности ХОБЛ на фоне эритроцитоза [Текст] / И.Л. Давыдкин, Т.Ю. Степанова, В.И. Купаев, Н.А. Мишина, Е.С. Рогова // XVII Национальный конгресс по болезням органов дыхания: сб. тр. конгресса. - Казань, 2007. - С. 236.
   
4. 
   Роль дисфункции эндотелия в патогенезе внутренних болезней [Текст] / В.И. Купаев, О.Е. Данилова, М.А. Анипченко, Н.А. Мишина [и др.] // Основы клинической гемостазиологии: монография / И.Л. Давыдкин, В.А. Кондурцев, Т.Ю. Степанова, С.А. Бобылев. - Самара: ООО Офорт, 2009. – С. 62-77.
   
5. 
   Структурно-функциональные свойства эритроцитов периферической крови [Текст] / И.Л. Давыдкин, А.В. Селезнёв, Е.П. Ромашева, Н. А. Мишина // Основы клинической гемостазиологии: монография / И.Л. Давыдкин, В.А. Кондурцев, Т.Ю. Степанова, С.А. Бобылев. - Самара: ООО Офорт, 2009. – С. 77-96.
   
6. 
   Мишина, Н.А. Патогенетическая связь между тяжестью течения ХОБЛ, индексом курильщика и системными изменениями показателей красной крови [Текст] / Н.А. Мишина // Аспирантские чтения-2009: тр. региональной конф. Молодые учёные - медицине. - Самара, 2009. - С. 132-135.
   
7. 
   Мишина, Н.А. Состояние эритроцитарного звена при ХОБЛ у больных Самарской области [Текст] / Н.А. Мишина, В.И. Купаев, И.Л. Давыдкин // Инновации - путь к успеху: сб. науч. работ науч.-практ. конф. - Самара, 2009. - С. 109-111.
   
8. 
   Мишина, Н.А. Особенности формирования окислительного стресса в эритроцитах крови у больных хронической обструктивной болезнью лёгких [Текст] / Н.А. Мишина // Аспирантский вестник Поволжья. - 2009. - № 7-8. - С. 42-47.
   
9. 
   Мишина, Н.А. Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов крови у больных ХОБЛ с выраженным эритроцитозом [Текст] / Н.А. Мишина // Аспирантский вестник Поволжья. - 2010. - № 7-8. - С. 64-69.
   
10. 
    Мишина, Н.А. Оксидантно-антиоксидантный статус эритроцитов при хронической обструктивной болезни лёгких [Текст] / Н.А. Мишина, И.Л. Давыдкин, В.И. Купаев // Вестник Российского университета дружбы народов. - 2010. - № 4. - С. 354-357.
    
11. 
    Купаев, В.И. Состояние оксидантных и антиоксидантных систем эритроцитов крови у больных ХОБЛ [Текст] / В.И. Купаев, Н.А. Мишина, И.Л. Давыдкин // XX Национальный конгресс по болезням органов дыхания: сб. тр. конгресса. - М., 2010. - С. 429-430.
    

^ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АО- антиоксидантный

АОС – антиоксидантная система

АОЗ - антиоксидантная защита

ВНСММ - вещества низкой и средней молекулярной массы

ГПО - глутатионпероксидаза

ГР - глутатионредуктаза

Hb - гемоглобин

Г-6-ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

GSH - восстановленный глутатион

ИОС - индекс окислительного стресса эритроцитов

ИСФ_эр- индекс структурно-функционального состояния эритроцитов

ИФ - индекс фильтруемости

КГ- контрольная группа

КМАЭ - коэффициент индуцированной максимальной агрегации эритроцитов

MetHb - метгемоглобин

МсвHb - мембраносвязанный гемоглобин

МДА - малоновый диальдегид

МК- молочная кислота

МСР- метаболизм свободных радикалов

NАDРН₂- никотинамидаденилдинуклеотид восстановленный

ОС- окислительный стресс

СОД - супероксиддисмутаза

СРО - свободнорадикальное окисление липидов

ФЛ - фосфолипиды

ФЛА₂- фосфолипаза А₂

ХОБЛ- хроническая обструктивная болезнь лёгких

ХС - холестерин

ЭДП - электродиффузионный пробой

Эр- эритроциты