Учебное пособие Для студентов вузов Кемерово 2005
|
|
Скачать 1.94 Mb.
|
В пивоваренном производстве в засевных производственных дрожжах очень часто встречаются пивные сарцины (род Pediococcus). Сферические клетки (кокки) в парах, чаще в тетрадах или пакетах. Бесспоровые, грамположительны. Факультативные анаэробы. Каталазоотрицательные. Мезофилы. Оптимальное значение рН 4,5-5,0. Могут развиваться при содержании спирта до 8%. Лучше всего растут в присутствии дрожжей. Пивные сарцины вызывают сильное помутнение пива, сначала опалисцирующее, а затем с появлением мелкозернистого осадка. Иногда происходит увеличение вязкости пива и даже его ослизнение. Вследствие образования диацетила эти бактерии придают пиву характерный прогорклый маслянистый вкус и медовый аромат. Диацетил также отрицательно влияет на рост и размножение производственных дрожжей, ускоряет их оседание и отмирание. Развитие педиококков стимулирует образование продуктов распада белков, а также тиамина и рибофлавина, синтезируемых дрожжами.Дикие дрожжи инфицирующие производственные дрожжи принято подразделять на две группы:
При попадании в сусло на стадии брожения дикие дрожжи не могут интенсивно развиваться, так как их рост подавляется культурными дрожжами, количество которых по сравнению с содержанием инфицирующих пиво диких дрожжей значительно больше. ^ В чаще всего встречаются следующие разновидности диких дрожжей-сахаромицетов: S. diastaticus, S. pastorianum, S. bayanus, S. ellipsoideus. В настоящее время все эти дрожжи принято относить к одному виду Saccharomyces cerevisiae, так как с точки зрения систематики различия в их признаках не являются существенными для разграничения видов. Клетки этих дрожжей имеют овальную или эллиптическую форму. Размножаются в основном почкованием, но могут и спорообразованием. Факультативные анаэробы. Активно сбраживают сахара. Оптимальная температура развития 27-35 0С, рН – от 3,5 до 5,0. ^ Из производственных дрожжей выделены следующие дрожжи этой группы: дрожжи родов Candida, Torulopsis, Pichia, Hansenula, Brettanomyces, Rhodotorula и др. Дрожжи рода Candida имеют круглые, овальные или яйцевидные, а иногда удлиненные или неправильные формы клеток. Морфология клеток непостоянна и существенно меняется в зависимости от условий культивирования и питательной среды. Спор не образуют. На жидких средах развиваются преимущественно на поверхности в виде белой или сероватой пленки. Некоторые виды являются факультативными анаэробами, а другие – аэробами. Размножению большинства видов способствует присутствие в среде кислорода. Некоторые дрожжи этого вида продуцируют специфический белок, губительно воздействующий на культурные дрожжи (дрожжи-убийцы). Дрожжи родов Pichia и Hansenula имеют клетки различной формы – от круглых и овальных до сильно вытянутых, иногда изогнутых. Многие виды образуют псевдомицелий. Образуют споры. Большинство видов – аэробы, некоторые виды относятся к факультативным анаэробам. Размножению способствует присутствие кислорода. Дрожжи рода Rhodotorula обычно круглой, овальной, яйцевидной или удлиненной формы Спор не образуют. Дрожжи рода Torulopsis (пивная торула) имеют круглую или овальную форму. Спор не образуют, плохо сбраживают сахара. Основным источником попадания этих микроорганизмов в производство является воздух. Дрожжи рода Brettanomyces имеют клетки эллиптические, а также цилиндрические, удлиненно-продолговатые, нередко стрелозаостренные с одного конца. Образуют псевдомицелий. Спор не образуют. Являются факультативными анаэробами. Плохо сбраживают сахара. На жидких средах образуют хлопьевидный или вязкий осадок, могут образовывать тонкую пленку. Многие виды устойчивы к высоким концентрациям спирта. Помимо вышеперечисленных групп микроорганизмов, инфицирующих производственные дрожжи, в них могут присутствовать гнилостные бактерии. Это спорообразующие грамположительные бациллы и клостридии и грамотрицательные не образующие спор палочковидные бактерии. Гнилостные бактерии вызывают распад белковых веществ. В аэробных условиях они осуществляют полную минерализацию белка, вплоть до диоксида углерода, аммиака, сероводорода, воды и минеральных солей. В анаэробных условиях гнилостные бактерии образуют различные органические дурнопахнущие и ядовитые вещества. Особую опасность представляют маслянокислые бактерии (Clostridium butyricum, Clostridium pasterianum, Clostridium saccharobutyricum и др.) и нитритобразующие бактерии (например, Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus). Маслянокислые бактерии образуют масляную кислоту, а нитритобразующие бактерии превращают нитраты в нитриты. Эти соединения даже в очень малых концентрациях (0,0005 %) подавляют развитие культурных дрожжей. Биологическая чистота является одним из самых важных показателей качества производственных дрожжей. Особое значение этот показатель имеет в пивоваренном производстве. Это связано с тем, что в пивоварении засевные производственные дрожжи используются в нескольких производственных циклах (до 10..12 генераций) и поэтому являются основным источником попадания в производство микроорганизмов-вредителей, вызывающих прокисание, помутнение, образование осадка в пиве и придающих продукту неприятные вкус и аромат. Биологическая чистота пивных дрожжей считается удовлетворительной, если в них содержится не более 1 % бактерий и не более 0,5 % диких дрожжей. ^ В пивоваренном производстве при контроле засевных дрожжей основным методом исследования является их микроскопирование. При микроскопировании дрожжевой суспензии определяют морфологическое состояние дрожжей, способность дрожжей к размножению, процентное содержание мертвых клеток, наличие посторонних микроорганизмов, содержание в дрожжах запасных питательных веществ (гликогена и волютина). В дрожжах хорошего качества морфологическое состояние должно быть удовлетворительным. Процентное содержание почкующихся клеток - высокое (40…70%), дрожжей, содержащих гликоген должно быть не менее 70…75%; биологическая чистота - удовлетворительная (не более 1% бактерий и 0,5% диких дрожжей), количество мертвых клеток – не более 5% . В дрожжах чистой культуры должны отсутствовать посторонние микроорганизмы и мертвые дрожжевые клетки. В засевных производственных дрожжах целесообразно также определять концентрацию дрожжевых клеток. Это исследование проводят с использованием счетной камеры Горяева. Определение биологической чистоты дрожжей ведут также путем высева разведение из дрожжевой суспензии плотные питательные среды. Количество инфицирующих бактерий в засевных дрожжах определяется с использованием сусло-агара или дрожжевого агара с 1% глюкозы с мелом и антибиотиками (нистатином или актидионом). Для обнаружения диких дрожжей рода Saccharomyces исследуемые пробы прогревают при 50 0С в течение 20 мин, а затем высевают на агар с ацетатом. В качестве элективных сред для этих дрожжей можно также использовать агар с кристаллвиолетом, сусло с 2% винной кислоты или 10% раствор глюкозы с 4% винной кислоты. Дрожжи, не относящиеся в роду Saccharomyces, определяют на синтетической среде с лизином. Рецептуры этих сред приведены в приложении 2. ^ засевные производственные дрожжи регулярно просматривают под микроскопом, что дает возможность следить за их размножением, морфологическим и физиологическим состоянием, а также степенью загрязнения посторонними микроорганизмами. В засевных дрожжах количество почкующихся клеток должно быть не более 3%. Так как производственные дрожжи готовятся в не стерильных условиях, в них может присутствовать некоторое количество бактерий. О инфицировании засевных дрожжей кислотообразующими бактериями (молочнокислыми, уксуснокислыми) свидетельствует повышение титруемой кислотности более чем на 0,05 град. В сильно инфицированных дрожжах могут быть подвижные спорообразующие бактерии, распознавание которых осуществляют путем окраски раствором йода (маслянокислые бактерии при этом окрашиваются в серо-голубой цвет). Обращают также внимание на наличие диких дрожжей, количество мертвых клеток (не более 5%). Учитывают также упитанность дрожжей по гликогену - в нормальных дрожжах гликоген занимает от 1/3 до 2/3 объема клетки. Если гликогена меньше 1/4 объема клетки, его содержание считается недостаточным. Путем микроскопирования определяют также процентное содержание мертвых и почкующихся клеток и концентрацию дрожжевых клеток в бражке. Значения этих показателей в процессе брожения меняется. Так, в первые часы брожения концентрация дрожжевых клеток в бражке составляет 100 – 150 млн./см3, почкующихся клеток – 10…12%, мертвых – до 3…4%. В дальнейшем концентрация дрожжевых клеток и процентное содержание мертвых клеток увеличивается, а относительное содержание почкующихся клеток уменьшается. Для установления степень инфицирования бражки посторонними микроорганизмами ее исследуют под микроскопом не реже 3 раз в сутки (из каждого бродильного аппарата). В первые часы брожения посторонние микроорганизмы должны отсутствовать, в период главного брожения допускается наличие единичных клеток, а при дображивании – 3…5 клеток посторонних микроорганизмов в поле зрения микроскопа. Микробиологический контроль хлебопекарных прессованных дрожжей включает:
^ На занятии студенты знакомятся с морфологическими, физиологическими и призводственно-ценными свойствами культурных дрожжей и изучают свойства посторонних микроорганизмов, инфицирующих производственные дрожжи. Знакомятся с методами оценки качества производственных дрожжей. Путем микроскопирования определяют основные показатели качества дрожжей. Определяют концентрацию дрожжевых клеток методом прямого счета с использованием счетной камеры Горяева. 8.2.1 Определение биологической чистоты дрожжей Готовят фиксированных мазок из густой дрожжевой суспензии. Окрашивают его по Гаму (разд.3.2.1) или простым методом (разд. 2.2.3). Далее препарат микроскопируют в иммерсионной системе с использованием объектива х90. Рассматривают препарат в 10 полях зрения. При микроскопировании обращают внимание на наличие посторонних бактерий и диких дрожжей (морфологические свойства бактерий и диких дрожжей, инфицирующих производственные дрожжи описаны в разд. 8.1.2). Определение биологической чистоты можно также вести путем приготовления препарата «раздавленная капля» с использованием фазово-контрастного микроскопа. В этом случае на предметное стекло наносят каплю дрожжевой суспензии и добавляют каплю 10% раствора КОН или 50% уксусной кислоты для растворения белков и жировых частиц, что облегчает просмотр препарата. Далее накрывают препарат покровным стеклом и микроскопируют с объективом х40 и рассматривают в 20 полях зрения В поле зрения должно быть около 50 клеток дрожжей. 8.2.2 Определение морфологического состояния дрожжей Ведут путем микроскопирования препарата «раздавленная капля» в затемненном поле зрения микроскопа с объективом х40. Для этого на предметное стекло наносят каплю разбавленной дрожжевой суспензии и накрывают ее покровным стеклом. Излишки воды удаляют фильтровальной бумагой. При микроскопировании обращают внимание на форму, размеры клеток, толщину оболочек, структуру цитоплазмы, наличие почкующихся клеток. Дрожжи должны иметь форму и размеры, соответствующие применяемой расе. Клетки должны быть равномерной величины, с тонкой оболочкой, однородной или мелкозернистой цитоплазмой, небольшими вакуолями. Количество почкующихся клеток в засевных дрожжах, используемых в пивоварении должно составлять 40…70%. Наличие большого количества морфологически измененных клеток свидетельствует о дегенерации культуры, поэтому такие дрожжи использовать в производстве не рекомендуется. Зернистая цитоплазма, крупные вакуоли и отсутствие почкующихся клеток характеризует старую культуру. ^ На предметное стекло наносят каплю разбавленной дрожжевой суспензии и каплю раствора синьки Финка (раствор метиленового синего концентрацией 1:5000). Через 2 мин препарат накрывают покровным стеклом, излишки воды убирают с помощью фильтровальной бумаги. Микроскопирование ведут в 5 полях зрения. При этом подсчитывают количество всех дрожжевых клеток, а также отдельно считают количества мертвых (окрашенных в синий цвет) клеток. Далее рассчитывают процентное содержание мертвых клеток. Определение мертвых клеток в дрожжевой суспензии можно проводить и с помощью водного раствора красителя нейтрального красного в концентрации 1:10000. При этом мертвые клетки окрашиваются в красный цвет, а в живых клетках окрашиваются только включения цитоплазмы. При окрашивании дрожжевой суспензии раствором нейтрального красного микроскопирование ведут через 15 мин после окраски. ^ в клетках дрожжей Основными запасными веществами дрожжевой клетки являются гликоген и волютин (зерна метахроматина). Гликоген – запасной полисахарид дрожжевой клетки. По содержанию гликогена судят об упитанности дрожжей. Если гликогена в дрожжах мало, то это свидетельствует о том, что они длительное время находились без питательного субстрата и имеют поэтому низкую бродильную активность. Волютин – запасной полифосфат в соединении с простыми белками и рибонуклеиновой кислотой. В состоянии активного обмена волютин в клетках дрожжей располагается мелкими каплями по стенкам вакуолей или непосредственно под клеточной стенкой. В больших количествах волютин накапливается перед почкованием. Накопление волютина особенно интенсивно происходит при выращивании дрожжей на средах, богатых фосфатами. 8.2.4.1 Определение гликогена Для определения гликогена на предметное стекло наносят каплю разбавленной дрожжевой суспензии и каплю 0,5% раствора йода. Через 2…3 мин цитоплазма клеток окрашивается в светло-желтый цвет, а гранулы гликогена – в красно-бурый. Препарат накрывают покровным стеклом и удаляют излишек жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют с объективом х40. 8.2.4.2 Определение волютина методом Омелянского
Микроскопическая картина: гранулы волютина красного цвета, клетки – синего. 8.2.5 Определение концентрации дрожжевых клеток с помощью счетной камеры Горяева Для подсчета клеток в дрожжевой суспензии используют счетные камеры Горяева, Тома-Цейса, Бюркера и др. Счетная камера Горяева (рис. 15) представляет собой толстое предметное стекло, разделенное четырьмя прорезями на три поперечно расположенные площадки. Центральная площадка продольной прорезью делится пополам. На каждой половинке выгравирована микроскопическая сетка. Сетка разделена на большие и малые квадраты: площадь большого квадрата равна 1/25 мм2, малого – 1/400 мм2. Боковые площадки расположены на 0,1 мм выше центральной (глубина камеры) и служат для притирания покровного стекла.
Рис. 15 Счетная камера Горяева: а – вид сверху; б – вид сбоку; в – деление камеры на квадраты; h – глубина камеры При работе с камерой необходимо соблюдать определенный порядок ее заполнения. Вначале углубление с сеткой покрывают специальным шлифованным покровным стеклом и, слегка прижимая, смещают покровное стекло в противоположные стороны до появления колец Ньютона. Это указывает на то, что покровное стекло притерто к сторонам камеры. После этого заполняют камеру исследуемой дрожжевой суспензией. Суспензию вносят через бороздки камеры капилляром или пипеткой. Подсчет клеток производят через 3…5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопировании были видны в одной плоскости. Камеру помещают на предметный столик и рассматривают в затемненном поле зрения с объективами вначале на х8, а затем на х40. Клетки подсчитывают в 10 больших или в 20 маленьких квадратах, перемещая их по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки и на пограничных линиях, если они больше, чем наполовину лежат внутри квадрата. Клетки, пересеченные пограничной линией пополам, считают только на двух их четырех сторон квадрата. При подсчете количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20…30, а в малом - 10, в противном случае делают разведение. Количество клеток в 1 см3 исследуемой суспензии вычисляют по формуле: M = a × n × 103/ S ×h, где М – число клеток в 1 см3 дрожжевой суспензии; а – среднее число клеток в квадрате сетки; n – разведение дрожжевой суспензии (если оно применялось); ^ h – глубина камеры. Пример: При подсчете взвеси дрожжей в камере Горяева обнаружено 20 дрожжевых клеток в одном большом квадрате. Густая взвесь предварительно была разведена 1:100. Следовательно, М = 20 × 1000 × 25 × 100/ 0,1= 5,0 × 108 кл/см3. Оформление и анализ результатов исследований Студенты конспектируют теоретический материал и методы микроскопического исследования производственных дрожжей. Определяют биологическую чистоту дрожжей, их морфологическое состояние, концентрацию мертвых и почкующихся клеток, наличие гликогена и волютина. Подсчитывают концентрацию дрожжевых клеток с помощью камеры Горяева. Микроскопическую картину, отражающую морфологическое состояние дрожжей зарисовывают. Делают вывод о качестве исследованных дрожжей используя данные, представленные в разделе 8.1.3. Контрольные вопросы
^ САНИТАРНО-ГИГИЕНИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ УСЛОВИЙ ПРОИЗВОДСТВА (выполняется на двух занятиях) Цель работы: Ознакомиться с организацией санитарно-гигиенического контроля на предприятиях пищевой промышленности. Освоить микробиологические методы, позволяющие оценить санитарное состояние воды, воздуха производственных помещений, оборудования, тары, упаковочных и вспомогательных материалов, рук и спецодежды работников. ^ термостаты, микроскопы, спиртовки, плитки, пробирки с тампонами для приготовления смывов, пробирки со средой Кесслера, средой Кода, стерильные чашки Петри, стерильные пипетки на 1 см3, стерильные колбы на 500 см3, питательные среды: мясопептонный агар, сусло-агар или среда Сабуро, бактериологические петли, предметные стекла, набор красок по Граму, фильтровальная бумага. ^ 9.1.1Организация санитарно-гигиенического контроля на предприятиях пищевой промышленности Санитарно-гигиенический контроль условий производства на предприятиях пищевой промышленности осуществляется общегосударственной и ведомственными службами. ^ осуществляется санитарно-зпидемиологической службой (СЭС) в форме предупредительного (при проектировании и строительстве) и текущего надзора за выполнением установленных для предприятий молочной промышленности санитарно-гигиенических требований. Текущий контроль может быть плановый и внеплановый. Органы и учреждения государственного санитарного надзора наделены широкими полномочиями. Распоряжения и указания представителей санитарной службы являются обязательными для администрации предприятия. Их невыполнение несет за собой административную ответственность руководителей предприятий, цехов и отделов, отдельных работников. Принудительные административные меры применяются и при выявлении нарушений, представляющих непосредственную угрозу для здоровья людей. В таких случаях может быть установлен запрет на дальнейшую эксплуатацию предприятия (например, запрет на выпуск продукции). При особо серьезных нарушениях, повлекших или могущих повлечь за собой возникновение пищевых заболеваний или другие вредные последствия, органы санитарного надзора могут привлекать виновных к уголовной ответственности. ^ осуществляют ведомственная санитарная служба и заводская лаборатория. Они контролируют выполнение требований СанПиНа для предприятий пищевой промышленности, регулярно следят за санитарным состоянием производства, за профилактическими обследованиями работников цехов и соблюдением ими правил личной гигиены. Результаты проведения санитарно-гигиенического контроля фиксируются в специальном журнале. При отборе проб для микробиологических исследований представителями санитарно-эпидемиологической службы, микробиологи предприятия также проводят отбор проб и их исследование. В случаях систематических расхождений результатов, получаемых службой СЭС и ведомственными лабораториями, проводят по согласованию совместные исследования для уточнения методов анализа и интерпретации их результатов.
Воздух производственных помещений может стать источником микробного загрязнения молочных продуктов. Санитарно-гигиеническая оценка воздуха производственных помещений проводится по двум микробиологическим показателям: общей бактериальной обсемененности (КМАФАнМ) и содержанию санитарно-показательных микроорганизмов – гемолитических стрептококков и стафилококков. Воздух производственных помещений считается чистым, если КМАФАнМ не превышает 1500 КОЕ/м3, а гемолитических стрептококков и стафилококков не более 16 в 1 м3. В качестве питательных сред используют мясопептонный агар (для определения КМАФАнМ) и кровяной агар (для определения гемолитических стрептококков и стафилококков). Для определения микроорганизмов в воздухе используют седиментационный и аспирационный методы. ^ основан на самопроизвольном оседании пылинок и капель вместе с микроорганизмами на поверхность плотной питательной среды в открытых чашках Петри. ^ заключается в принудительном оседании микроорганизмов из воздуха на поверхности плотных питательных сред. Осуществляется аспирационный метод с помощью специальных приборов (например, прибора Кротова), снабженных вентиляторами, которые засасывают воздух в прибор через клиновидную щель. В приборе воздух ударяется о поверхность плотной питательной среды в открытой чашке Петри. Помимо нормируемых микробиологических показателей в воздухе производственных цехов и холодильниках на предприятиях пищевой промышленности определяют наличие спор микроскопических грибов и дрожжей, произвольно оседающих на поверхности сусло-агара или среды Сабуро за 5 минут. Посевы культивируют при комнатной температуре в течение 5-и суток. Санитарно-гигиеническая оценка проводится по 3-х бальной шкале. Состояние воздуха отличное, если в посевах споры грибов и дрожжей не обнаружены; хорошее, если на поверхности среды оседает до 2 спор грибов, а споры дрожжей не выявлены; удовлетворительное, если в чашках Петри после культивирования вырастает не более 5-и колоний грибов и 2-х колоний дрожжей. Для снижения бактериальной обсемененности воздуха на предприятиях молочной промышленности проводят проветривание и влажную уборку помещений. Снизить содержание микроорганизмов в воздухе можно также путем его фильтрации через воздушные фильтры, применяя физические и химические методы обеззараживания воздуха: обработку ультрафиолетовыми лучами, хлорсодержащими препаратами в виде испарений и аэрозолей. Эффективным способом является озонирование воздуха.
Вода, используемая на предприятиях пищевой промышленности, должна отвечать требованиям СанПиНа 2.1.4.1074-01 на питьевую воду. Для оценки санитарного состояния воды в ней определяют общее микробное число – не более 50 КОЕ/см3; термотолерантные колиформные бактерии – не допускаются в 100 см3; общие колиформные бактерии также должны отсутствовать в 100 см3; споры сульфитредуцирующих клостридий - не допускаются в 20 см3; колифаги – в 100 см3. Исследование питьевой воды проводят один раз в квартал при пользовании городским водопроводом и один раз в месяц при наличии собственных источников водоснабжения в воде. ^ – количество мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов, способных образовывать колонии на питательном агаре при 37 0С в течение 24 часов. ^ относятся грамотрицательные не образующие спор палочки, не обладающие оксидазной активностью, ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре 370С в течение 24 часов. ^ обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, которые, кроме этого способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре 44 0С в течение 24 часов. ^ (преимущественно Clostridium perfringens) – спорообразующие анаэробные палочковидные бактерии, редуцирующие сульфит натрия на железо-сульфитном агаре в течение 24 часов при температуре 44 0С. Колифаги – бактериальные вирусы, способные лизировать кишечную палочку и формировать зоны лизиса через 18±2 часа при температуре 37 0С на ее газоне на питательном агаре. Колифаги – индикаторы очистки питьевой воды в отношении энтеровирусов. Способами обеззараживания воды являются хлорирование, озонирование, обработка ультрафиолетовыми лучами. ^ Контроль аппаратов и оборудования. Контроль проводят непосредственно после мойки, дезинфекции и пропаривания перед началом работы. Для проведения исследования готовят ватные или марлевые тампоны, которые закрепляют на деревянном или металлическом стержне и помещают в пробирки с 10 см3 воды. Пробирки с тампонами стерилизуют в автоклаве при 0,1 МПа в течение 20-30 минут. Смывы с крупного оборудования и аппаратов берут с помощью нержавеющих металлических трафаретов с вырезанной серединой (площадь выреза 10, 25 или 100 см3). Перед взятием пробы трафарет смачивают спиртом, обжигают и накладывают на исследуемую поверхность. Ограниченную поверхность промывают смоченным тампоном, затем тампон погружают в пробирку с водой и содержимое хорошо перемешивают. В смывной воде определяют общую бактериальную обсемененность и наличие кишечной палочки (путем посева на МПА и среду Кесслера). В смывах с хорошо вымытого оборудования общее количество микроорганизмов в смывной воде не должно превышать их содержания в чистой воде, поступающей на мойку. Кишечные палочки должны в смыве отсутствовать. Количество слизеобразующих бактерий не должно быть более 0-5 в 1 мл смыва. Наличие кишечной палочки можно определить, используя среду Кода. В этом случае тампоном, смоченным в среде Кода, промывают исследуемую поверхность. Далее тампон погружают в среду, а пробирку помещают в термостат с температурой 420С на 18-24 часа. О наличии кишечной палочки судят по изменению цвета среды с зеленого до желтого. ^ Внутренняя поверхность трубопроводов, рукавов, шлангов недоступна для взятия проб с помощью тампонов. В этом случае общую бактериальную обсемененность и коли-индекс определяют в последней промывной воде. Эти показатели не должны отличаться от показателей воды, применяемой в производстве. Качество мойки трубопроводов можно также оценить путем отбора 10 мл смывной воды в стерильную посуду с последующим центрифугированием при 1500-2000 об/мин в течение 10 минут и микроскопированием осадка в 10 полях зрения. При этом должно обнаруживаться не более 5-6 клеток микроорганизмов. ^ Для анализа санитарного состояния стеклянных бутылок и банок смыв делают путем обмывания внутренней поверхности последовательно 10 единиц посуды 20 см3 воды. Санитарное состояние бочек, бидонов, цистерн проверяют путем посева последней смывной воды. Смыв с мелкого инвентаря (мешалки, пробники, термометры и др.) готовят путем смачивания всей поверхности стерильным тампоном, а при анализе санитарного состояния стеллажей, лотков, ведер, лопат пользуются трафаретом. В смывах определяют общую бактериальную обсемененность и наличие кишечной палочки. Кишечная палочка должна отсутствовать в смывах. ^ Пергамент, фольгу, пленку, комбинированные материалы для упаковки молока и молочных продуктов разворачивают и с внутренней стороны берут смыв стерильным ватным тампоном (со 100 см3 поверхности). Определяют наличие микроскопических грибов и наличие кишечной палочки. Кишечная палочка в смывах должна отсутствовать, а содержание плесеней не должно превышать 5 в 1 см3 смыва. Поваренную соль контролируют на общую бактериальную обсемененность. Для разведения берут 5 г соли и растворяют ее в 95 см3 воды. Содержание микроорганизмов в соли не должно превышать 100 КОЕ/г. Сахар исследуют на наличие дрожжей и плесеней, растворяя 10 г сахара в 90 см3 воды. Дрожжи и микроскопические грибы должны отсутствовать. ^ Анализ чистоты рук работников производят (без предварительного предупреждения) пред началом производственного процесса только у рабочих, которые непосредственно соприкасаются с чистым оборудованием или продукцией. Перед анализом тампон смачивают стерильной водой или физиологическим раствором и обтирают им обе руки и пальцы каждого работника. Тампон ополаскивают в воде, в которой проводилось его смачивание, хорошо взбалтывают, отбирают 1 мл и подготавливают разведения (1:10 и 1:100). Для определения общего количества микроорганизмов в 1 мл смыва производят посев разведений на МПА в стерильные чашки Петри и далее проводят термостатирование при 37 0С в течение 48 часов. Остаток смыва вместе с тампоном высевают в 5 см3 среды Кесслера или Кода, а затем проводят культивирование при температуре 42-43 0С в течение 18-24 часов. Наличие в смыве кишечной палочки недопустимо. Можно применить и такой метод: в сложенные ладонями вместе кисти рук наливают 100 мл стерильной воды так, чтобы вода хорошо промыла пальцы. Стерильным тампоном протирают ладони и ногти. Воду собирают в стерильную склянку и туда же бросают тампон. Смывную воду перемешивают и производят аналогичные высевы. Чистоту рук оценивают по количеству микроорганизмов в 1 мл смыва при отсутствии кишечных палочек:
Периодически проводят контроль обработки рук хлорной известью, для чего отдельные участки рук протирают ватным тампоном, смоченным йодкрахмальным раствором (смесь растворов - 6% раствора йодистого калия и 4% раствора растворимого крахмала в равных соотношениях). Если тампон и поверхности рук в местах соприкосновения с тампоном окрашиваются в сине-бурый цвет, то это свидетельствует о присутствии ионов хлора. Чистоту рук можно проверить также с помощью индикаторных бумажек для определения бактерий группы кишечной палочки. Для этого индикаторную бумажку смачивают в стерильной воде и накладывают на руку. Затем бумажку помещают в пакет, запаивают и термостатируют в течение 12 часов при 370С. Появление розовых пятен свидетельствует о присутствии БГКП. Халаты, куртки, передники, перчатки из ткани периодически исследуют на присутствие кишечных палочек посевом 1 см3 смывной воды в среду Кесслера. Кишечные палочки на спецодежде должны отсутствовать.
1-е занятие На первом занятии студенты знакомятся с методиками определения микроорганизмов в воздухе, воде и осуществляют посевы этих объектов на питательные среды. Готовят смывы с рук и далее проводят определение наличие кишечной палочки с использованием среды Кода.
седиментационным методом Определяют количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) и содержание микроскопических грибов и дрожжей. Для каждого определения готовят по 2 чашки Петри с 10-15 см3 мясопептонного агара или среды для определения КМАФАнМ и сусло-агара или среды Сабуро. Чашки переносят в исследуемое помещение и помещают на развернутую бумагу, в которой они стерилизовались. Далее сдвигают крышки на самый край бортика чашки так, чтобы вся поверхность агаризованной среды была открыта полностью. Чашки оставляют открытыми 5, 10 или 15 минут (время экспозиции) в зависимости от загрязненности воздуха. Затем их закрывают крышками, переворачивают вверх дном и помещают в термостат. Чашки с МПА выдерживают в течение 24-48 часов при 370С, а со средой Сабуро – в течение 2-3 суток при 250С. Подсчет колоний производят визуально и с помощью лупы. Подсчет колоний грибов и дрожжей ведут отдельно. Для определения содержания микроорганизмов в 1 м3 пользуются формулой, предложенной Омелянским, согласно которой на поверхности чашки площадью 100 см2 оседает в течение 5 минут столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха. Формула Омелянского: Х = а×100×5×100 / ST, где а – число выросших в чашках колоний (среднее из двух); S – площадь чашки Петри, см2; Т – время экспозиции, мин; 100 – пересчет площади чашки на 100 см2; 5 – время экспозиции по Омелянскому, мин; 100 – пересчет на 1 м3 воздуха.
Отбор проб Кран или край спускной трубы обжигают зажженным ватным тампоном, пропитанным спиртом. Открывают кран и в течение 10-15 минут воду спускают, после чего производят отбор пробы в стерильную колбу (объем пробы не менее 500 см3). Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой над огнем. 9.2.2.1 Определение общего микробного числа (КМАФАнМ) Проводят по методике, описанной в разделе 2.2.2.1. Для посева отбирают по 1 см3 воды и переносят в 2 чашки Петри и заливают расплавленной и охлажденной до 45…50 0С плотной питательной средой (МПА). После инкубации посевов подсчитывают количество колоний в каждой чашке, а затем результаты суммируют и делят на два. 9.2.2.2 Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранных фильтров Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциально-диагностической среде и последующей идентификации выросших колоний. Для анализа точно отмеряют 100 см3 воды и фильтруют этот объем через стерильный мембранный фильтр. После окончания фильтрования фильтр осторожно приподнимают фламбированным пинцетом и переносят в чашку Петри со средой Эндо. Поверхность фильтра с осевшими на ней микроорганизмами должна быть обращена вверх. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре 37 0С в течение 24 часов. Результат считается отрицательным, если на фильтрах вообще не выросли колонии, или выросли колонии с неровными краями и поверхностью. При наличии типичных лактозоположительных колоний, дающих отпечаток на обратной стороне мембранного фильтра и среде – темно красных, красных с металлическим блеском, а также лактозоотрицательных – розовых без отпечатков, подсчитывают число колоний каждого типа. Для идентификации отбирают не менее 5 колоний каждого вида и делают посев на скошенный питательный агар. Посевы инкубируют при 370С в течение 16-18 часов. Далее проводят биохимические тесты с чистыми культурами: оксидазный тест и тест образования кислоты и газа при ферментации лактозы при температуре 37 0С для определения общих колиформных бактерий и при 44 0С при определении термотолерантных колиформных бактерий. 9.2.2.3 Определение содержания общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом Метод бродильных проб (или титрационный метод) основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую накопительную среду, с последующим пересевом на дифференциально-диагностическую среду для идентификации выросших колоний. Титрационный метод может быть использован:
^ заключается в посеве 3-х объемов воды по 100 см3 в концентрированную лактозопептонную среду. Посевы инкубируют при температуре 37 0С в течение 24-48 часов для определения общих колиформных бактерий и при 44 0С – при определении термотолерантных колиформных бактерий в течение 24±2 часов. Если в колбах не обнаружены признаки роста (об этом судят по отсутствию газа в поплавках) то колиформные бактерии отсутствуют в 100 см3. ^ из пробирок и колб, где отмечено наличие роста и образование газа, производят высев петлей в сектора среды Эндо. Посевы на среде Эндо выдерживают в термостате при 37 0С в течение 18-20 часов. Отсутствие колоний, типичных для бактерий группы кишечных палочек, дает отрицательный ответ о содержании этих микроорганизмов в исследуемом объеме воды. 9.2.2.4 Определение споровых сульфитредуцирующих клостридий прямым посевом Из каждой пробы воды делают посев 20 см3 в железосульфитный агар. Для этого в стерильные пробирки вносят по 10 см3 в 2 пробирки объемом 30 см3 или по 5 см3 в 4 пробирки вместимостью 15 см3. Посевы заливают горячим (75…80 0С) железосульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Среду заливают по стенке пробирки, избегая образования пузырьков воздуха. После этого пробирки быстро охлаждают, помещая их в емкость с холодной водой для создания анаэробных условий. Посевы инкубируют при 44 0С в течение 24±2 часов. Если после культивирования не наблюдается почернения среды в пробирках, то считают, что сульфитредуцирующие клостридии отсутствуют в 20 см3.
Закрепленный на деревянном или металлическом стержне стерильный тампон смачивают стерильной водой (или физиологическим раствором) и протирают ими ладони, тыльную поверхность рук, под ногтями и между пальцами обеих рук. Тампон погружают в пробирку с водой, в которой проводилось смачивание, содержимое пробирки хорошо взбалтывают, отбирают 1 см3 и готовят разведения (1:10 и 1:100). Для определения КМАФАнМ проводят посев разведений в чашки Петри на мясопептонный агар с последующим термостатированием при 370С в течение 48 часов. Остаток смыва вместе с тампоном высевают в пробирки с 5 см3 среды Кесслера и проводят культивирование при 43 0С в течение 24 часов. ^ Чистоту рук оценивают по количеству микроорганизмов в 1 см3 смыва при отсутствии газообразования в пробирке со средой Кесслера с поплавком (при отсутствии кишечной палочки). При оценке состояния рук по содержанию в смывной воде мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) руководствуются описанием, изложенным в разделе 4.1.4 данной лабораторной работы. 2-е занятие На втором занятии студенты исследуют:
Контрольные вопросы
^
Приложение 1 ^ 1. КРАСИТЕЛИ Фуксин основной спиртовой раствор – насыщенный |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям