Физические, химические и биологические свойства бав. Физические свойства

^ Хроматографический анализ.

Для разделения многокомпонентных смесей, какими являются извлече­ния из сырья, для очистки и идентификации соединений используют хроматографию.

По механизму, лежащему в основе разделения, различают адсорбцион­ную, распределительную, ионообменную и газожидкостную хроматографию. Чаще используют распределительную восходящую хроматографию на бумаге и в тонком слое сорбента - силикагель, окись алюминия, различные по­лимеры (неподвижная фаза). В качестве подвижной фазы используют систему растворителей. Для эффективного разделения имеет значение подбор компонентов подвижной фазы.

Руководствуются элюотропным рядом растворителей по Шталю (гексан, гептан, циклогексан, четыреххлористый углерод, бензол, хлороформ, эфир, этилацетат, пиридин, ацетон, этанол, метанол, вода). Растворители расположены в порядке возрастания полярности.

Система растворителей и методика указаны в нормативной документа- ции на сырье. Чаще используют: бутанол-уксусная кислота-вода (БУВ) 4:1:5 4:1:2; хлороформ-метанол 1:9, 2:8; уксусная кислота-вода 15:85.

При хроматографировании анализируемые вещества образуют на бумаге или пластинке зоны или пятна, которые обнаруживают по их свечению в ультрафиолетовом свете. В зависимости от химической природы вещества буде наблюдаться характерная флюоресценция. Достоверность идентификации сырья методом хроматографии повышается, если полученную хроматограмму проявить хромогенными реактивами. Используют реактивы для качественных реакций, которые дают специфические, устойчивые окраски.

Методом хроматографии на бумаге подтверждают подлинность сырья, содержащего флавоноиды (трава череды, листья вахты трехлистной, корни стальника), алкалоиды, антраценпроизводные, кумарины.

В тонком слое сорбента на пластинках «Силуфол» идентифицируют са-понины (корни аралии и женьшеня), флавоноиды (трава хвоща полевого, цветки и плоды боярышника), фенологликозиды (корневища и корни родиолы розовой), витамины (листья крапивы, кора калины), лигнаны, иридоиды.

Широко используют все методы хроматографии в научно- исследовательских целях для выделения и анализа всех биологически активных веществ лекарственных растений.

^ При анализе побегов багульника болотного (ГФ—Х1) и его эфирного масла, используемых для производства препарата «Ледин», применяют метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Метод ГЖХ высокочувствителен, универсален, специфичен и позволяет автоматизировать процесс контроля. Недвижной фазой является жидкость, нанесенная на твердый инертный носитель, подвижной фазой является газ. Разделение компонентов происходит за счет различной растворимости компонентов эфирного масла в неподвижной фазе (жидкости).

Компоненты перемещаются по неподвижной фазе с различной скор , стью, в результате чего выходят друг за другом в потоке газа-носителя. В качестве газа-носителя применяют азот, гелий, водород. Анализ проводится в различных газовых хроматографах марки ЛХМ-72, "Хром-4" с плазменным ионизационным детектором с применением внутреннего стандарта. Хроматограмма записывается на диаграммной ленте в виде пиков.

В последнее время успешно развивается высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Это вариант колоночной хроматографии на полиамиде, но подвижная фаза (жидкость) проходит через колонку с большой скоростью за счет высокого давления. Это удобно для разделения, качественного и количественного анализа нелетучих термолабильных соединений (например, сердечные гликозиды).

Подлинность сырья, содержащего горечи, подтверждает органолептиче-ский показатель - горький вкус. Показатель горечи - это наибольшее разведе­ние водного извлечения из 1 г сырья или препарата, при котором ощущается горький вкус. В качестве стандарта используется раствор хинина (1:200 000). В настоящее время этот показатель используется только в поисковых работах.


^ Методы количественного определения БАВ.

Методики определения количественного содержания действующих ве­ществ описаны в соответствующей частной нормативной документации. Выбор метода зависит от физических и химических свойств БАВ. Используют гравиметрические (весовые), титриметрические (объемные) и физико-химические (инструментальные) методы анализа.

^ Гравиметрические методы.

Гравиметрические (весовые) методы основаны на избирательной различ­ной растворимости биологически активных веществ в воде и неполярных орга­нических растворителях. Применяют для сырья, содержащего гликозиды, на­пример, полисахариды (хорошо растворимы в воде и нерастворимы в крепких спиртах - осаждаются 95% этанолом), сапонины (растворимы в метиловом спирте и не растворимы в диэтиловом эфире и ацетоне); лигнаны, дубильные вещества (осаждение желатином, солями тяжелых металлов или адсорбция кожным порошком); алкалоиды, выделяемые в виде солей или в виде основа­ний.

Методы просты в исполнении, но длительны, т.к. выделившийся осадок отделяют фильтрованием или центрифугированием, высушивают и доводят до постоянной массы. Кроме того, метод дает завышенные результаты, потому что, вместе с БАВ осаждаются и сопутствующие вещества. Но для некоторых видов сырья, например, содержащего полисахариды, этот метод наиболее специфи­чен.

Гравиметрический метод предложен в ГФ-Х1 на листья подорожника большого, траву череды, слоевища ламинарии; в частных НД - на сырье без­временника, дурмана индейского, плауна-баранца.

^ Титриметрические методы.

Титриметрические (объемные) методы основаны на химических свойст­вах биологически активных веществ:

1. На их способности легко окисляться:

- перманганатом калия (дубильные вещества);

- раствором йода (простые фенольные соединения - арбутин);

- 2,6-дихлорфенолиндофеолятом натрия (аскорбиновая кислота).

2. На основных свойствах основаны титриметрические методы определения алкалоидов. Алкалоиды ведут себя как основания и могут быть определены путем: |

- прямого титрования (например, сырье анабазиса, софоры толстоплодной, чилибухи);

- обратного титрования (сырье белены, дурмана, красавки, трава термопсиса, корневища с корнями чемерицы) растворами кислот.

^ Слабые основания определяют методом кислотно-основного титрования и в неводных средах, где титрантом служит хлорная кислота. Точку эквивалентности устанавливают по индикатору или потенциометрически (ГФ-Х1 - трава чистотела — метод неводного потенциометрического титрования).

Титриметрические методы экономичны, быстры в исполнении, но недостаточно точны и дают завышенные результаты. С их помощью можно определить только сумму биологически активных веществ.


^ Физико-химические методы.

Наиболее точны и высокочувствительны фотометрические методы (фотоколориметрия и спектрофотометрия), основанные на измерении количества света, поглощенного веществом, суммой веществ или комплексом вещества в видимой, ультрафиолетовой и инфракрасной области спектра. Используют фотометрические методы для определения почти всех групп биологически актив­ных веществ (сердечные гликозиды, экдистероны, сапонины, кумарины, хромоны, лигнаны, флавоноиды, антраценпроизводные, дубильные вещества, ал­калоиды, каротиноиды).

^ Фотоэлектроколориметрические методы основаны на измерении степени поглощения немонохроматического (полихроматического) света на довольно широком участке спектра окрашенных растворов с помощью фотоэлектроколориметра. Для получения окрашенных соединений используют реактивы, дающие яркие, устойчивые окраски; на флавоноиды, кумарины, фенологликозиды проводят реакцию образования азокрасителя с диазотированными сульфаниламидами (ГФ-Х1 - листья вахты, корневища и корни родиолы розовой),

Для анализа алкалоидов используют частные цветные реакции, основанные на окислении, конденсации и дегидратации алкалоидов концентрированными кислотами (коробочки мака, трава мачка желтого).

Антраценпроизводные дают вишнево-красное окрашивание со щелочами (кора крушины, корни ревеня, корневища и корни марены красильной).

^ Спектрофотометрические методы основаны на способности веществ и их окрашенных продуктов реакции избирательно поглощать монохроматический свет в определенной области спектра. Такими свойствами обладают флавоноиды, кумарины, антраценпроизводные, сапонины, индивидуальные алка­лоиды, экдистероны. Измерение проводят с помощью спектрофотометра. Для большинства видов сырья, содержащих флавоноиды, измеряют:

- собственное поглощение суммы флавоноидов (ГФ-Х1 - цветки бес­смертника, цветки пижмы);

- поглощение окрашенного комплекса с алюминия хлоридом (трава гор­ца перечного, горца птичьего, зверобоя, листья сумаха, скумпии).

Для сырья, содержащего антраценпроизводные, используют реакцию со щелочью (листья сенны).

Для сырья, содержащего фенологликозиды, используют реакцию диазо-тирования (корневища и корни родиолы розовой).

Наиболее точными являются хроматоспектрофотометрические методы, основанные на разделении веществ при помощи хроматографии с последую­щим их определением спектрофотометрически. Можно определять количест­венное содержание как суммы, так и индивидуальных веществ. Применяют для определения индивидуальных алкалоидов (цитизин в траве термопсиса очередноцветкового, берберин в корнях барбариса), флавоноидов (плоды и цветки боярышника, трава сушеницы), кумаринов (плоды амми большой), ксантонов (трава золототысячника), ланатозидов в сырье наперстянки шерстистой.

Реже для анализа лекарственного растительного сырья применяется флюорометрия, полярография, денситометрия, амперометрия, кондуктометрия.

^ Определение эфирного масла.

Количество эфирного масла в сырье определяют при приемке сырья и в процессе его хранения.

Методы количественного определения основаны на легкой летучести эфирных масел и способности их перегоняться с водяным паром. В зависимо­сти от физических и химических свойств компонентов, входящих в состав мас­ла, используют 4 метода. Все методики описаны в ГФ XI изд., вып.1, стр.290 в разделе «Общие методы анализа». Содержание масла выражают в объемно-весовых процентах. Масса сырья, степень его измельчения, время перегонки, метод и возможные растворители указаны в соответствующей НД на лекарст­венное растительное сырье.

^ Определение сердечных гликозидов.

Все лекарственное растительное сырье, содержащее сердечные гликозиды подвергается биологической стандартизации на лягушках кошках, голубях. Активность выражается соответственно в ЛЕД, КЕД, ГЕД. Общие методы оценки биологической активности описаны в ГФ-Х1, вып.2, стр.163 в разделе «Биологические методы контроля качества лекарственных средств». Валор, т.е. содержание единиц действия в растительном сырье и особенности методики определения приведены в соответствующих частных нормативных документах.

Метод основан на способности сердечных гликозидов вызывать в токсических дозах остановку сердца животных в стадию систолы. Чувствительность животных к сердечным гликозидам определяют в сравнении со стандартом.

Недостатками метода биологической стандартизации являются его трудоемкость, высокая стоимость, большая ошибка опыта (до 25%).

Из 88 видов лекарственного растительного сырья, включенного в ГФ-Х1 в 17 видах сырья не проводится количественной стандартизации сырья.

1. Цветки липы. 10. Плоды черники.

2. Цветки календулы. 11. Плоды жостера слабительного

3. Цветки бузины черной. 12. Плоды рябины.

4. Листья мать-и-мачехи. 13.Плоды калины.

5. Листья крапивы. 14. Семена льна.

6. Трава хвоща полевого. 15. Семена тыквы.

7. Трава горца почечуйного. 16.Семена лимонника.

8. Корни алтея. 17. Плоды лимонника.

9. Корневища и корни девясила.

При разработке и пересмотре НД ставится задача предусмотреть оценку качества сырья по количественному содержанию основных биологически активных и экстрактивных веществ. При этом используются современные физико-химические методы анализа природных соединений.