Полимеразная цепная реакция в определении активности микоплазменной инфекции урогенитального тракта

Скачать 55.39 Kb. Название Полимеразная цепная реакция в определении активности микоплазменной инфекции урогенитального тракта Дата 07.03.2013 Размер 55.39 Kb. Тип Документы

Содержание Материалы и методы. Результаты и их обсуждение.

Полимеразная цепная реакция в определении активности микоплазменной инфекции урогенитального тракта Бадыгина Н.А., Костюк С.А., Полуян О.С., Силич Т.В. Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск Актуальным остается проблема оценки активности микоплазменной инфекции урогенитального тракта с помощью современных молекулярно-биологических методов. Уреаплазмы и микоплазмы, наиболее часто поражающие урогенитальный тракт человека, могут вызывать негонококковый уретрит, цистит, бартолинит, кольпит, цервицит, сальпингоофорит, эндометрит, спонтанные аборты, преждевременный разрыв плодных оболочек, послеродовую лихорадку [1-5]. Установлено, что количествый уровень микоплазм и уреаплазм определяет формирование воспалительных реакций в урогенитальном тракте [6]. В настоящей момент полимеразная цепная реакция (ПЦР) как одна из самых высокоспецифичных и высокочувствительных методик диагностики инфекций урогенитального тракта заняла прочные позиции в клинической лабораторной практике, причем наиболее распространенным подходом для идентификации амплифицированного фрагмента ДНК возбудителя является агарозный гель-электрофорез, основанный на разделении молекул ДНК по размеру [7]. В данном случае анализ наличия амплифицированной в ПЦР ДНК возбудителя проводится качественно по типу «да – нет». И если положительный результат качественной ПЦР при выявлении облигатных патогенов в достаточной степени однозначен, то при получении положительного ПЦР-анализа при диагностике условно-патогенных Mycoplasma hominis или Ureaplasma urealyticum в первую очередь возникает вопрос о количественном уровне данных возбудителей в урогенитальном тракте. Количественный анализ при проведении ПЦР является более сложным по сравнению с качественной оценкой ПЦР-реакции, так как требует учета количественного результата на экспоненциальной стадии процесса амплификации [8]. Это условие трудно выполнимо при проведении качественной традиционной ПЦР с учетом результата амплификации по «конечной точке» [9]. В настоящее время данные условия могут быть соблюдены при проведении ПЦР в реальном времени [10]. Поэтому целью настоящего исследования было определение активности микоплазменного процесса урогенитального тракта с применением современной методики ПЦР в реальном времени (РТ-ПЦР). ^ Материалы и методы. На первом этапе было проведено качественное определение наличия специфических фрагментов ДНК возбудителей урогенитальных инфекций - Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum и Herpes simplex virus I, II типы в биологическом материале, полученном от 92 женщин с воспалительными процессами урогенитального тракта различной локализации (уретра, цервикальный канал) и 27 женщин группы контроля методом ПЦР, используя диагностические наборы «Амплисенс» (ЦНИИЭ МЗ РФ, Россия). Выделение ДНК из соскобов эпителиальных клеток проводили согласно протоколу набора «ДНК-сорб А» (ЦНИИЭ МЗ РФ). Амплификацию ДНК проводили в многоканальном амплификаторе «Терцик». Детекцию продуктов амплификации ДНК проводили методом электрофореза в 1,5 %-ном агарозном геле, содержащем 1%-ый бромистый этидий. Для определения количественного уровня ДНК гена уреазного комплекса (ureB) Ureaplasma urealyticum и ДНК гена 16sРНК Mycoplasma hominis методом Real-Time PCR (амплификатор «RotorGene», Австралия) использовались диагностические наборы «Амплисенс FRT» (ЦНИИЭ МЗ РФ). Стандартизация исследования проводилась относительно однокопийного гена человека NAGK, который локализован на участке р13.3 короткого плеча хромосомы 2, и кодирует N-ацетилглюкозамин киназу, являющуюся основным компонентом комплекса лизосомальных карбогидратов и конвертирует N-ацетилглюкозамин в N-ацетилглюкозамин-6-фосфат. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query ). Для построения калибровочных кривых использовали разработанные нами калибраторы стандартов с концентрацией ДНК Ureaplasma urealyticum или Mycoplasma hominis 1×107, 1×106, 1×105, 1×104 и 1×103 копий/мл, содержащих ДНК человека в концентрации 10,0, 1,0, 0,1, 0,01 и 0,001 мкг/мл [11]. Для каждой серии исследований калибровочная кривая строилась по 5 точкам в дублях и 2-ух контролей, не содержащих ДНК. ^ Результаты и их обсуждение. Методом ПЦР у женщин с воспалительными процессами урогенитального тракта (n=92) выявлены возбудители инфекций в 81,5 ± 4,04% случаев (n=75), причем наиболее часто выявлены Ureaplasma urealyticum (68,5 ± 4,8 %, n=63) и Trichomonas vaginalis (16,3±3,8%, n=15). ДНК Chlamydia trachomatis обнаружена в 42,4 ± 5,2 % (n=39) случаев, ДНК Mycoplasma hominis – 26,1 ± 4,6% (n=24), Mycoplasma genitalium – 10,9 ± 3,2% (n=10) и Herpes simplex virus I/II типы – 3,3 ± 1,9% (n=3). При проведении ПЦР диагностики возбудителей урогенитального тракта у пациентов группы контроля в 18,5±7,6% (n=5) случаев выявлена ДНК Ureaplasma urealyticum, ДНК Chlamydia trachomatis, в 7,4±5,1% Mycoplasma hominis (n=2) и Trichomonas vaginalis (7,4 ±5,1%, n=2). Сравнение результатов ПЦР – диагностики возбудителей ИППП в основной и контрольных группах установило, что этиологически значимым возбудителем (χ2, Р< 0,05) у женщин с воспалительными процессами является Ureaplasma urealyticum (68,5 ± 4,8 %, n=63) и Chlamydia trachomatis (42,4 ± 5,2 %, n=39). На долю микст-инфекции приходилось 65,33% случаев (n=49). В подавляющем большинстве случаев в соскобах эпителиальных клеток из уретры и цервикального канала была обнаружена смешанная мико-уреаплазменная (38,78%, n=19) и уреаплазменно-хламидийная (30,61%, n=15) инфекция. В результате микроскопического исследования гинекологических мазков в группе пациенток с воспалительными процессами урогенитального тракта (n=92) установлена наибольшая частота (76,09%, n=70) встречаемости III-IV степени чистоты влагалища, что свидетельствует о выраженном нарушении биоценоза влагалища. Клиническое наблюдение за течением различных форм смешанных инфекций установило, что наличие ассоциаций возбудителей приводит к отягощению клинических проявлений инфекций (наличие жалоб, III-IV степень чистоты влагалища, поражения шейки матки), вызывая тем самым более выраженные изменения в тканях и органах и более активное течение воспалительного процесса. Количественное определение ДНК гена уреазного комплекса (ureB) Ureaplasma urealyticum, ДНК гена 16sРНК Mycoplasma hominis и однокопийного гена человека NAGK проводили относительно калибровочных кривых в ДНК - Ureaplasma urealyticum - позитивных пробах (n=63) и/или ДНК - Mycoplasma hominis -позитивных пробах (n=24). В соскобах эпителиальных клеток, содержащих ДНК Ureaplasma urealyticum и/или Mycoplasma hominis (n=88), методом РТ-ПЦР была определена относительная концентрация Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis и ДНК гена человека NAGK. При этом относительная концентрация копий гена ureB Ureaplasma urealyticum и гена 16SРНК Mycoplasma hominis в 1 мл раствора нуклеиновых кислот составила 2,33×105±2,11×104 (n=63) и 2,45×106± 8,34×105 (n=24). Учитывая тот факт, что гены ureB Ureaplasma urealyticum и 16SРНК Mycoplasma hominis однокопийные, можно рассчитать число мико-уреаплазм, приходящихся на 1 эпителиальную клетку. Количество клеток уреаплазмы на 1 клетку человека составило 0,28±0,05, а микоплазмы – 2,34±0,82. Нами установлено увеличение относительной концентрации копий ДНК Ureaplasma urealyticum и/или Mycoplasma hominis (≥ 105 копий/мл) в растворе нуклеиновых кислот при ассоциациях данных возбудителей в сравнении с концентрацией ДНК Ureaplasma urealyticum и/или Mycoplasma hominis при моно-инфекции (U - тест, Р < 0,05), что свидетельствует об усилении патогенных свойств мико-уреаплазм при наличии микст-инфекции урогенитального тракта. В тоже время у пациенток с выявленной моно-микоплазменной инфекцией отмечены минимальные клинические проявления (отсутствие жалоб, II степень чистоты влагалища, отсутствие поражения шейки матки) с уровнем копий ДНК в 1 мл раствора нуклеиновых кислот < 105 или < 0,3 клеток микоплазм, приходящихся на 1 эпителиальную клетку. Проведенные исследования продемонстрировали актуальность определения активности микоплазменной инфекции в урогенитальном тракте с использованием РТ-ПЦР при выявлении ДНК Ureaplasma urealyticum и/или Mycoplasma hominis в моно–состоянии, а также позволяют рекомендовать практическим врачам при наличии смешанной урогенитальной инфекции проводить комплексную клинико-инструментальную оценку выраженности ее клинических проявлений. Литература. Mycoplasma genitalium in males with nongonococcal urethritis: prevalence and clinical efficacy of eradication / D. I Gambini [et al.] // Sex. Transm. Dis. - 2000 - №27.- P. 226-229. Association of Mycoplasma genitalium with nongonococcal urethritis in heterosexual men / P. A.Totten [et al.] // J. Infect. Dis. –2001- N. 183: p. 269-276. Ureaplasma urealyticum, in the development of postpartum endometritis /W. Chaim [et al.] // European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. – 2003. - № 109.- Р.145-148. High-density vaginal Ureaplasma urealyticum colonization as a risk factor for chorioamnionitis and preterm delivery / M. Abele Horn [et al.] // Acta. Obstet. Gynecol. Scand. – 2000. –Vol. 79, № 11. – Р. 973–978. Relationship of bacterial vaginosis and micoplasmas to the risk of spontaneous abortion / G.G. Donders [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2000. – Vol. 183, № 2. – Р. 431–437. Прозоровский, С.В. Медицинская микоплазмология / С.В. Прозоровский, И.В. Раковская, Ю.В. Вульфович; РАМН. – М. : Медицина, 1995. – 288 с. Костюк, С.А. Новые подходы к совершенствованию метода ДНК-диагностики урогенитальных инфекций, обусловленных Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum / С.А. Костюк // Медицина. –2003. – № 4. – С. 40–43. Момыналиев, К.Т. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе. Часть 1 (лекция) / К.Т. Момыналиев, В.М.Говорун // Клиническая лабораторная диагностика. – 2000. – №4. С. 25–32. Определение количеств ДНК уреаплазм с помощью конкурентной и мультиплексной ПЦР / В.А. Рар [и др.] // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2003. – №3. – С. 22–25. Kim, D.W. Real-time quantitative PCR / D.W. Kim // Exp. Mol.Med. – 2001. – Vol. 31, № 1. – P.101–109. Бадыгина. Н.А. Определение относительной концентрации микоуреаплазм методом полимеразной цепной реакции в реальном времени / Н.А. Бадыгина, С.А. Костюк // Медицинские новости. – 2006. – № 10 (136). – С. 106–110.

---

Ваша оценка:

Похожие:

	Слогоцкая людмила Владимировна эффективность кожного теста с аллергеном туберкулёзным, содержащим		Методические рекомендации исследования дисбиотических состояний урогенитального тракта у женщин (фемофлор Исследования дисбиотических состояний урогенитального тракта у женщин (фемофлор®)
	Полиоксидоний в комплексной терапии рецидивирующих инфекций урогенитального тракта		Лечение микоплазменной инфекции у беременных с использованием кларитромицина
	Тактика терапии манифестных форм пви урогенитального тракта и аногенитальной области у женщин		[I-072] влияние хламидийной и микоплазменной инфекции на развитие неблагоприятных исходов беременности
	Клинико-иммунологическая характеристика и совершенствование терапии урогенитальной микоплазменной		«Сравнительная эффективность методов идентификации возбудителей заболеваний урогенитального тракта
	Αλλεργία реакция на чужое реакция иммунной системы организма на обычно безвредные вещества. Эта реакция		Папилломавирусная инфекция урогенитального тракта женщин: эпидемиология, факторы персистенции, оптимизация

Разместите кнопку на своём сайте:
Медицина

---