Инструкция по применению Учреждение-разработчик
|
|
Скачать 335.61 Kb.
|
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
АЛГОРИТМ ОпределениЯ аллельных вариантов и генотипов Helicobacter pylori с использованием полимеразной цепной реакции (инструкция по применению) Учреждение-разработчик: Учреждение образования «Гомельский государственный медицинский университет» АВТОРЫ: Воропаева Алла Викторовна к.м.н. Воропаев Евгений Викторович к.б.н. Баранов Олег Юрьевич д.м.н., профессор Жаворонок Сергей Владимирович д.м.н., профессор Пиманов Сергей Иванович к.м.н., доцент Макаренко Елена Владимировна д.б.н. Падутов Владимир Евгеньевич Гомель, 2008В последнее десятилетие молекулярно-генетические методы находят все более широкое применение в клинической диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний, задачей которых является как можно более раннее выявление заболевания, а также мониторинг проводимой терапии. Особое значение эти методы приобретают в случае трудно культивируемых, медленно растущих, некультивируемых микроорганизмов, а также случаев заболеваний связанных с генетическими нарушениями. Открытие инфекции Helicobacter pylori и подтверждение ее роли в развитии заболеваний желудочно-кишечного тракта послужило мощным толчком к дальнейшему исследованию этого микроорганизма. С 1994 года Helicobacter pylori является безусловным и единственным из бактериальных патогенов канцерогеном по классификации Международного агентства по изучению рака. В 2005 году европейская рабочая группа EHPSG – «Консенсус Маастрихт-3» приняла всесторонние и обобщающие подходы к анализу взаимоотношений между инфекцией Helicobacter pylori и такими заболеваниями как функциональная диспепсия, гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь, НПВП-гастропатия, а также современным подходам к диагностике инфекции и проведению эрадикационной терапии. Согласно полученным данным риск развития эрозий и язв желудка и двенадцатиперстной кишки у Helicobacter pylori-положительных больных выше, чем у Helicobacter pylori-отрицательных. Тяжесть клинического течения геликобактериоза во многом зависит от степени патогенности штаммов Helicobacter pylori, что в свою очередь определяется наличием и особенностями цитотоксических генов. Для диагностики патологических состояний связанных с Helicobacter pylоri используется целый набор методов включающий в себя быстрый уреазный тест, иммуноферментный анализ, морфологические и молекулярно-генетические методы, одним из вариантов которых является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Открытая в середине 80-х годов, полимеразная цепная реакция (ПЦР) способна увеличить количество копий исходной пробы ДНК в миллионы раз в течение нескольких часов. В основе метода ПЦР лежит принцип умножения исходной ДНК матрицы в геометрической прогрессии в процессе прохождения температурных циклов. В настоящее время для проведения ПЦР разработан и доступен для широкого использования набор оборудования выпускаемый различными производителями, основным из которого является так называемый термоциклер (амплификатор) или программируемый термостат, обеспечивающий температурный и временной контроль стадий полимеразной цепной реакции в ходе амплификации, или многократного копирования ДНК в условиях in vitro. ПЦР-диагностика обладает рядом преимуществ:
^ Лабораторное оборудование применяемое в ПЦР- диагностике должно позволять проводить все необходимые этапы работы с ДНК, начиная с ее выделения из биологического материала, дальнейшую амплификацию и детекцию продуктов амплификации методом электрофореза. Ниже в таблице приведен оптимальный вариант набора оборудования для организации ПЦР- лаборатории. Таблица - Оптимальный набор оборудования для организации ПЦР- лаборатории
Следует учесть, что при проведении исследований методом ПЦР необходимым является наличие расходных материалов, таких как резиновые перчатки, халаты, наконечники для пипеток с фильтром до 10, 20, 200, 1000 мкл, фильтровальная бумага, микроцентрифужные пробирки на 1,5 или 2 мл, ПЦР-пробирки, стеклянные пестики, штативы для пробирок, стеклянная химическая посуда и др. Желательно наличие основного набора реагентов для работы по оригинальным методикам и для приготовления собственных растворов, реакционных смесей и т.д. Агароза — компонент агарозного геля, ацетат аммония, CH3COONH4 — выделение ДНК, борная кислота, H3BO3 — компонент электрофоретического буфера, бромид этидия, C21H20N3Br — окраска ДНК, бромфеноловый синий — электрофоретический маркер, глицерин, C3H5(OH)3 — широкий спектр применения, термостабильная ДНК-полимераза — компонент ПЦР-смеси, изопропанол, C3H7OH — выделение ДНК, лаурилсульфат натрия, C12H25SNa — выделение ДНК, маркер молекулярной массы — электрофоретический маркер, dНТФ (ATФ, ГTФ, ЦTФ, TTФ) — компонент ПЦР-смеси, праймеры — компонент ПЦР-смеси, соляная кислота, HCl— широкий спектр применения, трис, C4H11NO3 — компонент большинства буферных растворов, уксусная кислота, CH3COOН — широкий спектр применения, хлорид калия, KCl — компонент ПЦР-смеси, хлорид магния, MgCl2 — компонент ПЦР смеси, хлорид натрия, NaCl — выделение ДНК, хлороформ CHCl3 — выделение ДНК, ЭДТА, C10H14N2Na2O8·2H2O — широкий спектр применения, этиловый спирт C2H5OH — осаждение ДНК. ^ Показаниями к определению генотипов и алелльных вариантов Helicobacter pylori являются: обследование больных с хроническими воспалительными заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки. Методика ПЦР, предложенная в разработанной нами инструкции, является наиболее совершенным лабораторным методом, позволяющим выявлять цитотоксические генотипы и аллельные варианты патогенных штаммов Helicobacter pylori, что является необходимым в прогнозе течения гастродуоденальной патологии и может быть применена в медицинских и научных учреждениях. ^ Отсутствуют Описание технологии используемого метода Материалом для выделения ДНК Helicobacter pylori являются содержимое зубодесневых карманов, биоптаты слизистой оболочки желудка, кал, чистые культуры Helicobacter pylori. Наиболее часто в ПЦР - лабораториях нашей республики выделение ДНК для выявления Helicobacter Pylori проводят, используя коммерческие наборы производства ЦНИИЭ МЗ РФ и НПФ «Литех» (Россия). Несомненно, использование данных наборов удобно в работе с небольшим количеством выделенной ДНК, при проведении 1-5 исследований. Для генотипирования Helicobacter pylori оптимально использовать методы дающие возможность получения большого количества ДНК, которое позволит провести значительное количество исследований из одного образца. На наш взгляд наиболее оптимальным методом выделения ДНК из биоптатов желудка является SDS метод, который позволяет получить достаточное количество высококачественных препаратов суммарной ДНК для проведения последующей реакции амплификации. Ниже приводим протокол по данному методу выделения ДНК из биоптатов желудка. 1. Выделение суммарной ДНК из биоптатов SDS-методом. 1.1. Экстракция. Образец, массой 5-10 мг, поместить в центрифужную пробирку типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл, содержащую 400 мкл экстрагирующего буфера следующего состава: 200 мМ р-р трис; 250 мМ р-р хлорида натрия; 25 мМ p-p трилона Б; 0,5% лаурилсульфата натрия, (рН буфера довести НCl до значения 8,1) и перемешать на вортексе. После этого пробирки поместить в твёрдотельный термостат и инкубировать в течение 30 мин. при 65 0С. ^ После экстракции в пробирку добавить 350 мкл охлажденного 5М кислого р-ра ацетата натрия (рН 5,0). Содержимое перемешать и инкубировать в твёрдотельном термостате (Т = 0 0С) в течение 20 мин. После инкубации гомогенаты центрифугировать при 12 000g (Т = 4 0С) в течение 10 мин. По окончании центрифугирования пипеткой отобрать 650 мкл супернатанта, перенести в другую центрифужную пробирку типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл и смешать с 650 мкл хлороформа и центрифугировать при 12 000g (Т = 4 0С) в течение 10 мин. ^ . По окончании центрифугирования пипеткой отобрать 600 мкл супернатанта, перенести в другую центрифужную пробирку типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл и добавить 600 мкл изопропанола. Содержимое пробирки перемешать и инкубировать при температуре – 10 0С в течение 15 мин. Далее произвести центрифугирование при 12 000g (Т = 4 0С) в течение 15 мин. ^ Супернатант слить, а полученный осадок ДНК промыть 1000 мкл 65% этанола, охлажденного до температуры – 10 0С. После промывания содержимое пробирки центрифугировать при 12 000g (Т = 4 0С) в течение 10 мин. Процедуру промывки повторить 2–3 раза для удаления из осадка остатков трилона Б, ацетата натрия и изопропанола. ^ После промывки этанолом открыть крышки и просушить осадок ДНК в течение 30–40 мин. (Т = 45 0С) до полного испарения этанола. ^ Высушенный осадок растворить в 30 мкл бидистиллированной и деионизированной воды при 40 0С в течение 30 мин. Растворенную ДНК хранить при 4 0С для последующего анализа. После проведения выделения ДНК необходимо провести определение ее количества спектрофотометрическим методом. В настоящее время наиболее оптимальным фотометром для определения количества ДНК является безкюветный вариант спектрофотометра, позволяющий проводить определение концентрации ДНК в 1 мкл в течении 10 секунд. Для проведения ПЦР оптимальное количество геномной ДНК, вносимого в реакционную смесь должно составлять от 20 до 50 нг. Далее проводится выявление ДНК Helicobacter pylori, для чего можно использовать например коммерческую ПЦР- тест-систему производства ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ «АмплиСенс-100-R» для амплификации участка ДНК длиной 520 пар нуклеотидов 16S- рибосомального гена Helicobacter pylori. После получения положительного результата проводится дальнейшее выявление аллельных вариантов и генотипов Helicobacter pylori. В разделах «амплификация» и «электрофорез» представлены теоретические основы формирования ПЦР- смесей, проведения ПЦР и интерпретации результатов. 2. Амплификация. При проведении амплификации основными компонентами реакционной (ПЦР) смеси являются: ПЦР-буфер (Трис-НСl, KCl, MgCl2),смесь нуклеотидтрифосфатов (ATФ, ГTФ, ЦTФ, TTФ), праймеры (олигонуклеотиды), термостабильная ДНК-полимераза, препарат анализируемой ДНК. Каждый из компонентов реакционной смеси непосредственно участвует в полимеразной цепной реакции, а концентрация реагентов напрямую влияет на ход амплификации. Трис-НСl — определяет рН реакционной смеси, создает буферную емкость. Активность ДНК-полимеразы зависит от рН среды, поэтому значение водородного показателя напрямую влияет на ход полимеразной цепной реакции. Обычно значение рН находится в пределах 8–9,5. Высокое значение рН берется из-за того, что при повышении температуры рН Tрис-НСl буфера падает (температурный коэффициент ~ –0,031 ед. рН/0C) и при 720С составляет ~7,5. ^ 2 — поскольку ДНК-полимераза является Mg2+-зависимым ферментом, то концентрация ионов магния влияет на активность фермента (Mg2+ образует комплексы с НТФ — именно эти комплексы являются субстратом для полимеразы). Высокая концентрация приводит к увеличению неспецифической амплификации, а низкая ведет к ингибированию реакции, оптимум (для различных полимераз) находится в области 0,5–5 мМ. Кроме того, концентрация солей магния влияет на протекание процессов денатурации и отжига — повышение концентрации Mg2+ вызывает повышение температуры плавления ДНК (т. е. температуры, при которой 50% двухцепочечных нитей ДНК разъединяются на одноцепочечные). НТФ — нуклеотидтрифосфаты являются непосредственными мономерами нуклеиновых кислот. Для предотвращения цепной терминации рекомендуется равноколичественное соотношение всех четырех нуклеотидтрифосфатов. Низкая концентрация данных компонентов реакционной смеси (10–20 мМ) увеличивает вероятность ошибки при построении комплементарной цепи ДНК. Диапазон используемых концентраций — 50–500 µM. Праймеры — олигонулеотиды являющиеся затравкой для начала синтеза полинуклеотидной цепи. Используемый диапазон концентраций: 0,1–0,6 µM. Оптимальная концентрация праймеров подбирается эмпирически. Иногда при длительном хранении при 4 0С, или после большого количества замораживаний-оттаиваний праймеры образуют вторичные структуры – димеры, снижая эффективность протекания ПЦР. Устранение данной проблемы сводится к инкубации на водяной бане (T = 95 0C) в течение 3 минут и последующим резким охлаждением до 00С. Наиболее оптимальным является использование праймеров с разницей температур плавления (Тm) не более 2–4 0С. Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной, взятой в качестве критерия при выборе праймеров, специфичности. При попадании на такую зону, отжига праймеров происходить не будет, и как следствие - ложноотрицательный результат. ^ — термостабильный фермент при использовании малого количества ДНК-полимеразы наблюдается уменьшение синтеза конечного продукта прямо пропорциональное размеру фрагментов. Избыток полимеразы в 2–4 раза приводит к появлению диффузных спектров, а в 4–16 раз — низкомолекулярных неспецифичных спектров. Диапазон используемых концентраций — 0,5–1,5 единиц активности в пересчете на 25 мкл ПЦР смеси. Примесь в рекомбинантных полимеразах ДНК бактерий вызывает появление неспецифичных ампликонов. Точность синтеза зависит от концентрации Mg2+, НТФ, pH. В среднем, частота ошибок, например у Taq-полимеразы, чуть ниже, чем 1 замена на 100–300 п.н. ^ — количество и качество препарата ДНК (матрицы) непосредственно влияет на ход и параметры полимеразной цепной реакции. Избыточное количество образца ДНК ингибирует ПЦР. Диапазон используемых концентраций: геномная ДНК — 10–500 нг, бактерий — 1–10 нг, плазмидная, ДНК — 0,2–5 нг. Спектрофотометрический анализ позволяет измерить концентрацию ДНК и оценить чистоту полученных препаратов. Однако, он не позволяет выявить степень деградации молекул в препарате. Для проведения такого анализа используют электрофоретический анализ полученных препаратов ДНК. Поскольку концентрация и чистота препарата ДНК являются важными факторами, влияющими на ход дальнейшего анализа, необходимо установление значений этих показателей с помощью спектрофотометра. Для определения количества ДНК измеряют поглощение раствора в областях с длинами волн 260 и 280 нм. Измерение при 260 нм позволяет рассчитать концентрацию нуклеиновой кислоты в пробе. Оптическая плотность OD = 1 А соответствует приблизительно 50 мкг/мл двухцепочечной ДНК. Соотношение экстинций 260 нм/280 нм позволяет судить о чистоте нуклеиновой кислоты. Чистые препараты ДНК имеют соотношение не менее 1,67. Если препарат содержит примесь белка, то OD260/OD280 меньше указанного выше значения, и необходимо провести дополнительную очистку препарата. Кроме того, проводят дополнительное измерение препаратов при 320 нм. В чистых препаратах значение OD320 должно стремиться к нулю. Примеси различных веществ, находящихся в препарате ДНК, могут также уменьшать эффективность протекания ПЦР: ацетат натрия, хлорид натрия, Трилон Б, изопропанол, этанол, гепарин, фенол, мочевина, гемоглобин и др. Кроме основных компонентов ПЦР смеси, используют ряд дополнительных веществ, улучшающих качественные и количественные показатели ПЦР: ацетамид (5%) — увеличение растворимости основных компонентов; бетаин (натриевая соль) (0,8–1,6 М) — стабилизация ДНК-полимеразы, понижение температуры плавления ДНК, выравнивание температуры плавления AT- и GC-насыщенных регионов; альбумин бычий (10–100 мкг/мл) — стабилизация ДНК-полимеразы; диметилсульфоксид (1–10%) — повышение растворимости основных компонентов; формамид (2–10%) — увеличение специфичности отжига в GC-насыщенных регионах; глицерин (15–20%) — увеличение термостабильности фермента, понижение температуры денатурации образца ДНК; сульфат аммония (15–30 мМ) — снижение температуры денатурации и отжига. В результате проведенных нами исследований по генотипированию Helicobacter pylori был подобран состав реакционной стандартной ПЦР- смеси на 1 анализ, состоящий из следующих компонентов: 10 кратный ПЦР-буфер (100 мМ Трис-HCl (рН 8.8 при 250С), 500 мМ KCl; 25 мМ MgCl2, 0,1% Твин 20) — 2,5 мкл. Смесь нуклеотидов дНТФ 10 мМ — 0,5 мкл Праймер прямой 10 мкМ — 1 мкл Праймер обратный 10 мкМ — 1 мкл Вода деионизированная – 18,8 мкл Taq-полимераза (5 ед./мкл) — 0,2 мкл Образец ДНК (20-40 нг) — 1 мкл Алгоритм программы ПЦР следующий: ^ (30–35 циклов) Быстрая денатурация препарата ДНК. Отжиг праймеров. Элонгация. 3 этап (1 цикл) Длительная элонгация. Охлаждение реакционной смеси. Каждый элемент этапа — денатурация, отжиг, элонгация — имеет индивидуальные температурные и временные характеристики. Параметры температуры и времени протекания этапов для каждого из генов представлены в приложении. Денатурация. В ходе данного элемента полимеразной цепной реакции происходит расщепление двухцепочечной молекулы ДНК на две одноцепочечные. Температурные параметры денатурации находятся в области 90–95 0С, но в случае ДНК-образца с большим содержанием гуанина и цитозина, температура должна быть увеличена до 98 0С. Температура денатурации должна быть достаточной для полной денатурации — расщепления нитей ДНК и избежания “внезапного охлаждения” или быстрого отжига, однако, термостабильная ДНК-полимераза менее устойчива при высоких температурах. Таким образом, подбор оптимальных температурных параметров денатурации для соотношения праймер/образец (препарат ДНК) является важным условием при проведении амплификации. Если температура денатурации на первом этапе выше 95 0С, ряд авторов рекомендует добавлять ДНК-полимеразу в реакционную смесь после первичной денатурации. Время данного элемента этапа в ходе ПЦР должна быть достаточной для полной денатурации ДНК, но в то же время не оказывать существенного влияния, при данной температуре, на стабильность ДНК-полимеразы. Отжиг. Температура отжига (Та) — один из важнейших параметров полимеразной цепной реакции. Температура отжига для каждого конкретного праймера подбирается индивидуально (Rychlik et al., 1990). Она зависит от длины и нуклеотидного состава праймера. Обычно она ниже на 2–4 0C значения Тm (температуры плавления) праймера. Если температура отжига системы ниже оптимальной, то число неспецифичных амплифицированных фрагментов возрастает и, наоборот, более высокая температура уменьшает количество амплифицированных продуктов. При этом концентрация специфичных ампликонов может резко снижаться, вплоть до ингибирования ПЦР. Увеличение времени отжига также приводит к увеличению количества неспецифических ампликонов. Элонгация. Обычно каждый вид термостабильной ДНК-полимеразы имеет индивидуальный температурный оптимум активности. Скорость синтеза ферментом комплементарной нити ДНК также является величиной специфичной для каждой полимеразы (в среднем она составляет 30–60 нуклеотидов в секунду, или 1–2 тыс. оснований в минуту), поэтому время элонгации подбирается в зависимости от типа ДНК-полимеразы и длины амплифицируемого региона. Структура подобранных нами праймеров и программ амплификации для определения генотипов и аллельных вариантов Helicobacter pylori даны в приложении. Время амплификации составляет не более 2-х часов. 3. Электрофорез Разделение нуклеиновых кислот основано на том, что смесь их макромолекул в определенных средах под действием электрического поля делится на ряд фракций в зависимости от размера фрагмента и конформационной структуры (кольцевая форма, линейная и др.). С помощью этой простой техники можно быстро разделить такие смеси фрагментов ДНК, которые не могут быть разделены другими способами, например центрифугированием в градиенте плотности. Следует отметить, что наиболее распространенным методом является гель-электрофорез, т. е. фракционирование в специальных гелевых пластинах или блоках. В качестве поддерживающих носителей наиболее часто применяют агарозу и полиакриламид. Электрофоретическое разделение проводят в вертикальных или горизонтальных электрофоретических камерах. Для агарозных гелей чаще применяются горизонтальные камеры. Для приготовления агарозного геля агарозу растворяют в электрофоретическом буфере (обычно Трис-ЭДТА-Боратный или Трис-ЭДТА-Ацетатный) путем нагревания смеси. Затем горячий раствор заливают в специальную кювету. После полимеризации гель помещается в камеру. С помощью пластмассовых гребенок в геле выдавливают лунки. Далее отсеки камеры наполняют электрофоретическим буфером, так, чтобы слой буфера над гелем составил 5–7 миллиметров. В лунки геля с помощью пипетки вводят образцы, смешанные с буфером для загрузки, камеру плотно закрывают, подсоединяют электроды и подключают к универсальному источнику питания. Напряжение, сила тока и время электрофореза подбирают эмпирически. После электрофоретического фракционирования гель кладут в кювету, где и производят окрашивание. Для флюоресцирующего окрашивания используют раствор этидиумбромида (после окраски гель просматривают под ультрафиолетовым светом). Минимальное количество ДНК, которое можно обнаружить при фотографировании геля, окрашенного бромистым этидием, составляет 2 нг при ширине полосы 0,5 см. Максимальное количество ДНК, которое можно внести в лунку, зависит от числа фрагментов в пробе и их размеров. Если лунка будет переполнена (в полосе указанной ширины будет содержаться более 200 нг ДНК), то полоса окажется расплывчатой, и будет иметь шлейф. Этот дефект особенно выражен при разделении крупных фрагментов. При анализе простого набора молекул ДНК вносят 0,2–0,5 мкг ДНК. Для визуализации полученных результатов используют любую стандартную видеосистему (трансиллюминатор с видеосистемой), для переноса изображения на компьютер используется различное программное обеспечение позволяющее фиксировать полученные фотографические изображения гелей, например можно использовать программу Vitran Photo, Image Master Elite, Quantity One или аналогичные. ^ Применение метода ПЦР требует строгого соблюдения правил в организации работы ПЦР-лаборатории и проведении всех этапов анализа. Отсутствие достаточного опыта использования амплификационных технологий и стереотипы мышления персонала, ранее работавшего в биохимических или бактериологических лабораториях, могут приводить к ошибкам, результатом которых может стать неверное - ложноотрицательное или ложноположительное заключение. С точки зрения получения ложноотрицательного или ложноположительного результата особенно опасны ошибки, контроль которых невозможно осуществить во время проведения ПЦР-анализа. Это, прежде всего, ошибки, связанные с нарушением правил забора, хранения и транспортировки проб. Поскольку, эти процедуры осуществляются вне ПЦР- лаборатории, большое внимание следует уделять обучению медицинского персонала, выполняющего забор проб, так как именно от него во многом зависит качество ПЦР-анализов. Сотрудники ПЦР- лаборатории должны неукоснительно соблюдать санитарные правила в отношении безопасности работы с микроорганизмами 3-4 групп патогенности. Случаи тотальной контаминации выявляются без труда по появлению линии “положительной” ДНК во всех пробах, включая отрицательный контроль. Реагенты, загрязненные “положительной” ДНК, подлежат ликвидации. Повторная реакция ставится с новыми реагентами. Гораздо более сложно выявить случаи контаминации в отдельных пробах. Это можно сделать при проведении выделения ДНК и постановке реакции в 2-х или 3-х параллелях, а также при использовании в каждой постановке отрицательного контроля, проводимого через все стадии пробоподготовки. Эпизодические случаи появления линии “положительной” ДНК в отрицательном контроле свидетельствуют о возможности контаминации и в пробах. ^ Инструкции по применениию «АЛГОРИТМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ И ГЕНОТИПОВ HELICOBACTER PYLORI с использованием полимеразной цепной реакции» В структуре первичной заболеваемости населения нашей республики болезни органов пищеварения составляли в 2005 году 1653,9 случая на 100 тысяч населения и 1623,1 случая в 2006 году. Язвенная болезнь желудка и 12-перстной кишки явилась причиной временной утраты трудоспособности на 100 работающих в 2005 году в 0,71 случае и составила 9,65 дней. Гастриты и дуодениты составили 0,58 случая и 3,94 дня временной нетрудоспособности. Заболеваемость взрослого населения раком желудка составила 23,8% в 1997 году, 21,2% в 2001году и 17,8 в 2006 году процентов случаев. Многочисленными эпидемиологическими исследованиями было показано, что Helicobacter pylori – инфекция является одной из самых распространённых. По данным S. Pimanov и соавт. уровень инфицированности Helicobacter pylori взрослого населения в нашей республике достигает 70-90% [6]. В то же время, несмотря на высокую распространённость Helicobacter pylori, значительное количество инфицированных пациентов не имеет клинических проявлений на момент диагностики. Тем не менее, они входят в группу риска по развитию язвенной болезни и рака желудка. Используя методы ДНК диагностики рядом авторов были изучены различные генотипы Helicobacter pylori ответственного за развитие предраковых состояний и рака желудка, язвы двенадцатиперстной кишки [1]. В геноме Helicobacter pylori имеются гены (vacA, cagA, babA2, IceA J, hp0917, Jhp0918), ассоциированные с повышенной патогенностью микроорганизма [2, 5]. Ген vacA (vacuоlating-associated cytotoxin) присутствует во всех штаммах Helicobacter pylori и кодирует образование вакуолизирующего цитотоксина VacA, который вызывает образование вакуолей и гибель эпителиоцитов. Экспрессия гена vacA, т.е. образование цитотоксина VacA, зависит от s- и m-состава гена: сигнального – s (signal) и срединного– m (middle). Сигнальный s-регион гена включает два подтипа – s1 и s2. В s1 подтипе идентифицированы s1a, s1b и s1c субтипы. Срединный m-регион имеет два аллельных варианта – m1 и m2 [5]. Кроме вакуолизации клеток желудочного эпителия VacA оказывает и другие эффекты: ингибирует секрецию кислоты в желудке, увеличивает секрецию пепсиногена, индуцирует увеличение внеклеточной секреции кислых гидролаз, повреждает расщепляющую способность эндосом и лизосом, ингибирует клеточную пролиферацию, нарушает презентацию антигена, повреждает митохондрии, дезорганизует цитоскелетную архитектуру клеток желудочного эпителия. Генотипы штаммов Helicobacter pylori s1m1 и s1m2 vacA имеют максимальный или средний уровень секреции цитотоксина. Генотип штаммов H.pylori s2m2 проявляет незначительную токсическую активность (T. Cover, 1992; J. Guruge, 1998). Между cagA- и vacAs1- генотипами штаммов Helicobacter pylori существует почти строгая ассоциация - большинство vacAs1- штаммов являются cagA позитивными [3]. Ген cagA, или цитотоксин-ассоциированный ген (cytotoxin associated gene), присутствует не во всех штаммах H. pylori и является маркером островка патогенности PAI (pathogenicity island). Этот островок кодирует образование протеина СagА, который ассоциирован с язвенной болезнью, раком желудка и MALT- лимфомой. Продукты генов, входящих в состав островка патогенности, способны переносить СagA непосредственно в эпителиоциты слизистой оболочки желудка, где он подвергается фосфорилированию. Фосфорилирование СagA внутри эпителиоцитов приводит к изменению их цитоскелета, в результате чего происходят морфологические изменения эпителиоцитов. Гены островка патогенности также принимают участие в модуляции экспрессии генов эпителиальных клеток, кодирующих митоген-активируемые протеинкиназы, ядерный фактор kB (NF-kB) и активирующий белок-1 (АР-1). Отдельные гены cag PAI индуцируют выработку провоспалительных цитокинов в слизистой оболочке желудка [5]. Транскрипция гена интерлейкина 8 (ИЛ-8) эпителиоцитами слизистой оболочки желудка также зависит от экспрессии ряда генов, входящих в состав островка патогенности. Helicobacter pylori. Штаммы Helicobacter pylori с частично или полностью утраченными PAI обладают меньшей способностью вызывать прогрессию болезни, чем штаммы с интактными PAI [4]. Ген babA (blood group associated binding gene) кодирует образование белка BabA (the blood group antigen binding adhesin), который является посредником сцепления между Lewis b антигенами группы крови человека на клетках желудочного эпителия и Helicobacter pylori. In vitro было показано, что Helicobacter pylori специфически связывается с поверхностью клеток слизистой оболочки желудка и регулируется фукосилированными антигенами этой группы. Lewis В эпитоп в эпителиальных клетках желудка функционирует как рецептор для Helicobacter pylori адгезина и запускает процесс прикрепления бактерии к поверхности слизистых клеток желудка и вызывает развитие хронических гастритов и атрофий (R. Falk, 1995; J. Guruge, 1998). Адгезия Helicobacter pylori, как полагают служит для защиты бактерии от кислой среды желудка, а также от ее возможного смещения (перемещения) вследствие его перистальтики (J. Guruge, 1998). Идентифицировано три аллеля гена bab: babA1, babA2 и babB. Функционально активным является babA2 ген, который в ряде стран ассоциирован с язвенной болезнью и раком желудка. BabA индуцирует продукцию интерлейкина IL-8 и его наличие связано с плотностью колонизации. Ген iceA (induced by contact with epithelium ) активируется при контакте с эпителиоцитами слизистой оболочки и существует в двух аллельных формах - iceA1 и iceA2. Предполагается, что iceA1 является маркером язвенной болезни желудка. У больных, инфицированных Helicobacter pylori c генотипом iceA1, инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки желудка полиморфно-ядерными нейтрофилами выше, чем у инфицированных другим генотипом. Aдгезия к эпителиальным клеткам желудка in vitro индуцируется экспрессией IceA1 белка. Имеются данные, указывающие на то, что аллель iceA1 чаще встречается при язвенной болезни, iceA2 – при гастритах. Таким образом, определение факторов патогенности Helicobacter pylori, выделенных от пациентов и создание генотипической карты может быть определяющим фактором в эпидемиологии и лечении Helicobacter pylori - инфекции. ЛИТЕРАТУРА
Приложение ПЦР анализ генов Helicobacter Pylori
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям